Questo protocollo è significativo per la semplicità della piattaforma di sensori TGT utilizzata per studiare la diafonia EGFR-integrina e la sua influenza sulle forze meccaniche delle cellule. Rao ha delineato per studiare la regolazione EGF-dipendente della meccanica cellulare. Il protocollo è adattabile a diversi ligandi, tipi di cellule, paradigmi di stimolazione e può essere accoppiato con TGT di soglie di tensione variabili.
La sintesi superficiale può sembrare intimidatoria all'inizio. La chiave è essere preparati e organizzati per eseguire con precisione gli intricati passaggi utilizzando una lista di controllo per la preparazione e i calcoli dei reagenti. Il primo giorno, posizionare fino a otto coperchi di vetro da 25 millimetri in un rack di politetrafluoroetilene.
Posizionare il rack in un becher borosilicato da 50 millilitri contenente 40 millilitri di etanolo a prova di 200. Sonicare a una frequenza operativa di 35 kilohertz per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Riempire un becher da 50 millilitri con 40 millilitri di soluzione di piranha appena preparata mescolando acido solforico e perossido di idrogeno in un rapporto 3: 1 in un becher Pyrex e mescolando con una pipetta di vetro.
Trasferire il coperchio nel becher e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente nella cappa aspirante per incidere la superficie di scorrimento del coperchio. Dopo l'incisione, trasferire il portapacchi di copertura in un becher con acqua ultrapura con una pinzetta. Ispezionare visivamente gli slip di copertura per assicurarsi che le superfici appaiano pulite senza motivi o particelle di polvere sulla superficie del vetro.
Trasferire il portapacchi di copertura in un becher con etanolo a prova di 200 e lavare due volte per 15 secondi per equilibrare le superfici al solvente organico. Trasferire il rack di scorrimento del coperchio in una soluzione di etanolo a prova di 200 con 3% APTES per un'ora a temperatura ambiente per silanizzare gli slip del coperchio. Immergere il rack in un becher pulito con una soluzione di etanolo a prova di 200.
Asciugare il coperchio scivola utilizzando gas azoto con bassa pressione di uscita. Posizionare il coperchio scivola in un piatto di polistirolo di 10 centimetri con un pezzo di pellicola parrafin posata piatta al suo interno. Aggiungere 100 microlitri di due milligrammi per millilitro di soluzione di NHS-biotina in DMSO a quattro scivoli di copertura posti sul film di paraffina.
Impostare un sandwich con gli altri quattro slip di copertura in cima, con due scivoli di copertura rivolti l'uno verso l'altro con la soluzione di funzionalizzazione in mezzo. Il secondo giorno, rimuovere il piatto da quattro gradi Celsius e separare gli slip di copertura inseriti. Evitare di graffiare o danneggiare la superficie funzionalizzata durante la separazione del sandwich.
Quindi, orientare il coperchio scivola nel rack con la superficie rivestita l'una di fronte all'altra. Asciugare con azoto gassoso. Posizionare le scivolate di copertura in un nuovo piatto con una pellicola parrafin al suo interno.
Aggiungere 800 microlitri di albumina sierica bovina allo 0,1% in 1X PBS a ciascuna slitta di copertura. Incubare il coperchio scivola a temperatura ambiente per 30 minuti per passivizzare la superficie e bloccare il legame non specifico dei successivi reagenti di funzionalizzazione. Per funzionalizzare gli scivoli di copertura, aggiungere 800 microlitri di un microgrammo per millilitro di streptavidina in 1X PBS a temperatura ambiente per 45-60 minuti.
Assemblare le sonde TGT in un tubo PCR utilizzando un termociclatore. Dopo l'incubazione, lavare il coperchio scivola tre volte con 1X PBS. Aggiungere 100 microlitri delle sonde TGT preassemblate a quattro slittamenti di copertura e creare sandwich utilizzando i restanti quattro scivoli di copertura con il lato funzionalizzato rivolto verso le sonde.
Coprire con foglio di alluminio. Dopo l'incubazione, separare i panini e lavare i coperchi scivola con 1X PBS tre volte. Assemblare con cura il coperchio scivola in camere di imaging pre-pulite.
Per studiare l'effetto della stimolazione del fattore di crescita epidermico sulla meccanica Cos-7, l'adesione e la diffusione cellulare, tripsinizzare le cellule Cos-7 con lo 0,05% di tripsina-EDTA per due minuti. Neutralizzare la tripsina lavando con HBSS e centrifugando a 800 G per cinque minuti. Cellule a piastre ad una densità di 40.000 cellule sulle superfici TGT assemblate in DMEM integrate con 50 nanogrammi per millilitro EGF o DMEM senza EGF.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con 1X PBS. Fissare con due millilitri di paraformaldeide al 4% per 12 minuti a temperatura ambiente. Lavare il coperchio scivola cinque volte con 1X PBS a intervalli di cinque minuti a temperatura ambiente.
Facoltativamente, incubare il coperchio scivola con cloruro di ammonio 50 millimolare in 1X PBS per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere il tampone A e posizionare le camere di imaging con gli slip di copertura in un contenitore di umidità. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per bloccare e permeabilizzare le cellule.
Diluire l'anticorpo anti-paxillina primario a 1:250 diluizioni nel tampone bloccante. Incubare con 200 microlitri di soluzione anticorpale primaria per slittamento di copertura per due ore a 37 gradi Celsius. Etichettare le cellule contemporaneamente con una miscela di anticorpi secondari di capra/anti-coniglio digiunti a 1:800 diluizione e falloidina digiunata a 1:400 diluizioni in 200 microlitri di tampone bloccante per slittamento di copertura.
Lavare le superfici cinque volte con 1X PBS a intervalli di cinque minuti. Per iniziare, aggiungere olio all'obiettivo, pulire il fondo di scorrimento del coperchio della camera del campione e posizionare il campione sul palco. Concentrati su una cellula e attiva la messa a fuoco perfetta.
Allineare il RICM chiudendo e centrando il diaframma dell'apertura dell'epi-illuminazione. Focalizza il laser a 488 nanometri in un piccolo punto sul soffitto della stanza e aumenta l'angolo di incidenza fino a superare l'angolo critico, monitorando la fluorescenza sulla telecamera in modalità live. Osservare una forte riduzione della fluorescenza di fondo e un singolo piano di messa a fuoco quando l'angolo critico viene superato.
Identificare le celle per l'imaging utilizzando la modalità live della fotocamera utilizzando RICM. Acquisire le immagini RICM e TIRF di actina a eccitazione a 488 nanometri, tensione di integrina a eccitazione a 561 nanometri e paxillina a eccitazione a 647 nanometri. Ottenere immagini in sequenza utilizzando un tempo di esposizione di 200 millisecondi.
Cambia le scivolate di copertura, metti a fuoco e ripeti. Le cellule Cos-7 sono state placcate su questa superficie TGT con o senza stimolazione EGF per studiare l'impatto dell'attivazione dell'EGFR con la stimolazione del ligando sulla meccanica dell'integrina. Se un'integrina lega il ligando e applica una forza maggiore della soglia di tensione totale della sonda, il duplex del DNA si separerà, portando alla fluorescenza.
Qualsiasi sonda TGT che una forza meccanica non si è rotta rimarrà non fluorescente. Le cellule sono state incubate con o senza EGF sulle superfici TGT per 60 minuti, fissate e immunocolorate per mostrare la distribuzione dell'adesione focale e l'organizzazione del citoscheletro. Nell'immagine RICM, la diffusione delle cellule Cos-7 sulla superficie TGT a 56 piconewton è stata significativamente migliorata con la stimolazione EGF rispetto a quella senza stimolazione.
La stimolazione con EGF ha portato a una morfologia più circolare, che rappresenta la diffusione e la crescita delle cellule Cos-7. La fluorescenza delle sonde aperte è anche più alta con la stimolazione EGF, come osservato nell'immagine di fluorescenza di tensione. L'intensità integrata delle sonde aperte proporzionale al numero di sonde aperte era molto più elevata con la stimolazione EGF che senza stimolazione.
Ricorda sempre l'orientamento delle scivolate di copertura, mantenendo la superficie funzionalizzata rivolta verso l'alto. Quando si separa il sandwich, essere delicati in modo che la superficie non sia graffiata o danneggiata. Dopo la sintesi superficiale, si possono sondare le proteine citoplasmatiche che regolano l'adesione cellulare o la trasduzione meccanica.
Ciò consente l'identificazione di molecole di segnalazione a valle coinvolte nell'orchestrazione della meccanica cellulare sulla membrana plasmatica.
