Siamo grati a Leonie de Boer e Bas Zaat (Academic Medical Centre) per la fornitura di noi con la S. ceppo epidermidis O-47. Ringraziamo Rico Bongaarts, Francesco Smet e Angela Comas (Unione Biometrica) per assistenza e consulenza con il COPAS XL e l&#39;analisi BioImager VAST. Ringraziamo Davy de Witt, Ulrike Nehrdich, e Laura van Hulst, alla custodia pescare ed altri colleghi di Università di Leiden per utili discussioni. Questa ricerca fa parte del progetto P5.03 IBIZA del programma di ricerca di materiali biomedici istituto, co-finanziato dal Ministero olandese degli Affari economici, e del Programma Mix di Smart (NWOA_6QY9BM) del Ministero olandese degli Affari economici e del Il Ministero dell&#39;Istruzione, della Cultura e della Scienza olandese. Ulteriore supporto è stato ottenuto dal progetto EU ZF-Health (FP7-Health-2009-242048), e RMJ è stato supportato da Marie Curie fellowship come ricercatore esperto nella UE Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289.209). SJR ricevuto finanziamenti dalla iniziativa sui medicinali innovativi impresa comune in convenzione di sovvenzione n ° 115337, le risorse di cui sono composte contributo finanziario dal Settimo Programma dell&#39;Unione Europea Quadro (FP7/2007-2013) e le società dell&#39;EFPIA in autori contribution.The gentili ulteriormente riconoscere il sostegno finanziario del Fondo dell&#39;Università di Leiden (LUF) per la robotica e da Cyttron, nel programma di sovvenzioni Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, che a sua volta è sostenuta finanziariamente dalla Organizzazione olandese per la ricerca scientifica per le strutture di imaging. L&#39;acquisizione del sistema COPAS è stato in parte sostenuto dalla Divisione di Scienze della Terra e della Vita (ALW) con l&#39;aiuto finanziario della Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO, 834.10.004).

1. Batterici Ceppi e condizioni di crescita <ol><li> Preparare S. epidermidis inoculo <ol><li> Prendere diverse colonie da S. ceppo epidermidis O-47, contenente un derivato pWVW189 mCherry vettore di espressione (De Boer L. inedito) da un Luria Bertani (LB) agar addizionato con 10 pg / ml di cloramfenicolo e cultura notte a 37 ° C in 25 ml di terreno LB supplementato con 10 mg / ml di cloramfenicolo per midlog palco. </li><li> Centrifugare 1 ml della coltura a 12,000 xg per 1 minuto e successivamente lavarli 3x con 1 ml sterile tampone fosfato salino (PBS) con 0,3% (v / v) Tween-80. </li><li> Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 600), e diluire la sospensione batterica per un OD 600 di 0,3 a 2% (w / v) polivinilpirrolidone 40 (PVP 40) in PBS. Nota: Un OD 600 di 0,3 corrisponde a 1,0 x 10 8 unità formanti colonia / ml (cfu / ml). </li></ol&gt; </li><li> Preparare M. marinum inoculo <ol><li> Prendere diverse colonie di M. marinum ceppo M o E11 contenente il vettore pSMT3-mCherry esprimono stabilmente mCherry 10 da una piastra di agar Middlebrook 7H10 con il 10% (v / v) Middlebrook OADC supplementato con 50 mg / mL igromicina e coltura durante la notte a 28 ° C in 10 ml di Middlebrook 7H9 brodo con 10% (v / v) Middlebrook ADC arricchimento supplementato con 50 ug / ml igromicina. </li><li> Centrifugare 1 ml della coltura a 12,000 xg per 1 minuto e successivamente lavarlo 3 volte con 1 ml di PBS sterile con 0,3% (v / v) Tween-80. </li><li> Misurare il diametro esterno 600, e diluire la sospensione batterica per un OD 600 di 0,3 a 2% (w / v) in PBS pvp 40. Nota: Un OD 600 di 1 corrisponde a 1,0 x 10 8 UFC / ml. </li></ol></li></ol> 2. Preparare Zebrafish uova <ol><li> Posizionare un massimo di 70 maschi e 50 femmine ty selvaggiope zebrafish separatamente nel grande vaso di allevamento. Nota: posiziona il pesce femmina nella parte inferiore del vaso grande allevamento. </li><li> Rimuovere il separatore il giorno successivo in mattinata, per consentire al zebrafish inizio di allevamento. </li><li> Raccogliere le uova sul fondo del vaso grande allevamento attraverso il collettore uovo in un tubo da 50 ml riempito con acqua uovo (60 mg / ml istante oceano sale marino). </li></ol> 3. Aghi per iniezione <ol><li> Ottenere disponibili in commercio custom made aghi di capillari di vetro con un diametro interno di 10 micron. </li></ol> 4. Schema sperimentale di iniezione <ol><li> Far bollire 100 ml di 1% (w / v) di agarosio in acqua uovo e fresco fino a circa 40 ° C. Versare agarosio nella piastra microiniettori automatizzata e mettere il timbro 1.024-bene nella agarosio. Nota: Il piatto è pronto da usare quando raffreddato. </li><li> Sul microinjector automatico di funzionamento del software clicca su &#39;Calibra palco&#39;,quindi fare clic su griglia ben &#39;1024 &#39;e posizionare la piastra di agarosio in microinjector e calibrare la piastra facendo clic sullo schermo nella posizione centrale del bene. </li><li> Vai al menu &#39;ago&#39; e cliccare su &#39;titolare calibrare aghi&#39;. </li><li> Riempire l&#39;ago di iniezione con una punta microloader con 10 microlitri pvp 40 contenente 100 ufc / nl S. epidermidis o 30 ufc / nl M. marinum, o l&#39;uso pvp 40 come l&#39;iniezione di simulazione. </li><li> Posizionare l&#39;ago nel micro-iniettore automatizzato e calibrare il x, y posizione abbassando o spostando l&#39;ago e cliccando sullo schermo nella posizione dell&#39;ago. Poi calibrare la posizione z dell&#39;ago facendo clic sullo schermo la posizione della punta dell&#39;ago. </li><li> Distribuire le uova sopra la griglia di agarosio utilizzando una pipetta di plastica, e rimuovere l&#39;acqua in eccesso uovo. Posizionare la griglia agarosio nel microinjector automatizzato. </li><li> Vai alla &#39;injectioMenu n &#39;e regolare la&#39; pressione di iniezione &#39;impostazione a 200 hPa, il&#39; tempo di iniezione &#39;0,2 sec e&#39; la pressione Compensation &#39;15 hPa, che è correlato con 1 nl, nel menu delle impostazioni FemtoJet. </li><li> Fare clic su &#39;Iniettare all&#39; iniettare l&#39;intera piastra. </li><li> Raccogliere le uova dopo iniezione lavandoli in una piastra di Petri (92 x 16 mm), con un massimo di 70 embrioni per piastra di Petri e incubare a 28 ° C. </li></ol> 5. Analisi Flow-citometro <ol><li> Preparare il grande flusso di particelle citometro secondo le istruzioni del produttore e riempire la coppa campione e il contenitore del liquido guaina con acqua uovo. </li><li> Al software operativo, andare al menu &#39;PMT&#39; e utilizzare le seguenti impostazioni: 650 V per il canale &#39;Red&#39; e 0 V per il &#39;Green&#39; e canali di &#39;gialli&#39;. Poi vai al menu &#39;soglie&#39; e utilizzare le seguenti impostazioni: &#39;OpticaDensità l &#39;segnale di soglia: 975 mV (valore COPAS XL: 50) e il&#39; Time Of Flight &#39;(TOF) minimo 320 msec (valore COPAS XL: 800), al fine di ridurre l&#39;influenza di detriti. </li><li> Per l&#39;analisi, senza classificare gli embrioni passare al punto 5.4, per l&#39;analisi e l&#39;ordinamento gli embrioni in una capsula di Petri passare al punto 5.5 o per l&#39;analisi e l&#39;ordinamento gli embrioni in una piastra a 96 pozzetti passare al punto 5.6. </li><li> Mettere gli embrioni in coppa campioni e fare clic su &#39;Start&#39; per avviare l&#39;analisi. Quando tutti gli embrioni vengono analizzati interrompere l&#39;analisi cliccando su &#39;stop&#39;. Salvare i dati cliccando su &#39;negozio tutto&#39;. Nota: Tutti i dati vengono memorizzati come TXT, LMD, DAT, CSV e file BSRT. Seguire il protocollo nella fase 5.7. </li><li> Mettere gli embrioni in coppa campioni e definire al massimo di 70 embrioni per piastra di essere risolto inserendo 70 nel menu &#39;Ordina&#39;. Porre un piatto di Petri vuota sotto il sorter e clicca su &#39;ordine manuale&#39;. Quando il Petri di<html> sh è riempito, salvare i dati cliccando su &#39;negozio tutto&#39;. Nota: Tutti i dati vengono memorizzati come TXT, LMD, DAT, CSV e file BSRT. Seguire il protocollo nella fase 5.7. </li><li> Mettere gli embrioni in coppa campioni e definire al massimo di 1 embrione per pozzetto di essere risolto inserendo 1 nel menu &#39;Ordina&#39;. Posizionare una piastra a 96 pozzetti vuoto nel supporto targa sinistra e clicca su &#39;Riempi piatto&#39;. Quando la piastra a 96 pozzetti è riempito, salvare i dati cliccando su &#39;negozio tutto&#39;. Nota: Tutti i dati vengono memorizzati come TXT, LMD, DAT, CSV e file BSRT. Seguire il protocollo nella fase 5.7. </li><li> Prendi il file TXT per elaborare i dati grezzi, utilizzare le seguenti impostazioni del filtro di dati: &#39;Stato prescelto&#39;: 40, e se si utilizza il modulo tipo &#39;stato sort&#39;:. 6 Quindi utilizzare i numeri dal segnale totale di fluorescenza dalla &#39;Red &#39;canale per calcolare la media e l&#39;errore standard della media. Tracciare questi insiemi di dati in bar o dispersione grafici. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. trattamento farmacologico <ol><li> Analizzare e ordina a 3 giorni dopo l&#39;iniezione (dpi), M. marinum embrioni infetti in due gruppi uguali usando il flusso di particelle di grandi citometro (punto 5.5). Trattare un gruppo con un composto di interesse nel suo solvente portante ed altro con carrier solo solvente (controllo). Applicare trattamenti simili per deridere il controllo iniettato a prova di effetti collaterali antibiotici. </li><li> Ripetere a 4 e 5 dpi l&#39;analisi (punto 5.5) e aggiornare l&#39;acqua uova o acqua uovo contenente il composto. </li></ol> 7. High Resolution Imaging <ol><li> Anestetizzare gli embrioni con 0,02% (w / v) tamponata 3-aminobenzoico di etile (Tricaine) in acqua uovo 10 minuti prima dell&#39;analisi. </li><li> Preparare il sistema di Screening tecnologia Vertebrati automatizzato ed il campionatore di particelle Large secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Selezionare le immagini di riferimento corrispondenti all&#39;età degli embrioni dal &#39;Imaging - Object211; Menu Setup Detection &#39;. </li><li> Selezionare la quantità di immagini e di orientamento da effettuare da parte del sistema di Screening tecnologia Vertebrati automatizzato dal &#39;Imaging - Negozio di Auto immagini&#39; menu. </li><li> Posizionare una piastra a 96 pozzetti pieni di embrioni (dal punto 5.6) nel portatarga sinistra del Grande Particle Sampler, e cliccare su &#39;piatto Run&#39;. </li><li> Quando viene rilevato un embrione e correttamente posizionata; immagine della testa e la coda separatamente con il CLSM usando un obiettivo 10X pianura asciutta e poi unire le immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini. </li></ol>

<ol>
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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS è proprietario di Life Science metodi BV che produce strumenti utilizzati in questo articolo.

La metodologia elevato throughput descritto in questo documento fornisce un facile e costo conduttura efficace per schermare elevato numero di embrioni e larve di pesce con diversi tipi di infezioni. Utilizzando il grande vaso allevamento invece di tradizionali serbatoi singoli o familiari riproduttori facilitato il controllo del processo di deposizione e la generazione di un maggior numero di uova sincroni. Con una versione migliorata del sistema micro-iniezione automatica 7, è possibile iniettare fino a 2.500 uova quasi tutti nella stessa fase cella entro 1 ora. Con questi aggiornamenti e miglioramenti software è fattibile iniettare più uova rispetto al passato è stato possibile che possono essere utilizzati per eseguire droga schermi di grandi dimensioni con la proliferazione batterica come lettura. Tuttavia questo metodo è ancora limitata a tuorlo iniezione, altre vie di iniezione per esempio descritti da Benard et al. (2012) 6, si spera essere incorporato nel sistema di micro-iniezione automatizzata nel prossimo futuro. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Sebbene questi metodi sono raffrontati per lo screening zebrafish, sarebbe utile per applicazioni con altre specie di pesce. Ad esempio, la carpa comune è stato indicato per avere vantaggi per gli schermi di droga. Come zebrafish, ovuli ed embrioni della fase iniziale di carpa comune sono trasparenti, ma con il vantaggio principale delle sue grandi dimensioni escursione di centinaia di migliaia di uova e la disponibilità di linee pure, che offrono un background genetico più costante 16. L&#39;analisi di grandi quantità di embrioni infetti è fatto con l&#39;alta velocità grande flusso di particelle citometro. Questo dispositivo può sorta analizzato gli embrioni in pozzetti multipli o un piatto di Petri che lo rende particolarmente adatto per testare un gran numero di composti. Se è necessaria una risoluzione di immagini superiore, rispetto alla configurazione è adattato in modo che il grande flusso di particelle citometro tecnologia può essere utilizzata per il pre-screening e successivamente analizzare i campioni a un mezzo attraversomettere a risoluzione più elevata. Questo può essere fatto utilizzando la tecnologia di screening dei vertebrati Automated 17, 18. Questo dispositivo può raccogliere automaticamente embrioni vivi o fissi tra 2 e 7 giorni dopo la fecondazione di un piatto più bene o un contenitore di massa, l&#39;immagine a 360 ° attraverso una capillare utilizzando CLSM o microscopio stereo e gettare di nuovo in 2 contenitori di grandi dimensioni che consentono cernita manuale degli embrioni sulla base sulle immagini microscopiche. Miglioramenti futuri consentiranno l&#39;ordinamento dell&#39;embrione dopo l&#39;imaging nella piastra ben più, rendendo quindi possibile proiettare automaticamente gran numero di singoli embrioni nel tempo con CLSM. Supponendo che in applicazioni future sistema di vaglio Tecnologia Vertebrate automatizzato può anche essere collegato alla grande flusso di particelle citometro tecnologia senza necessità di preventiva larve erogazione in piastre multiple così, porterà ad un ordinamento più avanzato. Questo articolo descrive l&#39;uno stabilimentod ottimizzazione di una configurazione high throughput studiare S. epidermidis e M. infezione marinum come modello per la scoperta della droga. Ciò dimostra che l&#39;esito di questi batteri iniettati nel tuorlo dipende dallo stadio di sviluppo delle uova al momento dell&#39;iniezione. Iniezione M. marinum E11 a 16-128 fase cella o il ceppo M at 16-64 stadio di cellula porta lo stesso modello di infezione come iniezione nella vena caudale 2, 6. Tuttavia questa configurazione non è limitata alla proliferazione di soli batteri patogeni. E &#39;stato dimostrato prima che sia possibile iniettare robotically soluzioni contenenti DNA, RNA o Morpholinos per transgenesi, sovraespressione e gene knock-down studi, rispettivamente 13. Inoltre, è stato dimostrato che questa configurazione è utile anche per lo studio della proliferazione delle cellule tumorali e la migrazione. Pertanto questa pipeline presenta un metodo versatile per schermi ad alta produttività di una varietà di meccanismi di segnale nel contestodell&#39;immunità innata, applicata alle malattie infettive e lo sviluppo del cancro. Questi schermi possono essere combinati tra loro per la scoperta di farmaci, ma anche con l&#39;analisi dei possibili effetti tossici dei farmaci applicabili identificati.

Ad oggi il pesce zebra (Danio rerio) è stato istituito con successo come un modello efficiente per studiare una varietà di malattie infettive 1. L&#39;embrione zebrafish offre unica possibilità di imaging in vivo per la loro trasparenza e il gran numero di linee transgeniche giornalista esistenti che esprimono proteine ​​fluorescenti. Questa potente combinazione permette di monitorare diversi tipi di cellule immunitarie nel tempo interagendo con agenti patogeni come Mycobacterium marinum, il parente più vicino di M. tubercolosi 2, o Staphylococcus epidermidis, il causativo principale di biomateriale associata infezione 3-5. Diverse vie di infezione possono essere utilizzati in embrioni di zebrafish seconda fini dello studio 6. Una di queste vie di infezione è l&#39;iniezione tuorlo dei batteri. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto agli altri è che tuorlo infection può essere eseguita automaticamente mediante iniezione robotica, riducendo notevolmente il tempo di iniezione e consentendo un&#39;alta riproducibilità dell&#39;infezione 7, 8. Lavoro precedente, usando l&#39;zebrafish come un alto rendimento nel sistema modello per lo studio in vivo di S. epidermidis e M. infezione marinum ha mostrato di avere successo 7, 8. Questo sistema è in grado di schermare per la progressione della malattia mediante iniezione tuorlo robotico di embrioni precoci e utilizzando fluorescenza lettura come misura per la carica batterica. In accordo con questa nozione, questa configurazione è stato ottimizzato e stabilito un altamente efficiente conduttura ad alta velocità con il potenziale per generare un gran numero di embrioni omogeneo infetti e monitorare la progressione dell&#39;infezione durante il tempo dopo il trattamento con un numero di composti. Con la configurazione stabilita è possibile generare fino a 8.000 embrioni sincroni per schermaredi progressione della malattia, l&#39;elaborazione in questo modo fino a 2.500 embrioni all&#39;ora. Gli embrioni vengono ordinati in base alla loro carica batterica utilizzando un sistema automatizzato, garantendo gruppi omogenei di larve infetti. Inoltre, per convalidare l&#39;installazione, effetti di riferimento noti per prevenire la progressione della tubercolosi nei mammiferi sono stati testati sugli embrioni infetti con M. ceppo marinum E11 o il ceppo più virulento M 9. Questo studio descrive in dettaglio la conduttura alta velocità che è stata stabilita per essere in grado di generare un gran numero di embrioni infetti e la successiva analisi della progressione batterica durante lo sviluppo e dopo il trattamento composto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

Zebrafish stanno diventando uno strumento prezioso nella fase preclinica di proiezioni di scoperta della droga come un modello animale intero, con throughput elevato possibilità di screening. Essi possono essere utilizzati per colmare il divario tra test cellulari in fasi precedenti e in validazione vivo in modelli di mammifero, riducendo, in tal modo, il numero di composti di passaggio a esperimenti su modelli più costosi roditori. In questa luce, nel presente manoscritto è descritto un nuovo gasdotto ad alta velocità utilizzando zebrafish in vivo come sistema modello per lo studio di Staphylococcus epidermidis e infezioni marinum Mycobacterium. Questa configurazione consente la generazione e l&#39;analisi di un gran numero di embrioni sincroni omogeneamente infetti. Inoltre la flessibilità della pipeline permette di implementare facilmente altre piattaforme per migliorare la risoluzione dell&#39;analisi quando necessario. La combinazione di zebrafish insieme con l&#39;innovativa ad alta velocità TEnologie apre il campo di prova della droga e la scoperta di nuove possibilità non solo a causa della forza di utilizzare un modello animale intero ma anche a causa del gran numero di linee transgeniche disponibili che possono essere utilizzati per decifrare il meccanismo di azione di nuovi composti.

Questi risultati mostrano che l&#39;alta velocità conduttura per studiare S. epidermidis e M. infezione marinum è stato stabilito con successo e che potrà essere estesa ad altri modelli di infezione. In primo luogo, l&#39;uso della grande nave allevamento (Figura 1A), basato sul sistema pubblicato da Adatto et al. (2011) 11, consente di generare un gran numero di uova sincroni in singoli eventi che consentono un elevato controllo del processo di deposizione. Accanto a poter iniettare gran numero di embrioni in un breve periodo di tempo, una versione migliorata del sistema micro-iniezione precedentemente sviluppato automatizzata 7 è stato usato (Figura 1A). Per valutare quale è la migliore fase di sviluppo per l&#39;infezione tuorlo, iniezioni con S. epidermidis e M. marinum sono stati effettuati in tutte le diverse fasi tra 1 e 512 fase cella, secondo la descrizione fatta da Kimmel et al. (1995) 12 </sup&gt;. Iniezioni con 100 cfu S. epidermidis tra lo stadio 16 e 128 cellule fornito il miglior modello di infezione (Figura 2). I batteri proliferavano all&#39;interno del tuorlo per 3 giorni e si diffondono nel corpo da 3 in poi dpi. Esecuzione di iniezioni prima della fase 16 cellule che hanno portato a elevata mortalità da 4 dpi, e dopo la fase di iniezione cella 256 mostra una crescita principalmente batterica all&#39;interno del tuorlo con quasi tutti i batteri diffondono all&#39;interno del corpo dell&#39;embrione. Quantificazione di carica batterica è stata effettuata mediante analisi di fluorescenza utilizzando il flusso di particelle di grandi citometro come descritto da Veneman et al. (2013) 8 (Figura 3). Le osservazioni hanno mostrato che la fase di sviluppo ottimale per l&#39;iniezione di 30 cfu M. iniezione marinum è compresa tra 16-128 fase cella per il ceppo E11 (Figura 4A) e tra 16-64 palco cella con il M strai più virulenton (Figura 4B). Embrioni iniettati in queste fasi hanno mostrato crescita batterica all&#39;interno del tuorlo e la diffusione dei batteri attraverso l&#39;embrione (Figura 7). L&#39;infezione con entrambi i ceppi in fasi precedenti ha presentato la crescita batterica generalizzata non specifica che porta gli embrioni a morire dopo 4 dpi. D&#39;altra parte, in embrioni iniettati in fasi successive carica batterica è stata limitata al tuorlo. Avanti, presorting con ampio particelle citofluorimetro (Figura 1B) generato grandi gruppi omogenei di pesci infetti escluso embrioni non o altamente infetti (Figure 5A e 6A). Dopo presorting, M. marinum embrioni infetti sono stati trattati con Rifampicina, un farmaco di prima linea antitubercolari. Studi precedenti hanno dimostrato che il trattamento con rifampicina alla dose di 200 pM riduce efficacemente M. infezione marinum in zebrafish 7, 13. Prendendo advantage del gran numero di embrioni omogeneamente infettati generati con l&#39;alta velocità di installazione, il trattamento con diverse dosi stata eseguita. Embrioni infettate con M. marinum M ceppo e trattate per 48 ore con 12, 24, e 200 pM rifampicina hanno mostrato di ridurre efficacemente l&#39;infezione da micobatteri in modo dose-dipendente (Figura 5B). In vista della riduzione efficiente dell&#39;infezione utilizzando Rifampicina alla dose di 200 pM questa concentrazione è stato usato per gli esperimenti futuri. In linea con il risultato precedente, studiare la progressione della carica batterica utilizzando M. ceppo marinum E11 una significativa riduzione 24 ore e poi dopo trattamento con 200 pM rifampicina è stato osservato (Figura 6B). Inoltre, se l&#39;imaging alto ingrandimento è richiesto di questi embrioni, essi possono essere visualizzati automaticamente in piastre da 96 pozzetti (Figura 1C), in cui i campioni possono essere analizzati utilizzandoil sistema di Screening tecnologia Vertebrati automatizzato con il Large Particle Sampler montato su un CLSM. Il sistema di Screening tecnologia Vertebrati automatizzato con il campionatore di particelle Large è un sistema che può essere montato su un CLSM o microscopio stereo. Questo dispositivo consente il caricamento di embrioni vivi o fissi da una piastra a 96 pozzetti o contenitore bulk automaticamente attraverso un capillare di vetro, e la orienta di fronte alla telecamera con l&#39;inclinazione desiderata (ad esempio, dorsale o laterale). Immagini dell&#39;embrione in tutti gli orientamenti possono essere effettuate con la telecamera a bordo o con un CLSM esterno (Figura 7). Gli embrioni saranno successivamente trasferiti nel contenitore di raccolta o di rifiuti. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Figura 1. Mainstream outl sperimentaleine. A) I pesci adulti sono messi insieme per accoppiarsi, le uova vengono raccolte, allineati in una piastra di agarosio e iniettato. B) Le uova iniettate sono incubate a 28 ° C e saranno pre-ordinati per possibile trattamento farmacologico. C) Analisi seguenti da grandi flusso di particelle citometro e / o Grande Particle Sampler / Vertebrate Automated Screening di tecnologia con CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> Figura 2. Istituzione del miglior palcoscenico cellulare per S. epidermidis tuorlo d&#39;iniezione. embrioni di zebrafish sono stati iniettati nel tuorlo a diversi stadi di sviluppo 1-512 palco cella con 100 cfu di S. epidermidis. Embrioni iniettati tra 1 and 8 stadio di cellule ha mostrato una crescita batterica nel tuorlo e l&#39;alta mortalità da 4 dpi. Embrioni iniettati tra i 16 ei 128 stadio di cellule hanno mostrato una crescita batterica nel tuorlo e all&#39;interno del corpo a partire da 3 dpi. Embrioni iniettati tra lo stadio 256 e 512 cellule hanno mostrato molti crescita batterica all&#39;interno del tuorlo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> Figura 3. Quantificazione di carica batterica con grande flusso di particelle citometro. 100 cfu di S. epidermidis sono stati iniettati nel tuorlo di embrioni di zebrafish. A) fino a 5 dpi, ogni giorno, gruppi di 10 embrioni sono stati omogeneizzati e placcato direttamente, mostrando la crescita media esponenziale basata su due repliche biologiche (barre di errore= SEM). B) flusso di particelle Large citometro analisi mostra il segnale di media fluorescenza da non-iniettato e S. epidermidis iniettato embrioni. 30-160 embrioni per condizione sono stati analizzati (barre di errore = SEM), lettere differenti indicano differenze statisticamente significative per uno ANOVA seguito dal test di Tukey post-hoc (P &lt;0.001), ns., Non differenze significative C) Correlazione tra cfu e segnale di fluorescenza media di gruppi di 10 S. epidermidis infetto embrioni (barre di errore = SEM). Questa cifra è stata modificata da Veneman et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Figura 4. Establishment della fase cellula migliore per M. marinum tuorlo d&#39;iniezione. embrioni di zebrafish sono stati iniettati in tutte le diverse fasi di sviluppo 1-512 palco cella con 30 cfu di M. marinum E11 e il ceppo M. A, B) Embrioni iniettati 1-8 palco cellule ha mostrato simile diffusione e mortalità con entrambi i ceppi. A) Gli embrioni iniettati tra 16-128 palco cella con ceppo E11 ha mostrato la formazione di granulomi e le infezioni sistemiche, mentre quelli iniettato 256-512 stadio di cellule tenuto carica batterica nel tuorlo. B) Embrioni iniettato tra 16-64 palco cella con ceppo M ha mostrato la formazione di granulomi come le strutture e le infezioni sistemiche, mentre quelli iniettati 128-512 stadio di cellule tenuto carica batterica nel tuorlo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo: Content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Trattamento di M. infezione acuta marinum con un anti-tubercolosi farmaco di prima linea. embrioni iniettato tra 16-64 palco cella con 30 cfu di M. ceppo marinum M sono stati eseguiti attraverso la grande particella citofluorimetro a 3 dpi essere ordinati in due gruppi, dopo aver eliminato le non-e / o embrioni altamente infette. A) fluorescenza dei singoli embrioni in entrambi i gruppi. b) embrioni trattati con rifampicina (RIF ) per 48 ore a dosi di 12, 24, e 200 mM sono stati analizzati a 4 dpi; la loro carica batterica si riduce notevolmente. C) profili COPAS rappresentativi di embrioni trattati con DMSO e rifampicina a dosi di 12, 24, e 200 mM per 24 hr. Carico e distribuzione batterica viene indicato dai picchi rossi. Linea blu rappresenta il profilo dell&#39;elemento ordinato (4 dpf zebrafish embryo) da parte dei COPAS. 60-90 embrioni per condizione sono stati analizzati. Ciascun punto di dati rappresenta un individuo embrione. I valori sono indicati come media ± SEM. ns: differenze non significative. Analisi della significatività statistica delle differenze è stata effettuata da un modo ANOVA seguito dal test di posthoc di Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Figura 6. Trattamento di M. infezione cronica marinum con un farmaco di prima linea antitubercolari. embrioni iniettato tra 16-64 palco cella con 30 cfu di M. ceppo marinum E11 sono stati eseguiti attraverso il grande flusso di particelle citometro a 3 dpi essere ordinati in due gruppi, dopo aver eliminato le non-e / o embrioni altamente infetti.<html> A) fluorescenza di singoli embrioni in entrambi i gruppi. B) Embrioni trattati con rifampicina (RIF) a 200 pM per 4 giorni sono stati analizzati mostra una significativa riduzione della carica batterica dopo 1 giorno di trattamento. 90 embrioni per condizione sono stati analizzati. I valori sono indicati come media ± SEM. Lettere diverse indicano differenze significative tra punti di tempo del trattamento stesso. * Indica differenze significative con il gruppo di controllo. ns: differenze non significative. Analisi della significatività statistica delle differenze è stato eseguito da un ANOVA seguita dal test di Tukey POSTHOC. (P &lt;0.05). Figura B) è stato modificato da Spaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Risultato di M. marinum E11 iniezione tuorlo ripreso con Vertebrati Automated tecnologia di screening e CLSM. confocale pila Z (cucito 3 immagini) di un 5 dpi FLI1-EGFP 14 embrioni. A) Risultati in diretta embrione mostra proliferazione di M. batteri marinum E11 (rosso) in tutto il corpo. B) Fisso 5 dpi fli-EGFP embrione mostra M. batteri marinum E11 (rosso) in tutto il corpo co-localizzazione con leucociti (azzurro) rilevata da L-plastin immunoistochimica 15.

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

In questo articolo video descrive l&#39;alta velocità oleodotto che è stato stabilito con successo per infettare e analizzare un gran numero di embrioni di zebrafish fornire un nuovo potente strumento per il test composto e la scoperta di farmaci utilizzando un intero organismo vertebrato.

Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infezione come modello per Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K Views.  Leiden University.  In questo articolo video descrive l'alta velocità oleodotto che è stato stabilito con successo per infettare e analizzare un gran numero di embrioni di zebrafish fornire un nuovo potente strumento per il test composto e la scoperta di farmaci utilizzando un intero organismo vertebrato. 

Video: Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analisi di 18FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modello di topo per valutare risposta immunitaria innata per infezione da Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...