<p class="jove_content"&gt; Ringraziamo Nadiesda Wolf, Nadine Eschen e Susanne Delong per l&#39;allevamento degli animali eccellente. CW è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato dal programma Helmholtz &#39;<em&gt; BioInterfaces</em&gt; Internazionale di diploma di scuola &#39;(BIFIGS). Ulteriore supporto è stato fornito da un KIT-RISC e da una borsa Marie Curie Internazionale reinserimento sovvenzione nell&#39;ambito del 7 ° programma quadro della Comunità europea (PIRG07-GA-2010-267552) al CG. AHS è stata sostenuta da BOLD (Biologia del fegato e dello sviluppo del pancreas e malattie) - Network Marie Curie Initial Training (238.821). UL è stata sostenuta da Dopaminet 7 ° PQ (Settimo Programma Quadro) (223.744).</p&gt;

1. Animal Handling Per il saggio Chin uso 3 larve dpf derivante da accoppiamenti di gruppo tra omozigote doppio transgenico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 e AB (wild-type) i pesci. Raccogliere embrioni di riproduzione naturale e sollevarle a 29 ° C in terreno E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 0,1% e blu di metilene, equilibrata a pH 7,0) in piastre di Petri. È essenziale mantenere una densità di embrioni non superiore a 50-70 per piastra. 2. Larva Ordinamento Controllare tutte le larve sotto uno stereoscopio a fluorescenza per l&#39;espressione reporter fluorescente, infiammazione spontanea e lo sviluppo appropriato all&#39;età correlati. 3. Screening Preparazione Medium (Preparare sempre fresco) Preparare un mezzo E3 senza il blu di metilene integrato con DMSO (1% finale) e MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Preparazione (Preparare sempre fresco) Prima pesare CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) e preparare una soluzione stock 20 mM in dH 2 O. Preparare 120 pM CuSO 4 soluzione di lavoro (da 20 mM soluzione stock) in E3/DMSO (1%) / MS-222. Proteggere CuSO 4 soluzione dalla luce. 5. 384 ben Preparazione Plate (Greiner 384 Well Microplate) Pre-aggiungono 20 pl di E3/DMSO (1%) / MS-222 ad ogni pozzetto con una pipetta inversa. Un aumento della punta di pipetta foro è necessario per gestire gli embrioni con cura senza infliggere alcun ferimento, questo viene fatto tagliando la punta ad un foro mm 2. Trasferimento larva singolo in 74 microlitri di terreno ad ogni pozzetto (84 microlitri per controllo non trattato). Se necessario, larve orientare in una posizione laterale all&#39;interno del pozzetto usando un flessibile Eppendorf Microloader punta di pipetta (Eppendorf, 5242 956,003). Condurre tutte le seguenti fasi di manipolazione dei liquidi con un liquido robotgestione workstation per garantire un trattamento simultaneo di tutte le larve. 6. Drug Treatment Mescolare composti in lamiera di droga magazzino 5 volte pipettando su e giù. Aggiungere 16 microlitri di piastra 7.5x magazzino della droga in ciascun pozzetto e mescolare 5 volte. Regolare la posizione della punta all&#39;interno dei pozzetti per evitare lesioni delle larve ed erogare il mezzo a 10 pl / s. Mescolare mezzo in pozzetti 4 volte per garantire una distribuzione omogenea del farmaco all&#39;interno del pozzo. 7. Incubazione Incubare la piastra di screening per 1 ora a 29 ° C coperto con un foglio di alluminio per proteggere i composti così come CuSO 4 dalla luce. 8. Chemical Ferimento Aggiungere 10 pl di 120 pM CuSO 4 soluzione di lavoro a ciascun pozzetto tranne controlli negativi, mix 4 volte e incubare ancora per 1 ora a 29 ° C. 9. Lavaggio Rimuovere e scambiare 80 microlitri di me<html> dium da ogni ben due volte (con incrementi di 20 pl) per rimuovere i composti e CuSO 4. 10. Acquisizione di immagini Avviare l&#39;acquisizione delle immagini su un microscopio invertito automatico (ad esempio: Olympus scan ^ R) 90 minuti dopo il trattamento iniziale di rame. Set iniziale di z-livello in modo che neuromasti da destra e sinistra la linea laterale posteriore sono visibili. Immagine ciascun bene una volta ogni ora nella brightfield canali, Cy3 e GFP in 4 piani focali (distanza di 50 micron) con un obiettivo 4x (NA = 0,13). Ulteriori informazioni su elaborazione di immagini e dati sono disponibili su richiesta. 11. Image Processing 1. Ordinamento dei dati Le immagini Raw vengono elaborate con il nostro script personalizzato software LabView. La prima operazione della pipeline di elaborazione dell&#39;immagine è l&#39;ordinamento di immagini crude dalla cartella microscopio generato dal canale dati, e ben time-point informazioni. ove_step &quot;&gt; 2. messa a fuoco estesa Successivamente, il software crea immagini sfuocate estesa da 4 piani focali per ciascuno dei canali. 3. RGB-overlay In un ultima fase di messa a fuoco delle immagini estese dai 3 canali sono uniti per portare in una finale RGB-sovrapposizione di immagini. 4. Neuromast rilevamento automatico Uno strumento di pattern recognition (LabView IA strumento di prototipazione rapida) identifica neuromasti all&#39;interno delle immagini sovrapposte degli RGB e crea un&#39;area empiricamente definito di interesse intorno alle neuromasti. 5. Quantificazione All&#39;interno dell&#39;area empiricamente definito di interesse che circonda neuromasti feriti rosse fluorescenti (leucociti riflessa come pixel rossi) sono segnati con un conseguente lettura primaria di p ercent uno o ragione ccupied da eukocytes l (Paol). In media 95,27 ± 2,11% (FDA1) e di 95,12 ±1,56% (FDA2) di pozzetti (larve) sono stati rilevati correttamente e sono stati successivamente sottoposti a ulteriore elaborazione dei dati. L&#39;uscita dei dati grezzi (Paol per ogni neuromast rilevato) è memorizzato in un file txt e serve come ingresso dati per gli script MATLAB che elaborano i dati grezzi ulteriormente. 12. Elaborazione dei dati 1. Imaps Valutare il successo di esperimenti individuali attraverso la visualizzazione grafica del greggio Paol dati in uscita un codice di colore può essere realizzato con le cosiddette carte infiammazione (imaps) (Figura 2). Verde brillante riflette un alto indice infiammatoria iniziale, nero indica l&#39;assenza di infiammazione. Questa breve panoramica permette l&#39;identificazione rapida di esperimenti falliti, che possono poi essere esclusi da ulteriori analisi dei dati. 2. Media dei controlli Ogni piastra sperimentale contiene 320 composti che riflettono unadati singoli composti e punto per punto temporale nonché 32 controlli positivi e negativi, rispettivamente. Il controllo 32 replica viene calcolata la media e la deviazione standard viene calcolata. Per i controlli solo i punti dati entro 2 deviazioni standard sono inclusi. 3. Normalizzazione La normalizzazione viene effettuata per analisi foglio di calcolo. Il valore medio di DMSO, essendo il controllo negativo, è impostato a 0 e la massima Paol mediata per il controllo rame è impostato su 1, in modo che la differenza massima tra il controllo positivo e negativo è impostato su 1. Paol Ogni mescola è interpolati o estrapolati linearmente ai rispettivi controlli sulla piastra sperimentale. 4. Finale read-out: indice infiammatorio Dopo gli esperimenti replicati sufficienti (cioè 15) sono stati condotti, normalizzati i dati grezzi provenienti da esperimenti replicati viene calcolata la media, risultando in un finale di read-out - il infiammatoriaindice. L&#39;indice iniziale infiammatoria del controllo rame inizia al 100% per tempo-punto zero e correlato al tempo di inizio acquisizione di immagini (90 minuti dopo il trattamento iniziale di rame). 5. Monotona raccordo regressione esponenziale A causa di risoluzione della risposta infiammatoria nel corso del tempo si esegue una monotona raccordo esponenziale di regressione lineare verso l&#39;infiammazione iniziale utilizzando <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> - Uno 0 è una misura per la risposta iniziale all&#39;istante t = 0, a 1 è legato alla pendenza della grandezza nel tempo. 6. 2-D spazio grafico funzione (figura 4) Per generare lo spazio funzionalità, non-regressione lineare viene applicato a grappolo analisi divide lo spazio in funzione regioni caratteristici, consentendo così l&#39;identificazione automatizzata di candidati interessanti da diversi immuno-modulatori categorie (anti-inflammatORY, anti-risoluzione, pro-infiammatori, pro-risoluzione). Tutti i composti sono visualizzati in 2-D trama in base ai parametri a 0 e 1. 13. Gestione dei dati e archiviazione I nostri dati routine di gestione creare pagine web di visualizzare e rappresentare tali schermi di droga che forniscono una rapida panoramica dell&#39;immagine e di elaborazione dei dati dei risultati passi &#39;, così come una visione dettagliata, quando richiesto dall&#39;utente 10. Soft link ad altri pertinenti basi di dati eterogenee biologici e chimici sono integrati, nonché per fornire una preziosa risorsa per gli studi comparativi e romanzo 11. Con queste routine, adeguati standard di dati e metainformazione sono fissati per la conservazione a lungo termine di questi dati. 14. Risultati rappresentativi In uno schermo pilota abbiamo analizzato una libreria composta da 640 approvati dalla FDA noti composti bioattivi per gli effetti sui inizio, la progressione o la risoluzione di Granulocytic risposta infiammatoria. Sulla base degli effetti osservati abbiamo classificato 4 tipi di fenotipi modulatori del sistema immunitario che possono essere indicativi di diversi modi di azione: anti-infiammatori (1), anti-risoluzione (2), pro-infiammatorie (3) e pro-risoluzione (4) , che può essere descritto con i parametri di uno 0 e un 1, che derivano da un monotona non lineare raccordo regressione (AO e + ALX -) verso l&#39;infiammazione iniziale. A 0 rappresenta la grandezza della risposta infiammatoria, mentre un 1 caratterizza la pendenza della curva e quindi descrive risoluzione infiammazione. Visualizzazione tutti i composti in un 2-D plot funzione spazio (a 1 vs uno 0) permette l&#39;identificazione automatica di candidati colpiti dalle diverse categorie modulatori del sistema immunitario (Figura 3). 45 su 640 composti esercitata significativo effetto anti-infiammatorio, riducendo l&#39;indice infiammatoria iniziale al 50% o meno. All&#39;interno di this categoria abbiamo trovato 6 composti appartenenti alla classe farmacologica della non-steroidei anti-infiammatori non steroidei (FANS), confermando la validità del nostro approccio. Tuttavia, i FANS non classificato tra i più potenti farmaci anti-infiammatori. Oltre ai FANS abbiamo trovato diverse classi farmacologiche farmaci aggiuntivi come ad esempio bloccanti del recettore dell&#39;angiotensina (ARB), antibiotici e inibitori della pompa protonica. 7 composti soddisfatto i criteri di soglia definiti empiricamente per potenziali farmaci pro-risoluzione. 18 farmaci esercitato un effetto pro-infiammatorio, con conseguente esagerata reclutamento dei leucociti al neuromasti feriti rispetto ai controlli positivi. Solo 2 composti impedito tempestiva risoluzione della risposta infiammatoria. L&#39;effetto anti-infiammatorio dei candidati colpito diversi (i candidati esemplari provenienti da classi di farmaci di cui sopra farmacologiche) dalla coul schermo pilotad essere confermato in un modo dipendente dalla dose in successive saggi Chin secondari (dati non mostrati). Ripetizione di 4 potenziali pro-farmaci risoluzione non ha confermato la modalità indicata di azione esercitata nella schermata principale. 2 dei farmaci hanno un leggero anti-infiammatorie a concentrazioni più elevate (20 pM). Un terzo farmaco esibito una marginale non-dose-dipendente effetto antinfiammatorio a concentrazioni comprese farmaco 5-20 pM. Il farmaco quarto aveva alcun effetto sulla risposta infiammatoria alle concentrazioni testate. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figura 1. Workflow del saggio Chin. Individuale compound transgenico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larve (3 dpf) sono distribuite manualmente in piastre da 384 pozzetti microtiter. I farmaci sono aggiunti contemporaneamente per ogni pozzetto usando un Compact Zephyr Workstation di gestione dei liquidi. Piastre di saggio vengono poi incubate per 1 ora a 29 ° C. Il trattamento con CuSO 4 </sub&gt; - La soluzione (10 uM concentrazione finale) per 1 ora infligge il ferimento e avvia una risposta infiammatoria acuta. Infine, soluzione di rame e la droga vengono lavati via e acquisizione delle immagini automatico viene avviato (90 minuti dopo il trattamento iniziale di rame). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figura 2. . Panoramica foto di immagini RAW La figura mostra le immagini crude di 4 piani focali (Z = 0 - 3) a distanza di 50 pm di canali Cy3 (a sinistra) e GFP (a destra), rispettivamente. Frecce (Z = 1,2) indicano neuromasti esemplari, punte di freccia (Z = 1,2) punto a leucociti raggruppate intorno neuromasti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figura 3. Mappe infiammazione (imaps) Il successo degli esperimenti individuali possono essere valutati in imaps che riflettono la risposta infiammatoria (dati grezzi) in un codice colore: verde brillante riflette un iniziale elevata inflazione<html> risposta mmatory, nero indica l&#39;assenza di infiammazione imaps a timepoint 0 (a sinistra) e time-punto 5 (a destra) mostrano chiaramente se un esperimento dovrebbe essere inclusa nella ulteriore elaborazione dei dati.. Controlli di rame (riga 13 e 24) mostrano in diverse tonalità di verde, mentre DMSO pozzetti di controllo (riga 1 e 12) appaiono in verde scuro o nero. Al momento-punto 5, l&#39;infiammazione è quasi risolto nei controlli di rame, ora indicata in tonalità di verde scuro o nero. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figura 4. 2-D trama caratteristica spazio 320 di composti di uno approvato dalla FDA libreria e rispettivi controlli. Tutti i pozzetti composti possono essere visualizzati in un 2-D trama funzione spazio sulla base dei parametri di uno 0 e 1, derivanti da un non-lineare regressione raccordo (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Equazione 1 &quot;/&gt;) verso l&#39;infiammazione iniziale. Questa trama spazio caratteristica permette l&#39;identificazione automatizzata di candidati interessanti appartenenti ad uno dei seguenti 4 immuno-modulatori categorie che possono essere indicativi dei farmaci &#39;modalità d&#39;azione:. anti-infiammatorio (1), anti-risoluzione (2), pro-infiammatorie (3) e pro-risoluzione (4) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

<ol>
	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

<p class="jove_content"&gt; Qui vi presentiamo uno completamente automatizzato high-throughput strategia di screening che permettono di identificare i composti immuno-modulatori in un contesto animale intero. Così monitoraggio consentendo di una risposta infiammatoria acuta<em&gt; In vivo</em&gt; E in tempo reale.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Forniamo un protocollo da applicare zebrafish come organismo modello prezioso per la scoperta di farmaci o droghe Ricontestualizzazione sforzi, dal momento che gli effetti dei farmaci sul reclutamento dei leucociti alle ferite possono essere studiati con relativa facilità nel contesto di uno completamente funzionale sistema immunitario innato. L&#39;unico vantaggio del nostro approccio è il fatto che ferimento chimica rende manipolazione manuale larve obsoleto, permettendo così l&#39;automazione e screening in un formato ad alta capacità.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Inoltre, gli effetti avverse o tossici come pure forti effetti off-target può essere facilmente valutata con la proposta di set-up. La biblioteca FDA ha approvato però non contiene composti tossici alle concentrazioni di screening. Tuttavia, ci proponiamo per apparenti composti tossici per confrontare il set di dati disponibili (ad esempio fenotipo modulazione immunitaria, concentrazione del farmaco) tra i membri del presente stessa classe di sostanze farmacologiche nella libreria testato. Membri di una famiglia tossici sostanza, che esercita in caso contrario un fenotipo promettente modulatorio immunitario, potrebbe essere riesaminato a concentrazioni più basse, se necessario.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Noi abbiamo dimostrato la possibilità di classificare automaticamente i farmaci in base alla loro esercitata immuno-modulazione effetto. Farmaci appartenenti alla categoria di composti anti-infiammatori potrebbe essere convalidato in esperimenti indipendenti, la maggior parte dei composti che esercitano il loro effetto in un modo dipendente dalla dose. Quattro composti identificati come potenziali farmaci pro-risoluzione potrebbe quindi non lontano essere confermata come tale. Essa indica inoltre che questa categoria particolare modulatorio immune è difficile da descrivere, in quanto non esclusivamente farmaci che influenzano la risoluzione sono finora stati descritti in letteratura. Tuttavia, 3 dei 4 farmaci rianalizzato mostrato un anti-infiammatorio tendenza ad alte concentrazioni molari. Ottimizzazione dei criteri di soglia definiti empiricamente dovrebbe contribuire a ridurre il numero di falsi positivi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Inoltre, la tecnica presentata offre la possibilità di essere utilizzato per l&#39;identificazione di mutazioni in geni che influenzano leucociti comportamento migratorio<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; In conclusione, il metodo proposto può facilitare e accelerare la scoperta di nuovi farmaci o droghe repurposing sforzi da parte cedendo potenziali nuove strutture di piombo con le informazioni prontamente disponibili sulla tolleranza della droga, la tossicità, il dosaggio così come i potenziali effetti off-target. Quindi, che serve come un semplice, la strategia dei costi e risparmio di tempo nelle fasi iniziali di sviluppo del farmaco.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato anidro </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA ha approvato libreria del medicamento </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 Piastra non vincolante, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> nero </td></tr><tr><td> Olympus scan ^ R </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Compact Liquid Handling Workstation </td><td> Pinza </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Zebrafish larve sono particolarmente suscettibili a intero animale piccola molecola 1,2 schermi a causa della loro piccola dimensione e la relativa facilità di manipolazione e di osservazione, così come il fatto che i composti possono essere semplicemente aggiunto all&#39;acqua di balneazione e sono facilmente assorbito quando somministrato in un &lt;soluzione di DMSO 1%. A causa della chiarezza ottica di larve zebrafish e la disponibilità di linee transgeniche esprimenti proteine ​​fluorescenti in leucociti, zebrafish offrono il vantaggio unico di monitoraggio una risposta infiammatoria acuta in vivo. Di conseguenza, utilizzando il pesce zebra ad alto contenuto di schermi di piccole molecole volte all&#39;individuazione di immuno-modulatori composti con alto rendimento è stato proposto 3-6, suggerendo scenari induzione infiammazione esempio scalfitture localizzate nel tessuto pinna, danni laser diretto alla superficie di tuorlo 7 embrioni o amputazione tailfin 3,5,6. Lo svantaggio principale di questi metodi, tuttavia, erail requisito di manipolazione manuale larva per indurre ferite, impedendo così elevata throughput screening. Introduzione della infiammazione indotta chimicamente (Chin) test 8 eliminati questi ostacoli. Dal momento che è ferita inflitta chimicamente il numero di embrioni che possono essere trattate allo stesso tempo è praticamente illimitata. Trattamento temporaneo di larve di zebrafish con solfato di rame induce selettivamente morte delle cellule in cellule ciliate del sistema della linea laterale e si traduce in un rapido reclutamento di granulociti neuromasti feriti. La risposta infiammatoria può essere seguita in tempo reale utilizzando composto transgenica cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9 larve zebrafish che esprimono una proteina verde fluorescente in cellule neuromast, nonché un fluorescente rosso granulociti etichettatura proteine. Al fine di elaborare una strategia di screening che consentisse entrambe le analisi ad alta contenuti e high-throughput abbiamo introdotto robotizzato di gestione dei liquidi e MICR combinata automaticaoscopy con uno script personalizzato software sviluppato. Questo script consente una quantificazione automatica della risposta infiammatoria segnando l&#39;area occupata dalla percentuale rossi leucociti fluorescenti all&#39;interno di un&#39;area definita empiricamente circostante lese neuromasti fluorescenti verdi. Inoltre, il trattamento automatizzato dei dati, la gestione, la visualizzazione e archiviazione tutti basati su MATLAB e personalizzato sviluppato gli script Python. In breve, si introduce un sistema automatico HC / HT schermata che permette la sperimentazione di composti chimici per il loro effetto sulle inizio, la progressione o la risoluzione di una risposta infiammatoria granulocitica. Questo protocollo serve un buon punto di partenza per ulteriori analisi approfondite dei meccanismi di droga e le vie coinvolte nella orchestrazione di una risposta immunitaria innata. In futuro, possono contribuire ad identificare intollerabili effetti tossici o off-target a fasi precedenti della scoperta di nuovi farmaci e quindi ridurre i rischi ei costi procedurali per lo sviluppo di farmaci.

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Qui descriviamo un romanzo ad alto contenuto di test infiammazione indotta chimicamente finalizzate alla individuazione di immuno-modulatori bioattivi. Abbiamo unito con successo la microscopia automatizzata con software sviluppati script personalizzati che consentano la quantificazione automatizzata della risposta infiammatoria, nonché ulteriore elaborazione dati, analisi, estrazione e stoccaggio.

Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K Views.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. Qui descriviamo un romanzo ad alto contenuto di test infiammazione indotta chimicamente finalizzate alla individuazione di immuno-modulatori bioattivi. Abbiamo unito con successo la microscopia automatizzata con software sviluppati script personalizzati che consentano la quantificazione automatizzata della risposta infiammatoria, nonché ulteriore elaborazione dati, analisi, estrazione e stoccaggio.

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

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Immunologia e infezioni

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

L&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...