Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tubercolosi come qual è il ruolo delle risposte immunitarie adattive e la patogenesi di questa malattia multifattoriale. Il principale vantaggio di questo metodo di base dell'acido nucleico è che sia i carichi batterici che i livelli di espressione genica possono essere misurati dallo stesso individuo. Per iniziare questa procedura, cultura M.marinum su una piastra 7H10 come delineato nel protocollo di testo.
Trasferire 10 millilitri di mezzo 7H9 contenente arricchimento ADC, polisorbato 80 e glicerolo in un pallone da coltura cellulare. Quindi, utilizzare un ciclo sterile di inoculazione di un microliter per trasferire aseticamente un loopful della massa batterica M.marinum nel pallone. Lasciare il tappo sciolto o utilizzare un tappo filtrante per consentire uno scambio di gas e una coltura sufficienti a 29 gradi Celsius al buio senza tremare per tre o quattro giorni fino a quando l'OD600 raggiunge circa 0,7.
Diluire e continuare a coltivare i batteri come delineato nel testo. Per iniziare a preparare la soluzione batterica per l'infezione, trasferire un millilitro della coltura in un tubo fresco. Centrifuga a 10.000 g per tre minuti.
Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di PBS sterile. Utilizzando PBS sterile con 0,3 milligrammi per millilitro di rosso fenolo come tracciante, diluire la sospensione per raggiungere la concentrazione batterica desiderata. Dopo questo, utilizzare una siringa millilitro per tirare lentamente la sospensione attraverso un ago calibro 27 tre volte.
Eseguire questo passaggio appena prima dell'utilizzo per ogni aliquota. In primo luogo, pipettare una goccia a cinque microliter della soluzione batterica diluita su un pezzo di pellicola di paraffina. Quindi, tirare la goccia in un ago di insulina calibro 30.
Usa un pesce di cinque-otto mesi per questo esperimento, con uno che è un pesce di tipo selvatico e l'altro è un pesce mutante di straccio. Posizionare il lato ventrale del pesce nelle fessure di un pezzo di plastica espansa umida. Iniettare l'ago di insulina tra le pinne pelviche con un angolo di 45 gradi.
Tenere l'ago aperto verso l'alto per assicurarsi che l'intera apertura si trova all'interno della cavità addominale. Quindi, iniettare lentamente la soluzione batterica. Dopo questo, rimuovere con cura l'ago e trasferire immediatamente il pesce in un serbatoio di recupero pieno di acqua fresca del serbatoio.
Prelevare campioni dall'aliquota batterica in uso ogni 15 minuti su piastre 7H10. Incubare questi campioni a 29 gradi Celsius per cinque giorni per verificare la dose di infezione. Controllare regolarmente il benessere del pesce, assicurandosi di eutanasiare qualsiasi pesce con sintomi di infezione incubandoli in acqua con oltre lo 0,02% di estere etilico dell'acido 3-amminobenzoico.
Dopo aver eutanasiato il pesce, inserire un perno posteriore ai raggi branchiostegali. Inserire un secondo perno attraverso la coda per appuntare il pesce sulla piattaforma. Usando un bisturi, aprire l'intera cavità addominale.
Quindi, usa un piccolo cucchiaio e una pinzetta affilata per raccogliere gli organi interni a partire dal cuore e lavorando lungo la colonna vertebrale verso la coda per staccare tutti gli organi interni in un blocco. Utilizzare una pinzetta per staccare la rete intestinale dalla cloaca e trasferire gli organi in un tubo di omogeneizzazione da 1,5 millilitri contenente una mezza dozzina di perline ceramiche da 2,8 millimetri. Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio secco per congelare il campione.
Conservare il campione a -80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'omogeneizzazione. Dopo aver estratto il DNA e l'RNA, misurare i carichi micobatterici per PCR quantitativa come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, i pesci zebra adulti sono infettati da M.marinum da un'iniezione intraperitoneale.
Si nota che un'elevata dose di infezione porta a una malattia progressiva in cui la carica micobatterica continua ad aumentare fino a quando il carico medio raggiunge circa cinque milioni di batteri che alla fine uccidono il pesce. Una dose bassa d'altra parte porta allo sviluppo di uno spettro di malattie simile a quello visto nella tubercolosi umana con infezioni progressive, latenti, riattivate e sterilizzate. In questo caso, il carico continua ad aumentare per quattro settimane dopo di che la malattia raggiunge uno stato stazionario nella maggior parte del pesce.
Questi dati rivelano che il numero iniziale di micobatteri utilizzati per infettare il pesce è un determinante critico per l'esito dell'infezione. Si vede che i pesci zebra mutanti rag non sono in grado di limitare a sufficienza la crescita dei micobatteri portando a carichi batterici più elevati e a una maggiore morbilità. Ciò dimostra chiaramente l'importanza dell'immunità adattiva nel controllo dell'infezione micobatterica.
I livelli di interleuchina-4 sono significativamente più alti nel gruppo di tipo selvaggio rivelando che la risposta adattiva è necessaria per l'introduzione efficiente dell'interleuchina-4, ma dispensabile per l'introduzione della gamma interferone dopo l'infezione micobatterica. Questo protocollo consente la raccolta di DNA e RNA dallo stesso campione, il che consente di combinare il carico micobatterico del campione con i dati di espressione genica sia dell'ospite che dei batteri. Questa tecnica può essere combinata con la somministrazione di farmaci o candidati al vaccino per valutarne l'effetto sui carichi micobatterici e sulle risposte immunitarie.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seguire le linee guida locali per la sicurezza personale e lo smaltimento dei rifiuti quando si lavora con un agente patogeno di livello due di biosicurezza. Questa tecnica consente di studiare sia la tubercolosi attiva che la tubercolosi latente con micobatteri dormienti nel pesce zebra, che è un modello etico non mammiferi in vivo.
