Questo studio è stato sostenuto dal National Heart, Lung, and Blood Institute di Grant HL 103542, e Distinguished Trailblazer Award Il BCH Anesthesia Research Foundation di PAC.

Preparazione <ol><li> Preparare 1 M K-HEPES Stock Solution (aggiustare il pH a 7,2 con KOH). </li><li> Preparare 0,5 M K-EGTA Stock Solution (aggiustare il pH a 8,0 con KOH). </li><li> Preparare 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution. </li><li> Preparare 1 M MgCl 2 Stock Solution. </li><li> Preparare omogeneizzazione Buffer (pH 7,2) saccarosio 300 mM, 10 mM K-HEPES, e 1 mM K-EGTA. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare saccarosio respirazione Buffer 250 mm, 2 mm KH 2 PO 4, 10 mM MgCl 2, 20 mM K-HEPES Buffer (pH 7,2) e 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare 10x PBS Archivio soluzione sciogliendo 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, e 2,4 g di KH 2 PO 4 in 1 L doppia H 2 O distillata (pH 7,4). </li><li> Preparare 1x PBS pipettando 100 ml di 10x PBS in 1 L doppio distillata H 2 O. </li><li> Preparare Subtilisina A Stock pesando su 4 mg di Subtilisina A inin una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare BSA Archivio pesando i 20 mg di BSA in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> Isolamento mitocondriale (Figura 1) <ol><li> Immediatamente prima dell&#39;isolamento, sciogliere Subtilisina A in 1 ml di tampone di omogeneizzazione. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;isolamento, BSA sciogliere in 1 ml di tampone di omogeneizzazione. </li><li> Raccogliere due campioni di tessuto fresco con un pugno campione bioptico 6 mm e conservare in 1x PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml conica sul ghiaccio. </li><li> Trasferire i due punzoni 6 mm di tessuto in una provetta dissociazione C contenente 5 ml di freddo ghiaccio Omogeneizzazione Buffer. </li><li> Omogeneizzare il tessuto inserendo il tubo di dissociazione C sul dissociatore tessuti e selezionare il ciclo di isolamento mitocondriale preimpostato (60 sec omogeneizzazione). </li><li> Rimuovere il tubo di dissociazione C per un secchio di ghiaccio. </li><li> Aggiungere 250 ml di Subtilisina A Stock soluzione alomogeneizzato, mescolare per inversione ed incubare l&#39;omogeneizzato in ghiaccio per 10 min. </li><li> Mettere un filtro a rete 40 micron su un tubo da centrifuga da 50 ml conica su ghiaccio e pre-bagnato il filtro con Omogeneizzazione Buffer e filtrare l&#39;omogeneizzato nel tubo da centrifuga da 50 ml conica sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 250 ml di preparato fresco BSA Stock Solution al filtrato e mescolare per inversione. Nota: Omettere questo passaggio se è necessaria la determinazione delle proteine ​​mitocondriali. </li><li> Mettere un filtro 40 micron su un tubo da centrifuga da 50 ml conica su ghiaccio e pre-bagnato il filtro con Omogeneizzazione Buffer e filtrare l&#39;omogeneizzato nel tubo da centrifuga da 50 ml conica sul ghiaccio. </li><li> Collocare un filtro da 10 micron su un tubo da centrifuga da 50 ml conica su ghiaccio e pre-bagnato il filtro con Omogeneizzazione Buffer e filtrare l&#39;omogeneizzato nel tubo da centrifuga da 50 ml conica sul ghiaccio. </li><li> Trasferire il filtrato di due pre-refrigerati provette da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare a 9.000 xg per 10 min a4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere e combinare pellet in 1 ml di ghiaccio freddo respirazione Buffer. </li></ol> ATP Assay Nota: Per determinare l&#39;attività metabolica dei mitocondri isolati un saggio luminescenza ATP può essere eseguita utilizzando un kit di test ATP. Il protocollo, reagenti e standard sono stati forniti nel kit test. Una sintesi della procedura è descritta di seguito. <ol><li> Equilibrare reagenti del kit a RT. </li><li> Preparare 10 mM ATP Stock Solution sciogliendo liofilizzato pellet ATP in 1.170 ml di acqua bidistillata. Conservare ATP standard di soluzione Stock e campioni mitocondriali preparati sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione Tampone Substrato ad un flacone di soluzione di substrato liofilizzato. Mescolare delicatamente e mettere al buio. </li><li> Aggiungere 100 ml di respirazione tampone a tutti i pozzetti di un nero, fondo opaco, 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 10 ml di mitocondri dai campioni preparati a ciascun bene ofa nero, fondo opaco, 96 pozzetti. Nota: I campioni sono placcati in triplice copia. Include una riga per standard e tre pozzi per il controllo negativo (Respirazione Buffer). </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di lisi cellulare dei mammiferi a tutti i pozzetti, comprese le norme e controlli. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 5 minuti su un agitatore orbitale a 125 rpm. </li><li> Durante l&#39;incubazione preparare norme ATP in concentrazioni di 0,1 mm, 0,05 mm, 0,01 mm, 0.005 mm, 0.001 mm, 0,0001 ATP mm dal 10 mM ATP Stock Solution. Norme Conservare su ghiaccio. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 10 ml di norme ATP corrispondenti pozzetti come indicato nella mappa piastra. NOTA: Gli standard vengono eseguiti in duplicato. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione ricostituita di substrato in ogni pozzetto. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C su agitatore orbitale per 5 min a 125 rpm. </li><li> Aprire il software Gen5 1.11 su un computer collegato con lo spettrofotometro. </li><li> Sotto &quot;Creare un nuovo elemento &quot;, cliccare su&quot; Experiment &quot;. </li><li> Clicca su &quot;protocollo predefinito&quot;. Fare clic su &quot;Ok&quot;. </li><li> Nella colonna di sinistra, selezionare &quot;Protocollo&quot;, poi &quot;Procedura&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Delay&quot;. Impostare 00:10:00. Fare clic su &quot;Ok&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Leggi&quot;. Selezionare &quot;Luminescence&quot; dal menu a discesa. Regolare le altre impostazioni per quanto segue: Leggere tipo di endpoint, Tempo di integrazione 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Set 1, Emissione Foro, Ottica posizione superiore, Sensibilità 100, Offset Top sonda verticale 1,00 millimetri. </li><li> Quando il piatto è pronto per essere analizzato, fare clic sull&#39;icona &quot;Leggi Targa&quot; sulla riga in alto. Fare clic su &quot;Read&quot;. Quando si apre lo spettrofotometro, posizionare la piastra nel cassetto con pozzetto A1 nell&#39;angolo in alto a sinistra. Una scatola con la temperatura si aprirà. Fare clic su &quot;Read&quot;. Nota: I valori più alti sono correlati con un aumento dei livelli di ATP e una maggiore attività metabolica. </li></ol>

<ol>
	<li>van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+factors+in+apoptosis:+a+Russian+roulette+with+more+than+one+bullet.">The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet.</a> Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+hub+of+cellular+Ca2++signaling.">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).</li><li>Chan, D. 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R., Hoerr, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+cell+structure+by+freeze-drying+method;+preparation+and+properties+of+mitochondria.">Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria.</a> Anat Rec. 60, 449-455 (1934).</li><li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation+II.+Experimental+procedures+and+results.">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li><li>Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li><li>Ernster, L., Schtaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+a+historical+Review.">Mitochondria: a historical Review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies.">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).</li><li>Fern&#225;ndez-Vizarra, E., Ferr&#237;n, G., P&#233;rez-Martos, A., Fern&#225;ndez-Silva, P., Zeviani, M., Enr&#237;quez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3.3,+Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation.">Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2001).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Gostimskaya, I., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+highly+coupled+rat+heart+mitochondria.">Preparation of highly coupled rat heart mitochondria.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury.">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).</li><li>McCully, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+isolated+mitochondria+during+early+reperfusion+for+cardioprotection.">Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).</li><li>Olson, M. S., Von Korff, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+endogenous+substrates+of+isolated+rabbit+heart+mitochondria+during+storage.">Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage.</a> J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).</li><li>Diepart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+measuring+oxygen+consumption+in+tumor+cells+in+vitro.">Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro.</a> Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida istituzionali attuali. Noi non abbiamo concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Per isolare con successo mitocondri utilizzano questo protocollo è essenziale per mantenere tutte le soluzioni e campioni di tessuto sul ghiaccio per conservare la vitalità mitocondriale. Anche quando mantenuto sul ghiaccio, mitocondri isolati esporranno una diminuzione dell&#39;attività funzionale nel tempo 19. Si raccomanda che tutte le soluzioni e le integrazioni essere pre-preparati. Abbiamo pre-pesare e immagazzinare Subtilisina A in 4 aliquote mg in 1,5 ml provette per microcentrifuga e conservare a ...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51682">Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.</a> An optional step was added to step 7 of the &#39;Mitochondrial Isolation&#39; section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.

Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Esistono mitocondri in ogni cellula del corpo ad eccezione dei globuli rossi e sono coinvolti in un gran numero di importanti processi cellulari e metabolici 1-4. A causa di queste numerose funzioni, danno mitocondriale può avere effetti negativi 3. Al fine di indagare la funzione mitocondriale e disfunzione diversi metodi di isolamento mitocondriali sono state descritte. I primi resoconti pubblicati su mitocondriale data isolamento al 1940 5-8. Il primo tentativo documentato dimostrato isolamento mitocondriale dalla macinazione di tessuto epatico in un mortaio seguita da centrifugazione in una soluzione salina a bassa velocità 5,8. Più tardi, altri gruppi estesa, la procedura originale e dimostrato frazionamento del tessuto sulla base di centrifugazione differenziale di 6-8. Questi primi metodi hanno costituito la base delle tecniche attuali, che spesso incorporano omogeneizzazione, e / o differenziale centrifugazione 9-15. Il numero di homogenizatisu e centrifugazione gradini varia tra i protocolli. Questi passaggi ripetitivi aumentano il tempo per l&#39;isolamento dei mitocondri e, infine, ridurre la vitalità. Inoltre, omogeneizzazione manuale può causare danni e inconsistenti risultati mitocondriali se non adeguatamente controllato 10,16. Recentemente, abbiamo utilizzato omogeneizzazione e centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri per trapianto nel tessuto miocardico 17,18. Questa procedura di isolamento lunga tenuta di circa 90 minuti e l&#39;applicabilità clinica di questo metodo era quindi limitata. Per consentire l&#39;uso terapeutico acuto nel trattamento clinico e chirurgico abbiamo sviluppato una rapida procedura di isolamento mitocondriale che può essere eseguito in meno di 30 min. I principali vantaggi di questo protocollo è che la dissociazione del tessuto standardizzata consente di uniforme e coerente omogeneizzazione del tessuto che non è facilmente ottenibile con omogeneizzazione manuale. In Additione, l&#39;uso di filtrazione differenziale al posto di centrifugazione differenziale elimina richiede tempo e le fasi di centrifugazione ripetitive consentendo un più rapido isolamento di altamente purificati, vitali e respirazione mitocondri competenti. La capacità di isolare mitocondri competenti vitali e respirazione in meno di 30 minuti permette di applicabilità clinica. Questo protocollo di isolamento ha il potenziale per l&#39;uso in chirurgia di bypass coronarico (CABG) e altre procedure terapeutiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:377px;">Sucrose</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">84100</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Substilsin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P2173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:377px;">ATPlite Luminescence Assay System, 
			1000 Assay Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 mL Conical Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40 &#956;m Nylon Filters</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyl Biotech</td>
			<td>120-005-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 mm biopsy punch</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 &#956;m Pluristrainer</td>
			<td>Pluriselect</td>
			<td>43-500-10-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Centrifuge 5415C</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5415C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GentleMACS Dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyl Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well plates, tissue culture treated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rotomax 120 orbital shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Synergy H4 Hybrid Multi-Mode 
			&#160;Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multisizer 4 Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxytherm System</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration

Metodi di isolamento mitocondriali precedentemente descritti utilizzando centrifugazione differenziale e / o Ficoll gradiente di centrifugazione richiedono da 60 a 100 minuti per completare. Noi descriviamo un metodo per il rapido isolamento di mitocondri da biopsie di mammifero usando un dissociatore tessuto commerciale e filtrazione differenziale. In questo protocollo, omogeneizzazione manuale viene sostituito con il ciclo omogeneizzazione standardizzata del dissociatore tessuti. Questo permette uniforme e costante omogeneizzazione del tessuto che non è facilmente ottenibile con omogeneizzazione manuale. A seguito di dissociazione dei tessuti, l&#39;omogeneizzato è filtrata attraverso filtri a rete di nylon, che eliminano le fasi di centrifugazione ripetitivi. Come risultato, l&#39;isolamento mitocondriale può essere eseguito in meno di 30 min. Questo protocollo isolamento produce circa 2 x 10 10 mitocondri competenti vitali e la respirazione da 0,18 ± 0,04 g di campione di tessuto (peso a umido).

Una figura che illustra le fasi procedurali nel isolamento dei mitocondri mediante dissociazione dei tessuti e la filtrazione differenziale è mostrato in Figura 1. Tempo procedurale totale è inferiore a 30 min. I campioni di tessuto sono stati ottenuti utilizzando una biopsia 6 mm. Peso del tessuto era 0,18 ± 0,04 g (peso umido). Il numero dei mitocondri isolati come determinato mediante conteggio granulometria era 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitocond...

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Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è &lt;30 min rispetto ai 60 - 100 min con metodi alternativi.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.7K Views.  Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School.  Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è 