Diese Studie wurde von National Heart, Lung, and Blood Institute Zuschuss HL-103542 und der BCH Anästhesie Research Foundation Distinguished Trailblazer Award an GAP unterstützt.

Vorbereitung <ol><li> Bereiten 1 M K-HEPES-Stammlösung (einstellen mit KOH pH-Wert auf 7.2). </li><li> Bereiten 0,5 M K-EGTA-Stammlösung (einstellen mit KOH pH-Wert auf 8,0). </li><li> Bereiten 1 M KH 2 PO 4 Stock Lösung. </li><li> Bereiten 1 M MgCl 2-Stammlösung. </li><li> Vorbereitung Homogenisierungspuffer (pH 7,2) 300 mM Saccharose, 10 mM K-HEPES, 1 mM K-EGTA. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Vorbereitung Respiration Puffer 250 mM Saccharose, 2 mM KH 2 PO 4, 10 mM MgCl 2, 20 mM K-HEPES-Puffer (pH 7,2) und 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Vorbereitung 10x PBS-Stammlösung hergestellt durch Lösen von 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 und 2,4 g KH 2 PO 4 in 1 l doppelt destilliertem H 2 O (pH 7,4). </li><li> Bereiten 1x PBS pipettiert 100 ml 10x PBS in 1 l doppelt destilliertem H 2 O. </li><li> Bereiten Subtilisin A Stock durch Auswiegen 4 mg Subtilisin A inin ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Vorbereitung BSA Vektor durch Einwaage von 20 mg BSA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> Mitochondriale Isolation (Abbildung 1) <ol><li> Unmittelbar vor der Isolation, auflösen Subtilisin A in 1 ml Homogenisierungspuffer. </li><li> Unmittelbar vor der Isolation, auflösen BSA in 1 ml Homogenisierungspuffer. </li><li> Sammeln Sie zwei frische Gewebeproben mit einem 6 mm Biopsieprobe Punsch und speichern in 1x PBS in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Übertragen Sie die zwei 6 mm Stempeln von Gewebe zu einer Dissoziation C-Rohr mit 5 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer. </li><li> Homogenisieren des Gewebes durch Anpassen der Dissoziation C-Rohr auf das Gewebe Dissociator und wählen Sie den voreingestellten mitochondrialen Isolierung Zyklus (60 Sekunden Homogenisierung). </li><li> Entfernen Sie die Dissoziation C-Rohr zu einem Eimer Eis. </li><li> Fügen Sie 250 ul Subtilisin A Stock Lösung, um dieHomogenat, mischen durch Umdrehen und Inkubation des Homogenats auf Eis für 10 min. </li><li> Legen Sie ein 40 um-Sieb-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Fügen Sie 250 ul frisch zubereitet BSA-Stammlösung zu dem Filtrat und mischen durch Umdrehen. Hinweis: Lassen Sie diesen Schritt, wenn mitochondrialen Proteinbestimmung erforderlich ist. </li><li> Legen Sie eine 40-um-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Legen Sie eine 10-um-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Das Filtrat zwei vorgekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 9000 × g für 10 min bei4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und wieder aussetzen und kombinieren Pellets in 1 ml eiskaltem Puffer Atmung. </li></ol> ATP-Assay Anmerkung: Zur Bestimmung der metabolischen Aktivität von isolierten Mitochondrien eine ATP-Lumineszenz-Assay kann unter Verwendung eines ATP-Assay-Kits durchgeführt werden. Das Protokoll, wurden Reagenzien und Standards in der Assay-Kit geliefert. Eine Zusammenfassung des Verfahrens wird nachfolgend beschrieben. <ol><li> Ins Gleichgewicht Kit-Reagenzien auf RT. </li><li> Herstellung von 10 mM ATP-Stammlösung durch Auflösen von gefriergetrockneten ATP Pellet in 1.170 ul doppelt destilliertem Wasser. Speichern ATP-Standardstammlösung und bereit mitochondrialen Proben auf Eis. </li><li> 5 ml Substratpuffer Lösung für ein Fläschchen lyophilisierte Substrat-Lösung. Vorsichtig mischen und legen in der Dunkelheit. </li><li> 100 l Puffer Atmung zu allen Vertiefungen einer schwarzen, undurchsichtigen Boden, 96 Well-Platte. </li><li> Fügen Sie 10 ul der Mitochondrien aus den vorbereiteten Proben in jede Vertiefung ofa schwarz, undurchsichtig unten, 96-Well-Platte. Hinweis: Die Proben werden in dreifacher Ausfertigung überzogen. Fügen Sie eine Zeile für Standards und drei Brunnen für die Negativkontrolle (Atmung Buffer). </li><li> Fügen Sie 50 ul von Säugetierzell Lyse-Lösung in alle Vertiefungen, einschließlich der Normen und Kontrollen. </li><li> Die Platte bei 37 ° C für 5 min auf einem Orbitalschüttler bei 125 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Während der Inkubation herzustellen ATP-Standards in Konzentrationen von 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM und 0,0001 mM ATP aus 10 mM ATP-Stammlösung. Shop-Standards auf Eis. </li><li> Nach der Inkubation werden 10 ul der ATP-Standards mit entsprechenden Vertiefungen wie auf der Platte Karte angezeigt. Anmerkung: Standards werden in doppelter Ausführung durchgeführt. </li><li> Dann werden 50 ul des rekonstituierten Substratlösung in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C auf dem Schüttler für 5 Minuten bei 125 Upm. </li><li> Offene Gen5 1.11-Software auf einem Computer mit dem Spektrophotometer verbunden ist. </li><li> Unter &quot;Neues Element erstellen &quot;, klicken Sie auf&quot; Experiment &quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Standardprotokoll&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> In der linken Spalte, wählen Sie &quot;Protokoll&quot;, dann &quot;Vorgehensweise&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Delay&quot;. Eingestellt, 00.10.00. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Lesen&quot;. Wählen Sie &quot;Lumineszenz&quot; aus der Drop-Down-Menü. Passen Sie andere Einstellungen auf die folgenden: Lesen Typ Endpoint, Integrationszeit 0: 01.00 MM: SS.ss, Filter-Sets 1, Emission Loch, Optik Top Position, Empfindlichkeit 100, Offset Top Probe Vertikal 1,00 mm. </li><li> Wenn die Platte ist bereit, analysiert werden, klicken Sie auf das Symbol &quot;Lesen Plate&quot; in der oberen Reihe. Klicken Sie auf &quot;Lesen&quot;. Wenn das Spektralphotometer öffnet, legen Sie die Platte in das Fach mit gut A1 in der oberen linken Ecke. Eine Box mit der Temperatur wird geöffnet. Klicken Sie auf &quot;Lesen&quot;. Hinweis: Höhere Werte korrelieren mit erhöhten ATP-Spiegel und höhere Stoffwechselaktivität. </li></ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li><li>Ernster, L., Schtaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+a+historical+Review.">Mitochondria: a historical Review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies.">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).</li><li>Fern&#225;ndez-Vizarra, E., Ferr&#237;n, G., P&#233;rez-Martos, A., Fern&#225;ndez-Silva, P., Zeviani, M., Enr&#237;quez, J. 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R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Gostimskaya, I., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+highly+coupled+rat+heart+mitochondria.">Preparation of highly coupled rat heart mitochondria.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury.">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).</li><li>McCully, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+isolated+mitochondria+during+early+reperfusion+for+cardioprotection.">Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).</li><li>Olson, M. S., Von Korff, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+endogenous+substrates+of+isolated+rabbit+heart+mitochondria+during+storage.">Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage.</a> J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).</li><li>Diepart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+measuring+oxygen+consumption+in+tumor+cells+in+vitro.">Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro.</a> Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien des Instituts behandelt. Wir haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.

Um erfolgreich zu isolieren Mitochondrien mit diesem Protokoll ist es wichtig, alle Lösungen und Gewebeproben auf Eis zu halten, um die mitochondriale Lebensfähigkeit bewahren. Auch wenn auf Eis gehalten wird isolierten Mitochondrien eine Abnahme der funktionellen Aktivität im Laufe der Zeit 19 aufweisen. Wir empfehlen, dass alle Lösungen und Ergänzungen vor, vorbereitet werden. Wir voraus wiegen und zu speichern Subtilisin A in 4 mg Aliquots in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und speichern sie bei -20 ...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51682">Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.</a> An optional step was added to step 7 of the &#39;Mitochondrial Isolation&#39; section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.

Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Mitochondrien existieren in jeder Zelle des Körpers mit Ausnahme der roten Blutzellen und in einer Vielzahl von wichtigen zellulären Stoffwechselprozesse und 1-4 involviert. Aufgrund dieser vielen Funktionen können mitochondriale Schäden schädlichen Wirkungen 3 aufweisen. Um die Funktion der Mitochondrien und mitochondriale Dysfunktion mehrere Isolationsmethoden zu untersuchen, wurden beschrieben. Die frühesten veröffentlichten Konten von mitochondrialen Isolierung Datum auf den 1940er 5-8. Der erste dokumentierte Versuch demonstriert mitochondrialen Isolierung durch Schleifen Lebergewebe in einem Mörser, gefolgt von Zentrifugation in einer Salzlösung, bei niedriger Geschwindigkeit 5,8. Später erweiterte anderen Gruppen auf dem ursprünglichen Verfahren und demonstrierte Gewebe Fraktionierung basierend auf differentielle Zentrifugation 6-8. Diese frühen Methoden bildeten die Grundlage der aktuellen Techniken, die oft zu integrieren Homogenisierung und / oder differenzielle Zentrifugation 9-15. Die Anzahl der homogenizatiauf und Zentrifugationsschritte variiert zwischen den Protokollen. Diese sich wiederholenden Schritten erhöhen die Zeit für mitochondriale Isolation und letztlich reduzieren Lebensfähigkeit. Darüber hinaus können manuelle Homogenisierung mitochondriale Schäden und inkonsistenten Ergebnissen führen, wenn nicht richtig gesteuert 10,16. Kürzlich haben wir Homogenisierung und differentielle Zentrifugation Mitochondrien für die Transplantation in Herzmuskelgewebe 17,18 isolieren. Dieser langwierige Isolierungsverfahren benötigt ungefähr 90 min, und die klinische Anwendbarkeit dieses Verfahrens war daher begrenzt. Zur therapeutischen Verwendung bei akuten klinischen und chirurgischen Behandlung zu ermöglichen haben wir eine schnelle mitochondrialen Isolierungsverfahren, die in weniger als 30 min durchgeführt werden kann, entwickelt. Die wichtigsten Vorteile dieses Protokolls sind, dass standardisierte Gewebedissoziation ermöglicht einheitliche und konsequente Homogenisierung von Gewebe, das wird nicht leicht mit Hand Homogenisierung erreicht. In additIonen, die Verwendung von Differentialfiltration anstelle der differentielle Zentrifugation eliminiert zeitraubende und wiederholte Zentrifugation Schritte ermöglichen eine schnellere Isolierung von hoch gereinigten, lebensfähige und kompetente Atmung Mitochondrien. Die Fähigkeit, tragfähige und Atmung zuständige Mitochondrien in weniger als 30 min zu isolieren können für die klinische Anwendbarkeit. Diese Isolation Protokoll hat Potenzial für den Einsatz in koronarer Bypass-Chirurgie (CABG) und andere Therapieverfahren.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Substilsin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5380</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2173</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Luminescence Assay System,&lt;br/&gt; 1,000 Assay Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Nylon Filters</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C tube</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>120-005-331</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 mm biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m Pluristrainer</td><td>Pluriselect</td><td>43-500-10-03</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5415C</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Dissociator&amp;nbsp;</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, tissue culture treated</td><td>VWR</td><td>82050-732</td><td></td></tr><tr><td>Rotomax 120 orbital shaker</td><td>Heidolph</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Hybrid Multi-Mode&lt;br/&gt; &amp;nbsp;Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 4 Coulter Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63076</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm System</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration

Zuvor beschriebenen mitochondrialen Isolationsverfahren unter Verwendung differentieller Zentrifugation und / oder Ficoll-Gradienten-Zentrifugation erfordert 60 bis 100 min in Anspruch. Wir beschreiben ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugetierbiopsien unter Verwendung eines kommerziellen Gewebe Dissociator und Differentialfiltration. In diesem Protokoll ist eine manuelle Homogenisierung mit standardisierten Zyklus der Homogenisierung des Gewebes Dissociator ersetzt. Dies ermöglicht eine einheitliche und konsequente Homogenisierung von Gewebe, das wird nicht leicht mit Hand Homogenisierung erreicht. Nach Gewebedissoziation wird das Homogenat durch Nylon-Mesh-Filter, die sich wiederholenden Zentrifugationsschritten beseitigen gefiltert. Als Ergebnis kann die mitochondriale Isolierung in weniger als 30 min durchgeführt werden. Diese Isolation Protokoll ergibt etwa 2 x 10 10 lebensfähige und Atmung zuständige Mitochondrien von 0,18 ± 0,04 g (Nassgewicht) Gewebeprobe.

Eine Figur skizziert die Verfahrensschritte bei der Isolierung von Mitochondrien mit Gewebedissoziation und Differenz Filtration ist in Abbildung 1 dargestellt. Gesamtverfahrensdauer weniger als 30 min. Gewebeproben wurden mit einem 6 mm-Biopsie Punch erhalten. Gewebegewicht betrug 0,18 ± 0,04 g (Feuchtgewicht). Die Anzahl der Mitochondrien isoliert, wie durch die Teilchengröße Zählung bestimmt war 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 Mitochondrien für Skele...

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Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit &lt;30 min im Vergleich zu 60 bis 100 min mit alternativen Methoden.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

rapid-isolation-purification-mitochondria-for-transplantation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

38.0K Aufrufe.  Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School.  Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit 

Serie: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Forschung

Biochemie

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

Schnelle Isolierung von Mitoribosome von HEK Zellen

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Biologie

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Medizin

Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung mitochondrialer Kontaktstellen und architektonischer Einblicke 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Mitochondriale Fraktionierung in kleinen Gewebeproben für die superkomplexe Analyse

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial electron transport chain organization, giving rise to the proposal of the "plasticity model." This model postulates the coexistence of different proportions of SCs and complexes depending on the tissue or the cellular metabolic status. The dynamic nature of the assembly in SCs would allow cells to optimize the use of available fuels and the efficiency of electron transfer, minimizing reactive oxygen species generation and favoring the ability of cells to adapt to environmental changes. 
More recently, abnormalities in SC assembly have been reported in different diseases such as neurodegenerative disorders (Alzheimer's and Parkinson's disease), Barth Syndrome, Leigh syndrome, or cancer. The role of SC assembly alterations in disease progression still needs to be confirmed. Nevertheless, the availability of enough amounts of samples to determine the SC assembly status is often a challenge. This happens with biopsy or tissue samples that are small or have to be divided for multiple analyses, with cell cultures that have slow growth or come from microfluidic devices, with some primary cultures or rare cells, or when the effect of particular costly treatments has to be analyzed (with nanoparticles, very expensive compounds, etc.). In these cases, an efficient and easy-to-apply method is required. This paper presents a method adapted to obtain enriched mitochondrial fractions from small amounts of cells or tissues to analyze the structure and function of mitochondrial SCs by native electrophoresis followed by in-gel activity assays or western blot.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung der Dynamik des oxidativen Phosphorylierungssystems und der mitochondrialen Rolle bei Gesundheit und Krankheit

This protocol describes a technique for the analysis of respiratory supercomplexes when only small amounts of samples are available.

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Schnelle Isolierung von Mitoribosome von HEK Zellen

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben