L'obiettivo generale di questa procedura è quello di purificare i ribosomi dai mitocondri delle linee cellulari umane su larga scala che è sufficiente per gli studi strutturali. Questo metodo di purificazione ribosoma mitocondriale consente la caratterizzazione di complessi traslanti, mutanti, assiemi di controllo qualità e intermedi di subunità mitoribosomiale. Questi possono essere usati per rispondere a domande chiave sulla sintesi proteica nei mitocondri.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che la cavitazione dell'azoto viene utilizzata per la llisi cellulare e solo 10-10 cellule di coltura sono necessarie per preparare mitoribosomes per la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Questa tecnica può portare alla scoperta di nuovi componenti dei macchinari di traduzione dei mitocondri e può essere ulteriormente utilizzata per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del cancro. Dopo aver coltivato le cellule HEK293S secondo il protocollo di testo, raccogliere due tubi da un litro di cellule per centrifugazione a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per sette minuti.
Decantare con cura il supernatante e rimescolare rapidamente ogni pellet in 100 millilitri di PBS. Quindi, mettere in comune le cellule e centrifugare la sospensione a 1.200 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, dopo aver accuratamente decantato il supernatante, pesare il pellet.
Quindi, utilizzare 120 millilitri di buffer MIB per ripreposirlo e lasciare che le celle rimorsipendate si gonfino nella stanza fredda per 20 minuti. Trasferire le cellule gonfiate in una camera di cavitazione dell'azoto pre-raffreddata sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 45 millilitri di buffer SM4 alle celle.
Fissare la camera di cavitazione dell'azoto e riempirla con azoto fino a quando la pressione raggiunge i 500 PSI. Quindi, chiudere i rubinetti e tenerlo sul ghiaccio per 20 minuti. Il metodo di lisi cellulare della cavitazione dell'azoto previene lo stress fisico esterno sulle cellule, evita danni da calore agli organelli e il gas azoto protegge le cellule dall'ossidazione.
Inoltre, è un metodo altamente riproducibile. Rilasciare lentamente la pressione nella camera e raccogliere il lisato. Quindi, per rimuovere i detriti cellulari e i nuclei, centrifugare il materiale lisci a 800 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Raccogli il supernatante versarlo attraverso un pezzo piegato di stoffa di mussola in un becher tenuto sul ghiaccio. Non scartare il pellet. Resuspend il pellet in 90 millilitri di tampone MiBSM.
Quindi, utilizzando un omogeneizzatore in vetro teflon verso il basso, omogeneizzare il campione e ripetere la centrifugazione a 800 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Ancora una volta, raccogli il supernatante versarlo attraverso un pezzo piegato di stoffa di mussola in un becher tenuto sul ghiaccio. Quindi, combina questo supernatante con il primo supernatante.
Centrifugare il campione a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, raccogli il supernatante come prima. Dopo aver scartato il pellet, centrifugare il supernatante contenente mitocondri grezzi a 10.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.
Lavare con cura qualsiasi pellet sciolto senza disturbare la porzione stretta. Quindi, utilizzare 10 millilitri di tampone MiBSM per rimodere il pellet stretto. Aggiungere 200 unità di DNA privo di RNasi al campione per rimuovere il DNA genomico e ruotare il tubo su un rullo nella stanza fredda per 20 minuti per digerire uniformemente il campione.
Centrifugare il campione a 10.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti e utilizzare due millilitri di tampone SEM per rimorsi il pellet. Caricare l'intera sospensione mitocondriale sopra il gradiente di saccarosio. Dopo aver ruotato la sfumatura in base al protocollo di testo, utilizzando una pipetta di trasferimento, raccogliere attentamente la banda marrone che migra all'interfaccia del 32% e del 60% di saccarosio.
Questo protocollo utilizza la cavitazione dell'azoto per rompere le cellule. Una volta padroneggiato, un isolamento su larga scala di mitocondri altamente puri e intatti può essere fatto entro nove ore e può essere facilmente modificato e adattato per diversi tipi di cellule e squame. Dopo aver scongelato i mitocondri congelati sul ghiaccio, aggiungere due volumi di tampone dilisi a tre millilitri di mitocondri.
Mescolare immediatamente invertendo il tubo più volte. Utilizzare un piccolo omogeneizzatore in vetro teflon per assistere con lisi e incubare l'omogeneato sul ghiaccio per cinque-10 minuti per completare la reazione. Centrifugare il litolato a 30.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti per rimuovere il materiale insolubile.
Quindi, raccogliere attentamente il supernatante e scartare il pellet. Ripetere la centrifugazione per garantire il chiarimento del supernatante. Quindi, raccogliere attentamente il supernatante e scartare il pellet.
Per ogni millilitro di materiale lysed, preparare un cuscino di saccarosio in un tubo ultra chiaro TLA-120.2 aggiungendo 0,4 millilitri di cuscino di saccarosio ai tubi. Strato circa un millilitro di mitocondri lusingati su ogni cuscino di saccarosio con conseguente rapporto lysato-cuscino di 2,5 a uno. Quindi, centrifugare il campione in un rotore TLA-120.2 a 231, 550 volte g e quattro gradi Celsius per 45 minuti.
Scartare il supernatante e utilizzare 100 microlitri del tampone di sospensione per risciacquare il tubo e rimuovere il saccarosio residuo. Resostigliere i pellet e combinarli in un totale di 100 microlitri di tampone di sospensione. Durante la sospensione del pellet del cuscino, è essenziale eseguire sul ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione e anche per evitare la schiuma del campione al fine di garantire l'integrità strutturale dei ribosomi mitocondriali.
Vortice il campione a bassa velocità per 30 secondi per sciogliere gli aggregati rimanenti e centrifugare i tubi a 17, 949 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Raccogliere con cura il supernatante e ripetere la centrifugazione. Dopo aver misurato l'assorbimento di mitoribosome ad A260, caricare l'intero campione su un singolo tubo lineare di gradiente di saccarosio.
Centrifugare il campione in un rotore TLS-55 a 213, 626 volte g e quattro gradi Celsius per 120 minuti. Per frazionare la sfumatura, forare il fondo del tubo e raccogliere il campione per quanto riguarda la caduta in una piastra da 96 po '. La purificazione mitoriboo non dovrebbe richiedere più di sette ore per una quantità sufficiente di mitoribosomei.
Come dimostrato in questo gradiente di saccarosio discontinuo, i mitocondri purificati migrano verso la banda inferiore marrone all'interfaccia del 32-60%. A seguito della separazione dei mitoriboomi dai complessi mitocondriali solubili su un gradiente di saccarosio, vengono identificate due principali popolazioni mitoribosomiali, il monosomatico 55S e la grande subunità 39S. La presenza della grande frazione subunità suggerisce che le cellule vengono raccolte in uno stato di divisione attiva.
Questo pannello mostra una micrografia con il campione di un picco monosomatico due con un ingrandimento calibrato di 1,23 angstrom per pixel. Di seguito sono riportati i dati dopo l'elaborazione iniziale che rivelano monosomi intatti. Infine, una ricostruzione 3D monosoma è illustrata in questo pannello.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare mitoriboomi umani intatti per studi strutturali e biochimici. Il nostro protocollo offre preparazioni finali di alta qualità che potrebbero essere estrapolate ad altre macromolecole mitocondriali.
