Este estudo foi financiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL- 103542, e Distinguished Trailblazer Award O BCH da Fundação Anesthesia Research para CAP.

Preparação <ol><li> Prepare 1 M K-HEPES da Solução (ajustar o pH para 7,2 com KOH). </li><li> Prepare 0,5 M K-EGTA da Solução (ajustar o pH para 8,0 com KOH). </li><li> Prepare 1 M KH 2 PO 4 da solução. </li><li> Prepare 1 M MgCl2 da solução. </li><li> Preparar tampão de homogeneização (pH 7,2) 300 mM de sacarose, 10 mM de K-HEPES, e 1 mM de K-EGTA. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar tampão de respiração de 250 mM de sacarose, 2 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de MgCl2, 20 mM de K-HEPES (pH 7,2) e 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0). Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare PBS 10x da solução por dissolução de 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, e 2,4 g de KH 2 PO 4 em 1 L duplo H2O destilada (pH 7,4). </li><li> Prepare 1x PBS por pipetagem de 100 ml de 10x PBS em 1 L duplo H2O destilada </li><li> Prepare a Subtilisina A Stock por pesagem de 4 mg de Subtilisina A empara um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -20 ° C até o uso. </li><li> Preparar por pesagem da BSA a 20 mg de BSA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -20 ° C até o uso. </li></ol> Isolamento mitocondrial (Figura 1) <ol><li> Imediatamente antes do isolamento, dissolver Subtilisina A em 1 ml de tampão de homogeneização. </li><li> Imediatamente antes do isolamento, dissolver de BSA em 1 ml de tampão de homogeneização. </li><li> Recolher duas amostras de tecido fresco utilizando um perfurador 6 milímetros amostra de biópsia e armazenar em 1x PBS num tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo. </li><li> Transferir os dois perfuradores 6 mm de tecido para um tubo de dissociação C contendo 5 ml de tampão de homogeneização arrefecida com gelo. </li><li> Homogeneizar o tecido, ajustando o tubo de dissociação C no Dissociator tecido e selecione a pré-definido ciclo isolamento mitocondrial (60 seg homogeneização). </li><li> Retire o tubo de dissociação C para um balde de gelo. </li><li> Adicionar 250 mL de uma solução de estoque Subtilisin aohomogeneizado, misturar por inversão e incubar o homogeneizado em gelo durante 10 min. </li><li> Colocar um filtro de malha de 40 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo. </li><li> Adicionar 250 ul de BSA preparada de fresco da Solução ao filtrado e misturar por inversão. Nota: Ignore essa etapa se a determinação da proteína mitocondrial é necessária. </li><li> Colocar um filtro de 40 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo. </li><li> Colocar um filtro de 10 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, e pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo. </li><li> Transferir o filtrado para dois pré-refrigerada tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e centrifugue a 9000 xg durante 10 min a4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e re-suspender e combinar pelotas em 1 ml de gelo frio Respiração Buffer. </li></ol> ATP Assay Nota: Para determinar a actividade metabólica da mitocôndria isolada de um ensaio de luminescência de ATP pode ser realizada utilizando um kit de ensaio de ATP. O protocolo, e os reagentes foram os padrões fornecidos no kit de ensaio. Um resumo do processo é descrito abaixo. <ol><li> Equilibrar reagentes para RT. </li><li> Preparar 10 mM de ATP da solução através da dissolução de ATP sedimento liofilizado em 1170 mL de água duplamente destilada. Guarde ATP padrão da solução e amostras mitocondriais preparadas no gelo. </li><li> Adicionar 5 ml de solução de tampão de substrato para um frasco de solução de substrato liofilizado. Misture delicadamente e coloque no escuro. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de respiração de todos os poços de uma preta, de fundo opaco, placa de 96 poços. </li><li> Adicionar 10 ul de mitocôndrias das amostras preparadas a cada poço ofa preta, de fundo opaco, placa de 96 poços. Nota: As amostras são colocadas em placas em triplicado. Inclua uma linha para os padrões e três poços para o controle negativo (Respiração Buffer). </li><li> Adicionar 50 ul de solução de lise de células de mamíferos a todos os poços, incluindo padrões e controlos. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C por 5 min em um agitador orbital a 125 rpm. </li><li> Durante a incubação preparar padrões de ATP em concentrações de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM e 0,0001 mM de ATP a partir de ATP 10 mM da solução. Padrão das lojas no gelo. </li><li> Após a incubação, adicionar 10 ul de ATP padrão aos poços correspondentes como indicado na placa de mapa. Nota: Os padrões são realizadas em duplicata. </li><li> Adicionar 50 ul da solução de substrato a cada poço reconstituído. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C num agitador orbital durante 5 minutos a 125 rpm. </li><li> Abra o software Gen5 1.11 em um computador ligado com o espectrofotômetro. </li><li> Em &quot;Criar um novo item &quot;, clique em&quot; Experiment &quot;. </li><li> Clique em &quot;protocolo padrão&quot;. Clique em &quot;Ok&quot;. </li><li> Na coluna da esquerda, selecione &quot;Protocolo&quot;, depois em &quot;Procedimento&quot;. </li><li> Selecione &quot;Delay&quot;. Defina a 0:10:00. Clique em &quot;Ok&quot;. </li><li> Selecione &quot;Ler&quot;. Selecione &quot;luminescência&quot; do menu suspenso. Ajuste outras definições para o seguinte: Leia tipo Endpoint, Tempo de Integração 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Sets 1, Emissão Hole, Ótica posição, Sensibilidade 100, Top Probe Desvio vertical 1,00 milímetros. </li><li> Quando a placa está pronta para ser analisada, clique no ícone &quot;Leia Plate&quot; na linha superior. Clique em &quot;Read&quot;. Quando o espectrofotômetro abrir, colocar a placa na bandeja com poço A1 no canto superior esquerdo. Uma caixa com a temperatura vai abrir. Clique em &quot;Read&quot;. Nota: Os valores mais elevados correlacionam-se com os níveis de ATP aumento e maior atividade metabólica. </li></ol>

<ol>
	<li>van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+factors+in+apoptosis:+a+Russian+roulette+with+more+than+one+bullet.">The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet.</a> Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+hub+of+cellular+Ca2++signaling.">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).</li><li>Chan, D. 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R., Hoerr, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+cell+structure+by+freeze-drying+method;+preparation+and+properties+of+mitochondria.">Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria.</a> Anat Rec. 60, 449-455 (1934).</li><li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation+II.+Experimental+procedures+and+results.">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li><li>Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li><li>Ernster, L., Schtaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+a+historical+Review.">Mitochondria: a historical Review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies.">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).</li><li>Fern&#225;ndez-Vizarra, E., Ferr&#237;n, G., P&#233;rez-Martos, A., Fern&#225;ndez-Silva, P., Zeviani, M., Enr&#237;quez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3.3,+Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation.">Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2001).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Gostimskaya, I., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+highly+coupled+rat+heart+mitochondria.">Preparation of highly coupled rat heart mitochondria.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury.">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).</li><li>McCully, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+isolated+mitochondria+during+early+reperfusion+for+cardioprotection.">Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).</li><li>Olson, M. S., Von Korff, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+endogenous+substrates+of+isolated+rabbit+heart+mitochondria+during+storage.">Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage.</a> J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).</li><li>Diepart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+measuring+oxygen+consumption+in+tumor+cells+in+vitro.">Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro.</a> Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes institucionais vigentes. Não temos interesses financeiros competitivos para divulgar.

Para isolar com sucesso mitocôndrias que utilizam este protocolo é fundamental para manter todas as soluções e amostras de tecido em gelo para preservar a viabilidade mitocondrial. Mesmo quando mantidos em gelo, as mitocôndrias isoladas irá exibir uma diminuição na actividade funcional ao longo do tempo 19. Recomendamos que todas as soluções e adições ser pré-preparado. Nós pré-pesar e armazenar Subtilisina A em alíquotas de 4 mg em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga e armazená-las a -20 ° ...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51682">Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.</a> An optional step was added to step 7 of the &#39;Mitochondrial Isolation&#39; section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.

Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

As mitocôndrias existem em todas as células do corpo, excepto as células vermelhas do sangue e são envolvidos num grande número de importantes processos celulares e metabólicas 1-4. Devido a estas várias funções, dano mitocondrial pode ter efeitos prejudiciais 3. A fim de investigar a função mitocondrial e disfunção de vários métodos de isolamento mitocondriais foram descritos. Os primeiros relatos publicados de data isolamento mitocondrial à década de 1940 5-8. A primeira tentativa documentada demonstrado isolamento mitocondrial por trituração do tecido do fígado, num almofariz, seguido por centrifugação de uma solução de sal de 5,8 a baixa velocidade. Mais tarde, outros grupos expandiu o procedimento original e demonstrou fraccionamento de tecido com base na centrifugação diferencial 6-8. Estes métodos iniciais formaram a base das técnicas atuais que muitas vezes incorporam homogeneização e / ou centrifugação diferencial 9-15. O número de homogenizatiem passos de centrifugação e varia entre protocolos. Estes passos repetitivos aumentar o tempo para o isolamento mitocondrial e, finalmente, reduzir a viabilidade. Além disso, a homogeneização manual pode causar danos e inconsistentes resultados mitocondriais se não for devidamente controlado 10,16. Recentemente, foi utilizado homogeneização e centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias para transplante no tecido do miocárdio 17,18. Este procedimento de isolamento demorado necessário cerca de 90 min e a aplicabilidade clínica deste método era, portanto, limitado. Para possibilitar a utilização terapêutica aguda em tratamentos clínicos e cirúrgicos, desenvolvemos um procedimento de isolamento mitocondrial rápido que pode ser realizada em menos de 30 min. Os principais benefícios deste protocolo são de que a dissociação do tecido padronizado permite uniforme e consistente homogeneização do tecido que não é facilmente alcançada com homogeneização manual. Em additião, o uso de filtração diferencial em lugar de centrifugação diferencial elimina demorado e passos de centrifugação repetitivas que permitam o isolamento de mitocôndrias mais rápida competentes altamente purificadas, viáveis ​​e respiratória. A capacidade de isolar mitocôndrias competentes viáveis ​​e de respiração, em menos de 30 min permite a aplicabilidade clínica. Este protocolo de isolamento tem potencial para uso em cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) e outros procedimentos terapêuticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:377px;">Sucrose</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">84100</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Substilsin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P2173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:377px;">ATPlite Luminescence Assay System, 
			1000 Assay Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 mL Conical Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40 &#956;m Nylon Filters</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyl Biotech</td>
			<td>120-005-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 mm biopsy punch</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 &#956;m Pluristrainer</td>
			<td>Pluriselect</td>
			<td>43-500-10-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Centrifuge 5415C</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5415C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GentleMACS Dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyl Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well plates, tissue culture treated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rotomax 120 orbital shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Synergy H4 Hybrid Multi-Mode 
			&#160;Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multisizer 4 Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxytherm System</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration

Métodos de isolamento mitocondriais descritas anteriormente, utilizando centrifugação diferencial e / ou centrifugação em gradiente de Ficoll exigir de 60 a 100 min para completar. Descreve-se um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de mamífero, utilizando um tecido comercial Dissociator filtração e diferencial. Neste protocolo, homogeneização manual é substituído por ciclo de homogeneização padronizada do Dissociator tecido. Isto permite uma uniforme e consistente homogeneização de tecido que não é facilmente conseguido com a homogeneização manual. Após a dissociação de tecidos, o produto homogeneizado é filtrado através de filtros de nylon de malha, o que elimina os passos de centrifugação repetitivas. Como resultado, o isolamento mitocondrial pode ser realizada em menos de 30 min. Este protocolo de isolamento rende aproximadamente 2 x 10 10 mitocôndrias competentes viáveis ​​e respiratória de 0,18 ± 0,04 g (peso húmido) de uma amostra de tecido.

A figura delinear os passos processuais no isolamento de mitocôndrias utilizando dissociação do tecido e filtração diferencial está representada na Figura 1. Tempo processual total é inferior a 30 min. As amostras de tecido foram obtidas utilizando um punch de 6 mm. O peso do tecido era de 0,18 ± 0,04 g (peso molhado). O número de mitocôndrias isoladas, como determinado por contagem de tamanho de partícula foi de 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mi...

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Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é &lt;30 min, em comparação com 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

rapid-isolation-purification-mitochondria-for-transplantation-tissue

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Biology

37.7K visualizações.  Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School.  Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é 