Questo metodo permette la visualizzazione in tempo reale di diversi eventi, che si svolgono nel midollo osseo del topo cranico, come i megacariociti, estendendo le proplatelet all'interno dei vasi sinusoidi. Il vantaggio principale di questa tecnica è un intervento chirurgico minore necessario per ridurre al minimo la reazione infiammatoria, consentendo una visualizzazione in vivo degli eventi nelle condizioni quasi di fabbrica. Per iniziare, trasportare il mouse nella sala immagini.
Accendere il microscopio e il computer e impostare i parametri richiesti. Una volta che il mouse è completamente anestetizzato, posizionare il mouse su una piastra riscaldata, riscaldata a 37 gradi Celsius per tutte le successive manipolazioni, radersi la testa e la gola del mouse e applicare il gel sugli occhi per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse sulla schiena e fissare le gambe anteriori con nastro chirurgico per allungare la gola.
Dopo aver disinfettato la gola, fare un'incisione da 0,7 a 1 centimetro sulla vena giugulare destra o sinistra usando le forbici e allungare il tessuto connettivo adiacente per esporre la vena del giocoliere esterno sulla parte superiore del muscolo pettorale. Riempire il catetere con soluzione fisiologica calda e sterile. Penetrare il catetere attraverso il muscolo pettorale e quindi inserire il catetere nella vena.
Rimuovere delicatamente l'ago, collegare la siringa con i traccianti fluorescenti e iniettare il volume morto del catetere. Posizionare una goccia di colla chirurgica per stabilizzare il catetere. Riportare con attenzione il mouse in posizione prona.
Disinfettare il cuoio capelluto con etanolo al 70% con un asciugamano di carta mentre si rimuovono i capelli sciolti. Utilizzare forbici e pinzette sterili per fare un'incisione a forma di T sulla linea mediana fino a un centimetro tra le orecchie sul cuoio capelluto per esporre il calvario. Esporre il cranio con una pinzetta, quindi utilizzare forbici e pinzette per rimuovere con cura il periosteo.
Utilizzare un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione fisiologica per rimuovere tutto il periosteo e qualsiasi detrito o capello che potrebbe alterare l'imaging. Risciacquare il cranio con soluzione salina per rimuovere eventuali tracce di sangue e asciugare rapidamente l'osso con un batuffolo di cotone. Applicare il gel di colla sull'anello, posizionare l'anello sull'osso esposto e mantenerlo per alcuni secondi per consentire all'anello di attaccarsi saldamente al cranio.
Inumidire leggermente il cranio con un batuffolo di cotone soluzione salina. Preparare la pasta dentale siliconica mescolando accuratamente i componenti blu e giallo in un rapporto uno a uno. Sigillare l'anello applicando la pasta dentale per evitare perdite durante l'imaging.
Rimuovere con attenzione qualsiasi pasta dentale o colla che potrebbe essere entrata nell'anello. Quindi riempire l'anello con soluzione salina per controllare la perdita. Posiziona il mouse sul supporto e metti un impacco piegato sotto la testa dell'animale per sollevare la testa e impedire il distacco dell'anello dal cranio quando è attaccato al supporto.
Avvitare l'anello sul supporto del blocco. Posizionare il supporto e il gruppo del mouse nella camera riscaldata del microscopio. Impostare le lunghezze d'onda laser appropriate per i quattro quattro scelti e il recupero delle luci emesse.
Utilizzando il catetere inter juggler iniettare 50 microlitri di soluzione micromolare 0,2 del tracciante fluorescente per etichettare la vascolarizzazione. Posizionare lo stadio del microscopio con il supporto e il mouse sotto l'obiettivo del microscopio. Assicurarsi che l'anello sia sempre pieno di soluzione salina e riempirlo se necessario e immergere l'obiettivo e la soluzione salina.
Utilizzare l'epifluorescenza per localizzare i vasi del midollo osseo e osservare i megacariociti allineati lungo i vasi sinusoidi. Per le acquisizioni lunghe, imposta un'acquisizione spazio-temporale 3D con un'immagine da 384 x 384 pixel utilizzando uno scanner di risonanza Hertz da otto chili e la modalità bidirezionale. Utilizza la media di linea con una buona risoluzione, quindi scegli la dimensione del passo Z ottimizzata e imposta l'intervallo di tempo necessario prima di iniziare l'acquisizione.
Per acquisizioni brevi e rapide, scegli un tipo di acquisizione spazio-temporale e riduci al minimo le dimensioni dell'immagine. Se necessario, regolare l'immagine sulla nave ruotando il campo di imaging. Utilizzare la massima velocità di scansione disponibile e la scansione bidirezionale.
Riduci al minimo la media delle linee per trovare il compromesso ottimale tra definizione dell'immagine e rapidità dell'acquisizione. Acquisisci un solo piano Z e riduci al minimo l'intervallo di tempo per l'acquisizione. Per misurare la velocità piastrinica dovrebbero essere sufficienti da 10 a 20 secondi di acquisizione.
Il tracciante fluorescente è stato somministrato per via endovenosa per immaginare i vasi sinusoidi del midollo anastomoso nel midollo osseo del cranio, con la direzione del flusso raffigurata dalla freccia. La velocità piastrinica fluorescente è stata registrata in ogni ramo del vaso ed è stata osservata una variazione. I vasi sinusoidi presentano flussi complessi a causa delle anastomosi, con presenza di riflusso del flusso e persino stasi.
Le frecce indicavano la direzione opposta del flusso alla biforcazione. La velocità piastrinica è stata misurata anche per i rami dei vasi sinistro e destro indicati irregolarità nel tempo in ciascun ramo del vaso con fasi di accelerazione, stasi e decelerazione. Sono state osservate diverse morfologie di proplatelet, tra cui proplatelet con margini irregolari, poi proplatelets longed e proplatelet spesse e corte.
Quando i megacariociti estendevano i proplatelet nelle aree di flussi complessi, i proplatelet si spostavano da un ramo del vaso all'altro, secondo la direzione del flusso. Dopo aver interrotto il flusso sanguigno, i proplatelet si sono rilassati e il topo ha subito inaspettatamente un arresto cardiaco, ha indicato l'importanza delle forze idrodinamiche nell'allungamento del proplatelet. La larghezza e la lunghezza dei proplatelet sono state misurate anche con una larghezza media di 5,2 micrometri e una lunghezza massima media di circa 185 micrometri.
Tracciare la lunghezza del proplatelet in funzione del tempo consente la visualizzazione del comportamento dei proplatelet durante le fasi di allungamento, stasi o persino retrazione. È stata osservata la velocità media di allungamento di circa 10 micrometri al minuto. L'installazione del catetere, ha permesso l'iniezione di farmaci per studiare gli effetti sulla formazione di proplatelet o altri eventi di interesse in tempo reale.
