La funzione mitocondriale è fondamentale per l'autori rinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche. L'attività mitocondriale è un riflettore del potenziale della membrana mitocondriale interna, che può essere misurato da TMRM, un colorante cationico fluorescente a cellule permeante. Le pompe efflux xenobiotiche sono altamente attive in HSC e causano l'estrusione TMRM.
Il principale vantaggio di questo protocollo, è la correzione di questo effetto, utilizzando Verapamil, un inibitore delle pompe efflux. Inizia isolando il midollo osseo dai femore del topo. Usa un paio di forcep e forbici affilate per tagliare le due zampe posteriori.
Quindi fai un piccolo snip nella pelle ventrale del topo e allungalo. Estrarre il femore e la tibia, facendo attenzione a non spodestiare le teste del femore, e posizionare le ossa in una piastra a sei po ', riempita con 1,5 millilitri di tampone di colorazione. Rimuovere i muscoli dalle ossa e tagliare le estremità delle ossa, permettendo al midollo osseo di uscire.
Posizionare le ossa pulite in nuovi pozzi, con 1,5 millilitri di tampone di colorazione. Quindi, sciacquare il midollo osseo con una siringa da tre millilitri e un ago calibro 25, fino a quando l'osso diventa bianco. Raccogliere tutte le cellule in un tubo da 1,5 millilitri e centrifugarle per cinque minuti a 180 volte G, quindi scartare il supernatante.
Resostigliere con cura il pellet in 300 microlitri di tampone di lisciviamento ACK ghiacciato e mettere le cellule sul ghiaccio per un minuto. Quindi disattivare immediatamente la lisi aggiungendo un millilitro di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule per cinque minuti a 180 volte G.Resuspend il pellet cellulare, che dovrebbe apparire bianco, in un millilitro di tampone di colorazione.
Filtrare le celle utilizzando un tappo filtrante cellulare, con una rete di nylon da 35 micrometri, per ottenere cellule mononucleari. Inizia preparando il cocktail di lignaggio e gli anticorpi coniugati al fluoroforo, secondo le indicazioni manoscritte. Tieni gli anticorpi sul ghiaccio e protetti dalla luce.
Quindi, centrifugare il campione per cinque minuti a 180 volte G e scartare il supernatante. Aggiungere 400 microlitri del cocktail di lignaggio e quattro microlitri di anticorpi biotinilati CD135 al pellet cellulare e vortice la miscela. Quindi incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, lavare il campione aggiungendo tre millilitri di tampone di colorazione, facendolo girare per cinque minuti a 180 volte G e scartando il supernatante. Quindi aggiungere 400 microlitri di soluzione anticorpale e vortice la miscela. Incubarlo sul ghiaccio per altri 30 minuti e ripetere il lavaggio con il tampone di colorazione.
Per preparare la soluzione di colorazione TMRM, aggiungere 2,2 microlitri di soluzione di stock TMRM e 1,1 microlitri di Verapamil, a 1,1 millilitri di terreno di coltura ematopoietico privo di siero, con trombopoietina e fattore di cellule staminali. Riprendono il midollo osseo in un millilitro della soluzione di colorazione TMRM, vortice rapidamente e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Filtrare il campione utilizzando un tappo filtrante cellulare, con una rete di nylon da 35 micrometri, per evitare di intasare il citometro a flusso.
Quindi aggiungere un microlitro di DAPI e procedere con la citometria del flusso. Eseguire il campione di midollo osseo e acquisire almeno un milione di eventi. Quindi mostra le cellule mononucleari del midollo osseo vivo in un grafico per il blu pacifico, per identificare le frazioni lin-negative e lin-positive CD135.
Tracciate la frazione lin-negativa per APC/Cy7 rispetto a PE/Cy7 per identificare il progenitore multipotente o la frazione MPP. Quindi tracciare la frazione MPP per APC rispetto a PerCP/Cy5.5, per identificare la cellula staminale ematopoietica o la frazione HSC. Visualizzate la frazione HSC per FITC, o CD34, per dividerla in frazioni HSC e CD34 positive HSC e CD34 positive di CD34.
Infine acquisire l'intensità TMRM in ogni popolazione. Per assicurarsi che la colorazione TMRM abbia funzionato correttamente, aggiungere un microlitro di FCCP al campione, per una concentrazione finale di un millimolare, e incubarlo a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi acquisire un milione di eventi.
Dopo l'aggiunta di FCCP, l'intensità TMRM dovrebbe essere drasticamente aumentata. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale in varie popolazioni cellulari, con colorante TMRM. È stato dimostrato che la presenza di PBS e FBS nel mezzo di coltura influisce sull'intensità del segnale TMRM.
Quindi è importante eseguire la colorazione TMRM in un mezzo di espansione privo di siero. Le cellule staminali ematopoietiche esprimono alti livelli di attività delle pompe efflux xenobiotiche che estrudono il colorante TMRM. Quindi i profili TMRM variano anche in presenza di Verapamil o Cyclosporin H, che bloccano le pompe.
Per verificare l'accuratezza della colorazione TMRM, FCCP può essere quello di depolarizzare i mitocondri e ridurre l'intensità TMRM. Questo protocollo può essere facilmente adattato per lo studio dell'HSC con un diverso colorante potenziale a membrana mitocondriale, tra cui TMRE o JC-1. Così come altri coloranti mitocondriali come MitoTracker o MitoSOX.
Le criticità ereditate dalla diversa attività delle pompe efflux tra la popolazione di midollo osseo sono state evidenziate solo di recente. Questo protocollo mira quindi a ridurre la discrepanza tra i risultati precedenti.
