Riconosciamo il sostegno di borse di studio NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, della Fondazione Oak e il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa.

NOTA: Dichiarazione etica: Tutte le ricerche sugli animali vertebrati è stata eseguita in conformità protocolli approvati dal Pannello di Amministrazione di Stanford in laboratorio Animal Care (APLAC). 1. Preparazione <ol><li> Consentire 10 ml di mezzi di separazione gradiente di densità cellulare disponibile in commercio (che contiene polysucrose e sodio diatrizoato, regolate ad una densità di 1.077 g / ml) per venire a RT in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Preparare citometria a flusso (FACS) tampone con 1x tampone fosfato salino (PBS) e siero fetale bovino 2% (FCS). Prelevare un&#39;aliquota di 50 ml e mantenere tale aliquota a TA per uso durante il supporto separazione cellulare passaggio gradiente di densità. </li><li> Avere un secchio di ghiaccio pronto a mantenere il tessuto isolati e le cellule durante la procedura di isolamento. </li></ol> 2. Preparare Culture Media <ol><li> Preparare i media basale: MEM (mezzo essenziale minimo), senza rosso fenolo (500 ml), glutammato (1x), FCS (10x), 10.000 unità / ml penicillin (1x). </li><li> Filtro dei media basale con un filtro da 0,22 micron. </li><li> Preparare supporti macrofagi induzione di midollo osseo: <ol><li> Introdurre 50 ml della media basale preparate al punto 2.1. </li><li> Aggiungi prostaglandina E2 (PGE2, il sig 352,465 g / mol) a 10 -7 M concentrazione finale. </li><li> Aggiungi macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) a 10 ng / ml. </li><li> Non filtrare la soluzione finale di midollo osseo macrofagi stimolante media. </li></ol></li><li> Preparare supporti induzione degli osteoclasti: <ol><li> Introdurre 50 ml della media basale preparate al punto 2.1. </li><li> Aggiungi prostaglandina E2 (PGE2, il sig 352,465 g / mol) a 10 -7 M concentrazione finale </li><li> Aggiungi macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) a 10 ng / ml. </li><li> Aggiungere RANKL a 10 ng / ml. </li><li> Non filtrare la soluzione finale dei media induzione osteoclasti. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento di Midollo Osseo <ol><li> Euthanize uno C57BL / 6 del mouseutilizzando il metodo di anidride carbonica inalazione, seguita da dislocazione cervicale. NOTA: I roditori devono essere sacrificati da personale specializzato con le necessarie tecniche, attrezzature e agenti. </li><li> Posizionare e fissare il mouse su una tavola di dissezione e spruzzare con il 70% di alcol. </li><li> Sezionare dei femori, tibie, omeri e della colonna vertebrale. <ol><li> Inizia con il mouse in posizione supina. Fare un&#39;incisione verticale lungo l&#39;arto inferiore e iniziare dissezione lungo la lunghezza del femore e della tibia dividendo allegati tessuti molli. Infine, dislocare le ossa del ginocchio e dell&#39;anca liberare ossa completamente dallo scheletro. </li><li> Avanti a fare un&#39;incisione lungo la lunghezza dell&#39;arto superiore per isolare l&#39;omero. Dislocare l&#39;omero alle articolazioni della spalla e del gomito da dissezione dei tessuti molli capsulare. </li><li> Infine, ruotare il mouse, in modo che il mouse giace prona. Eseguire un&#39;incisione cutanea lungo la lunghezza della colonna vertebrale, sulla linea mediana. Osservare il morbido paravertebraletessuto su ciascun lato della colonna vertebrale e incise lungo il bordo ossea della colonna vertebrale, dissezione attraverso la massa di tessuto molle paravertebrale. Usando una forbice, fare un taglio orizzontale attraverso la spina dorsale alla base del collo, e alla fine della spina dorsale, appena prossimale all&#39;inserimento coda, liberando la colonna vertebrale dall&#39;attaccamento tessuti molli. </li></ol></li><li> Una volta che le ossa sono raccolte, tenerli in tampone FACS sul ghiaccio. </li><li> Utilizzare carta velina per pulire muscolare e dei tessuti molli dalle ossa. </li><li> Posizionare le ossa pulite in un pestello e mortaio con 3 ml di tampone FACS. </li><li> Schiacciare le ossa delicatamente pestello e mortaio. </li><li> Aspirare il fluido macchiato di sangue e il trasferimento in una provetta da 50 ml conica facendo passare la soluzione attraverso un filtro cella 70 micron. </li><li> Aggiungere 5 ml FACS tampone per l&#39;osso schiacciato e schiacciare ulteriormente. Anche in questo caso, rimuovere il liquido con una pipetta e trasferire alla provetta conica da 50 ml attraverso un filtro 70 micron. </li><li> In genere schiacciare ossa TWIce per tre volte in tampone FACS fresco, utilizzando un mortaio e pestello, ogni volta aggiungendo altri 5 ml di tampone FACS fresco, finché il fluido non macchia rossa. </li><li> Centrifugare la soluzione midollo osseo a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per produrre un pellet di cellule. </li></ol> 4. Separazione gradiente di cellule del midollo osseo <ol><li> Aspirare il surnatante e risospendere in 10 ml di tampone FACS (mantenuto a temperatura ambiente). </li><li> Prendete il tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di mezzi di separazione gradiente di densità cellulare disponibile in commercio (RT). </li><li> Strato la soluzione midollo osseo sul supporto di separazione cellulare gradiente di densità. Fate questo lentamente utilizzando una pipetta elettrico. Angolo della punta della pipetta contro la superficie interna nella parte superiore della provetta conica e inclinare il tubo conico di circa 30 °. Utilizzando una bassa velocità impostata sulla pipetta, espellere lentamente la soluzione midollo osseo in modo da non disturbare il supporto separazione cellulare gradiente di densità. NOTA: Alla fine non ci saràuna chiara definizione tra le due soluzioni (soluzioni cellulare e soluzione dei media densità di separazione cellulare gradiente). </li><li> Utilizzando una centrifuga RT, centrifugare i mezzi di separazione cellulare gradiente di densità e soluzione di cellule in una centrifuga equilibrata a 200 xg per 15 min. Inoltre, rimuovere accelerazione e decelerazione sul centrifuga per assicurare un&#39;adeguata separazione di fase utilizzando il gradiente di densità mezzi di separazione cellulare gradiente. </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare lo strato centrale nuvoloso che contiene le cellule del midollo osseo di interesse. </li><li> Trasferire queste cellule in un nuovo tubo conico. Aggiungere 20 ml di tampone FACS supplementare (tenuti in ghiaccio) per lavare le cellule. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per produrre un pellet di cellule. </li><li> Risospendere il pellet di cellule finale di 1 ml di macrofagi stimolare supporti per consentire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol> 5. Conteggio delle cellule <ol><li> Prendere 10 ml di soluzione di cellule e mescolarecon 10 ml di trypan blu. Carico 10 microlitri della miscela risultante su un emocitometro e ottenere il numero di cellule per ml di soluzione. </li></ol> 6. Coltura cellulare <ol><li> Mettere 2 ml di macrofagi stimolare i media in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Aggiungere 200.000 cellule in ciascun pozzetto. NOTA: Nella nostra esperienza, la densità delle cellule-placcatura è uno dei requisiti più importanti per un adeguato coltura in vitro degli osteoclasti. </li><li> Agitare delicatamente la piastra e posto in un incubatore regolare a 37 ° C. </li><li> Non cambiare il supporto per 3 giorni. </li><li> Dopo 3 giorni di macrofagi stimolante mezzi, cambiare i media a supporto degli osteoclasti. </li><li> D&#39;ora in avanti, cambiare i media al giorno per 5-7 giorni, a quel punto, di grandi dimensioni, gli osteoclasti multinucleate dovrebbe essere visibile sulla piastra di coltura. </li></ol> 7. La colorazione con tartrato resistente fosfatasi acida (TRAP) <ol><li> Dopo 5-7 giorni di in vitro cultura, aspirare il supporto dalla cultura bene. </li><li> Lavare i pozzetti delicatamente con 1x PBS per tre volte. </li><li> Fissare le cellule aggiungendo soluzione di paraformaldeide al 4% e lasciare per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Durante questo tempo, preparare la macchia TRAP (disponibile in commercio) pre-riscaldamento a 37 ° C. </li><li> Dopo 1 ora in paraformaldeide, aspirare via paraformaldeide e lavare delicatamente 3 volte con PBS 1x. </li><li> Aggiungere 1 ml di colorazione TRAP preriscaldata in ciascun pozzetto della piastra da colorare. </li><li> Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 ora, al riparo dalla luce. </li><li> Dopo 1 ora, aspirare la macchia TRAP. </li><li> Lavare i pozzetti per 3 volte con acqua deionizzata pre-riscaldato. </li><li> Contrasto del bene con ematossilina di Gill (ATTENZIONE) per 1-2 min. </li><li> Osteoclasti immagine utilizzando la microscopia in campo chiaro. </li><li> Lavare i pozzetti con acqua deionizzata fino ad un adeguato intensità del colore della macchia si ottiene, in genere quando i nuclei appaiono blue. </li></ol> 8. osteoclasti riassorbimento Assay <ol><li> Utilizzare un polistirene a 24 pozzetti piatto cultura commercialmente disponibile che è pre-rivestita con uno substrato osso o un rivestimento di fosfato di calcio cristallino inorganico. </li><li> Mettere 2 ml di macrofagi stimolare i media in tutti i pozzetti. </li><li> Aggiungere 200.000 appena isolate cellule di midollo osseo ottenuti alla fine del passaggio 2 in ciascun pozzetto. </li><li> Agitare delicatamente la piastra prima della collocazione in un incubatore a 37 ° C per 3 giorni. </li><li> Il giorno 3, cambiare i mezzi di comunicazione ai media la differenziazione degli osteoclasti. </li><li> Eseguire le modifiche dei media ogni giorno con i media differenziazione degli osteoclasti per 5-7 giorni. </li></ol> 9. Quantificazione delle attività degli osteoclasti riassorbimento <ol><li> Dopo 5-7 giorni di coltura in vitro in mezzi differenziazione degli osteoclasti su un substrato mineralizzata, analizzare la superficie mineralizzata, come descritto di seguito, per valutare la capacità di osteoclasti a formare resorptisu pozzi, un indicatore dell&#39;attività osteoclastica. </li><li> Aspirare i media dalla piastra test riassorbimento e aggiungere 100 ml di soluzione di candeggina al 10% in ogni pozzetto. </li><li> Incubare le cellule con la soluzione di candeggina al 10% per 15 minuti a RT. </li><li> Lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata. </li><li> Aspirare l&#39;eventuale acqua residua e scrollarsi di dosso l&#39;acqua in eccesso dalla piastra e lasciare asciugare all&#39;aria per 3-5 ore. </li><li> Controcolorare la piastra con un kit di colorazione di Von Kossa disponibile in commercio per consentire la più agevole la visualizzazione del substrato non-riassorbito. </li><li> Utilizzare la microscopia in campo chiaro a prendere le immagini di parti rappresentative della superficie riassorbito. </li><li> Utilizzando immagine software di analisi, calcolare la percentuale di superficie riassorbita per consentire la quantificazione dell&#39;attività osteoclastica riassorbimento. </li></ol>

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Nessuno degli autori ha divulgazione o conflitto di interesse da dichiarare.

La capacità di isolare facilmente e coltivare un gran numero di osteoclasti in vitro è stato responsabile per aver contribuito a promuovere la comprensione della biologia dell&#39;osso e delle malattie degli osteoclasti-mediata. Era l&#39;identificazione di RANKL che portano a questo, quando è stato recentemente identificato come il principale regolatore della formazione degli osteoclasti, differenziamento e la sopravvivenza 16-18. E &#39;stata la nostra esperienza che...

Il rimodellamento osseo è dinamico e prevede l&#39;accoppiamento della formazione ossea con riassorbimento osseo 1. Questo processo strettamente regolato è responsabile del mantenimento dello scheletro durante omeostasi normale, e in risposta a lesioni e malattie. Gli osteoclasti sono cellule multinucleate, unici che sono in grado di riassorbimento sia le matrici organiche e inorganiche di osso. Gli osteoclasti sono derivati ​​dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo 2-5. Anomalie nella funzione o formazione di osteoclasti può provocare una varietà di patologie cliniche, incluse condizioni comuni come l&#39;osteoporosi. La capacità di generare osteoclasti in vitro ha permesso significativi progressi nella nostra comprensione della biologia dell&#39;osso 6. Di conseguenza, i nuovi agenti terapeutici stanno emergendo per curare le malattie degli osteoclasti correlate che sono responsabili di morbilità e mortalità significative 7 </sup&gt;. Manutenzione omeostatico della massa ossea e la forza richiede l&#39;azione concertata degli osteoblasti che formano l&#39;osso e osteoclasti che riassorbono l&#39;osso 8,9. Osso omeostasi è alterata in un certo numero di malattie, compreso postmenopausale, in cui l&#39;aumento dell&#39;attività degli osteoclasti porta alla perdita patogenicità di massa ossea e densità 10. Con l&#39;aumento della disponibilità di transgenici modelli murini di malattie umane, non vi è più possibilità di decifrare il ruolo degli osteoclasti nelle malattie delle ossa umane 11-13. Numerosi protocolli per tecniche di coltura degli osteoclasti appaiono in letteratura, con molte varianti descritte 9,12,14. Xing e colleghi descrivono la metodologia simile al protocollo descritto di seguito, nella loro descrizione di saggi osteoclastogenico da cellule del midollo osseo di topo. Tuttavia, per liberare le cellule del midollo osseo seguenti raccolta delle ossa lunghe, Xing et al. Lavare la cavità midollare con α-MEM multimediale completo14. Catalfamo esamina l&#39;effetto dell&#39;iperglicemia sulla funzione degli osteoclasti e descrive un metodo in cui tutte le cellule mobilizzano midollo osseo lavaggio sono coltivate per 24 ore, a questo punto le cellule non aderenti sono scartati 12, una tecnica usata anche da Boyle et al . 9 Questi protocolli precedentemente pubblicati richiedono la pratica di lavaggio del midollo osseo, una pratica noiosa, che introduce anche il rischio di ferirsi e la perdita di preziose midollo osseo, come si deve tagliare entrambe le estremità dell&#39;osso. Il protocollo, che descriveremo, implementa l&#39;utilizzo di un mortaio e pestello per isolare osteoclasti, che è simile al metodo di isolamento macrofagi descritto da Weischenfeldt et al. 15 La nostra esperienza, tuttavia, è che l&#39;isolamento degli osteoclasti e la coltura in vitro utilizzando tecniche precedentemente pubblicati dà risultati variabili in termini di produzione di osteoclasti, che spesso portain una incapacità di coltivare osteoclasti. Pertanto, abbiamo ideato un protocollo che consente l&#39;isolamento uniforme del midollo osseo di topo per produrre un gran numero di osteoclasti multinucleate in vitro, con una resa approssimativa del 70-80% delle cellule inizialmente placcati formando macrofagi e successivamente osteoclasti, in presenza di mezzi di induzione degli osteoclasti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate che sono derivati ​​dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo. La loro capacità unica di riassorbire sia le matrici organiche e inorganiche di osso significa che essi svolgono un ruolo chiave nella regolazione del rimodellamento scheletrico. Insieme, osteoblasti ed osteoclasti sono responsabili del processo di accoppiamento dinamico che coinvolge sia il riassorbimento osseo e la formazione ossea agendo insieme per mantenere lo scheletro normale durante salute e di malattia. Poiché la cella di ossa riassorbimento principale del corpo, cambiamenti nella differenziazione o funzione osteoclasti possono provocare effetti profondi nel corpo. Malattie associate con la funzione degli osteoclasti alterata può variare in gravità da malattia neonatale letale a causa di fallimento per formare uno spazio osseo per emopoiesi, per osservare più comunemente patologie come l&#39;osteoporosi, in cui un eccessivo riassorbimento osseo degli osteoclasti predispone alle fratture formazione. ent &quot;&gt; La capacità di isolare osteoclasti in quantità elevata in vitro ha permesso significativi progressi nella comprensione del ciclo di rimodellamento osseo e ha aperto la strada per la scoperta di nuove strategie terapeutiche che combattere tali malattie. Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare osteoclasti da midollo osseo di topo che consentiranno di ottenere un gran numero di osteoclasti.

<html> Lo scopo di questo metodo era di isolare facilmente un gran numero di osteoclasti in vitro, tipicamente in una settimana. Isolamento di successo di un gran numero di osteoclasti è stata confermata usando tartrato-resistente all&#39;acido fosfatasi colorazione (Figura 1A). Grandi osteoclasti sono visualizzati come grandi cellule viola con più nuclei (tipicamente ≥ 3 nuclei). Usando questo protocollo, è comune per isolare osteoclasti con ben 30 nuclei per osteoclasti (Figura 1B...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l&#39;osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l&#39;isolamento, la coltivazione e quantificare l&#39;attività degli osteoclasti in vitro.

Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

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24.0K Views.  Stanford University School of Medicine.  Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro. 

Video: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Ricerca

Biologia

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing delle cellule ematopoietiche del midollo osseo

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the proplatelet formation using in vitro-differentiated megakaryocytes; however, there is an increasing evidence that conventional culture systems do not faithfully recapitulate the differentiation/maturation process that takes places inside the bone marrow. In this manuscript, we present an explant method initially described in 1956 by Thi&#233;ry and Bessis to visualize megakaryocytes which have matured in their native environment, thus circumventing potential artifacts and misinterpretations. Fresh bone marrows are collected by flushing the femurs of mice, sliced into 0.5 mm cross sections, and placed in an incubation chamber at 37 &#176;C containing a physiological buffer. Megakaryocytes become gradually visible at the explant periphery and are observed up to 6 hours under an inverted microscope coupled to a video camera. Over time, megakaryocytes change their shape, with some cells having a spherical form and others developing thick extensions or extending many thin proplatelets with extensive branching. Both qualitative and quantitative investigations are carried out. This method has the advantage of being simple, reproducible, and fast as numerous megakaryocytes are present, and classically half of them form proplatelets in 6 hours compared to 4 days for cultured mouse megakaryocytes. In addition to the study of mutant mice, an interesting application of this method is the straightforward evaluation of the pharmacological agents on the proplatelet extension process, without interfering with the differentiation process that may occur in cultures.

Here, we detail the bone marrow explant method, from sample preparation to microscopic slide analysis, to evaluate the ability of megakaryocytes which have differentiated in their physiological environment to form proplatelets.

Dinamica di formazione dei proplatelet degli espianti di midollo osseo fresco del topo

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...