Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo dell'immuno-metabolismo. Il vantaggio di questa tecnica è che consente la quantificazione di mitocondri o lisosomi in singole cellule viventi, in una miscela complessa di diversi tipi di cellule. Questo metodo per lo studio delle cellule T e B può anche essere applicato a molti altri tipi di cellule come macrofagi, cellule dendritiche o qualsiasi cellula primaria raccolta da un campione di tessuto.
La procedura sarà dimostrata da Chin-Wen Wei, uno studente laureato del mio laboratorio. Per etichettare gli organelli per la quantificazione, in primo luogo, aggiungere una per dieci alla sesta cellule T del mouse a un tubo fax inferiore rotondo per marcatore. E pellettò le cellule per centrifugazione.
pre-riscaldato a 37 gradi Celsius mezzo di coltura privo di siero per diluire le soluzioni specifiche di stock di sonda organelle alle concentrazioni di lavoro finali nel mezzo. E sospendere di nuovo le cellule in 100 microlitri di colorante sonda per tubo. Successivamente, incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare per il periodo di colorazione appropriato, fermando la reazione alla fine dell'incubazione con un millilitro di tampone fax freddo ghiaccio per tubo.
Quindi, raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione e sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri del supernatante ibridoma 24G2 pretitonato sul ghiaccio. Dopo dieci minuti, aggiungere un millilitro di tampone fax per tubo. Raccogliere le cellule per centrifugazione ed etichettare le cellule con 50 microlitri del cocktail di anticorpi coniugati a fluorescenza pretitorata di interesse.
Aggiungere la concentrazione appropriata in base alla tabella. E tampone fax per 20 minuti sul ghiaccio, protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone fax per tubo.
Raccogliere le cellule per centrifugazione. E sospendere nuovamente le cellule in 300 microlitri di tampone fax integrati con un microgrammo per millilitro di ioduro di propidio. Immediatamente dopo aver aggiunto il contatore nucleare e cromosomico, accendere il computer di analisi del citometro di flusso, il citometro di flusso, il software di acquisizione fax e qualsiasi altro dispositivo accessorio a seconda della piattaforma della macchina.
Eseguire PBS attraverso il sistema per circa un minuto per assicurarsi che la linea di flusso sia riempita con PBS e tampone di lucentezza. Aprire un nuovo esperimento e impostare i parametri del citometro in base alle istruzioni del produttore. Filtrare le celle attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri.
E vortice prima dell'acquisizione di ogni campione per evitare grumi e formazione di farsa. Aprite l'impostazione Compensazione automatica (Auto Compensation) e create grafici a punti per ogni parametro fluorescente. Dopo aver impostato tutte le tensioni, regolare la compensazione e applicare la compensazione ai campioni.
Creare un grafico a dispersione in avanti rispetto a quello laterale e ottimizzare le tensioni in modo che le celle di interesse appaiano all'interno del grafico. Create un plottaggio dell'altezza di dispersione in avanti rispetto a quello in avanti e recintate le singole celle. Creare un'area di dispersione in avanti rispetto al grafico dell'area di dispersione laterale e recintare i linfociti.
Create un'area di dispersione in avanti rispetto al plot di ioduro propidio e recintate le cellule vive. Dopo aver impostato tutte le tensioni, regolare la compensazione e applicare la compensazione ai campioni. Quindi caricare il primo tubo campione, creare i grafici marcatori della superficie cellulare appropriati e raccogliere almeno 1.000 eventi della popolazione di interesse.
Una volta eseguiti tutti i campioni, esportare i dati di flusso per l'analisi successiva. E salvare l'esperimento come modello per preservare le impostazioni e i parametri del citometro per esperimenti simili in futuro. Il contenuto mitocondriale del sito finale è il più basso in una doppia cella T negativa, il picco a doppio stadio negativo due e tre e leggermente la diminuzione nel doppio stadio negativo quattro.
Con timociti doppi positivi che dimostrano un numero maggiore di mitocondri rispetto ai timociti positivi singoli CD4 e CD8, suggerendo che il contenuto mitocondriale fluttua durante lo sviluppo. I timociti positivi singoli CD4 e CD8 mostrano una maggiore intensità di fluorescenza media mitocondriale rispetto alle cellule Spleniche CD4 o CD8 T, suggerendo che le cellule T ingenue che ricircolano nell'ambiente sanguigno ricco di ossigeno hanno una massa mitocondriale ancora più bassa rispetto ai timociti. È interessante notare che questa riduzione del contenuto mitocondriale è più evidente nel CD8 rispetto al lignaggio cellulare CD4 T, e l'attivazione della cellula T diminuisce ulteriormente la presenza di questi organelli.
In tutte le popolazioni di timociti si osservano contenuti lisosomiali relativamente bassi, ma rilevabili, con una presenza più prominente in due timociti negativi. In periferia, un numero relativamente elevato di lisosomi viene rilevato in memoria e nelle cellule T positive CD8 dell'effettore. La combinazione di coloranti specifici per organelli e marcatore superficiale con citometria a flusso è un modo potente per caratterizzare lo stato metabolico delle cellule in una miscela complessa.
Ulteriori coloranti specifici per organelli possono essere utilizzati per rilevare reticolo endoplasmatico, vacuolo autofagico o altri compartimenti di interesse intracellulari.
