Il presente protocollo può servire come nuova piattaforma per lo studio e lo sviluppo di portatori di farmaci per indirizzare i siti di malattie all'interno del sistema vascolare umano. Il principale vantaggio della nostra tecnica è che consente lo studio dell'accumulo di portatori di farmaci all'interno del modello arterioso 3d replicato dall'uomo. Questo viene fatto in condizioni fisiologiche, incluso il flusso sanguigno.
Questo approccio può essere utilizzato per ottimizzare i portatori di farmaci per la diagnosi e il trattamento di una vasta gamma di malattie vascolari, comprese le arterie aterosclerotiche. Inizia selezionando immagini da pazienti o geometrie precedentemente studiate della biforcazione dell'arteria carotide umana e utilizzando le immagini per creare un modello di progettazione computer-aided dello stampo. Utilizzare una stampante 3d per stampare il design, rimuovere i supporti di stampa temporanei e risciacquare il modello con acetone prima di utilizzare carta vetrata per lucidare e levigare gli stampi, in particolare le aree da cui sono stati tagliati i supporti.
Dopo la levigatura, sciacquare il modello con alcool isopropile per rimuovere eventuali polvere di plastica e lasciare asciugare il modello in una cappa chimica per due o tre ore. Per facilitare una facile disillusione della plastica, spruzzare il modello con lacca trasparente tre volte, consentendo alla lacca di asciugare all'aria per un'ora tra un'applicazione e l'altra. Dopo l'ultima applicazione, utilizzare un pennello e una lacca per incollare strisce rettangolari trasparenti di plastica liscia su ciascun lato del telaio, in modo che il modello venga sigillato nella parte inferiore e aperto nella parte superiore.
Dopo l'asciugatura, posizionare lo stampo in un essiccatore e lentamente scarsa soluzione di gomma siliconica preparata al momento nell'apertura. Rimuovere le bolle d'aria fino a quando la miscela non è chiara e lasciare lo stampo all'interno dell'essiccatore durante la notte. Quando la miscela è completamente asciutta, rimuovere i vetrini trasparenti e immergere il modello in acetone assoluto per 48 ore in una cappa chimica fino a quando la plastica non è completamente sciolta.
Per evaporare l'acetone intrappolato prima della semina cellulare, incubare il modello per almeno quattro giorni a 60 gradi Celsius. Per seminare il modello con le cellule, sterilizzare prima il modello e due connettori di ingresso e uscita dalla luce ultravioletta o dalla radiazione. Dopo 20 minuti, utilizzare una siringa per rivestire il modello con quattro millilitri di 100 microgrammi per millilitro fibronectin per due ore a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di fibronectina attraverso l'uscita e lavare il modello con mezzo cellulare endoteliale. Utilizzare una siringa per riempire il modello risciacquato con quattro millilitri di un 2,5 per 10 alla sesta cellula endoteliale per millilitro di sospensione cellulare media endoteliale e fissare il modello a un rotatore all'interno di un incubatore di coltura cellulare 48 ore a una rivoluzione al minuto, per garantire una distribuzione omogenea delle cellule. Alla fine dell'incubazione, utilizzare una siringa di plastica da 10 millilitri per lavare il modello con PBS.
Fissare le celle per 15 minuti, con quattro millilitri di paraformaldeide al 4%, quindi lavare il modello tre volte con PBS come dimostrato prima di conservare il modello a quattro gradi Celsius in quattro millilitri di PBS fresco. Prima di iniziare un esperimento, utilizzare i tubi di uscita per collegare uno smorzatore di oscillazione collegato a una pompa peristaltica all'ingresso del modello carotide coltivato e utilizzare un pezzo di tubo per unire le due prese. Quindi dividere i tubi di uscita su due tubi di uscita e aggiungere un morsetto di plastica a ciascun tubo.
Per impostare una configurazione a circuito chiuso, aggiungere 300 millilitri di PBS a un contenitore a circuito chiuso e posizionare un tubo di ingresso e un tubo di uscita all'interno del contenitore riempito di PBS con i morsetti B e C aperti, rispettivamente, quindi posizionare l'altro tubo di ingresso in un contenitore di lavaggio da un litro riempito con acqua distillata e l'altro tubo di uscita in un contenitore di rifiuti vuoto da un litro con i morsetti A e D chiusi, rispettivamente. Posizionare il modello carotide al microscopio stereo, impostare la pompa su una portata iniziale di 10 giri al minuto, con cinque incrementi di giro al minuto ogni quattro-cinque minuti. Quando la portata raggiunge i 100 giri al minuto, aggiungere 1,6 microgrammi di particelle fluorescenti di polistirolo carbossilato per millilitro di PBS al contenitore a circuito chiuso e osservare la regione di interesse ogni 10 secondi per un'ora e mezza.
Per impostare una configurazione a circuito aperto, aprire i morsetti A e D e chiudere immediatamente i morsetti B e C. Lascia che la maggior parte dell'acqua fluisa dal contenitore di lavaggio al contenitore dei rifiuti a 100 giri al minuto. Prima che l'acqua sia stata completamente trasferita, arrestare la pompa e chiudere i morsetti del tubo prima dell'ingresso e dopo l'uscita del modello carotide.
Utilizzando i filtri appropriati, acquisire immagini del modello nella regione di interesse per mostrare la deposizione e l'adesione delle particelle alle cellule. Al termine dell'esperimento, utilizzare un codice software personalizzato per analizzare le immagini acquisite nella regione di interesse, immettere il nome dell'immagine e impostare la soglia stimata. Quindi eseguire il codice.
Ispezionare l'immagine risultante e il numero contato di particelle nell'immagine. In questa analisi rappresentativa, le micrografie fotografiche di cellule endoteliali coltivate sementi in un modello di arteria carotide 3d possono essere osservate mediante imaging microscopico confocale a campo luminoso e fluorescenza. Le perle di vetro fluorescenti di 10 micron diametro, sementi nel modello 3d presentavano un modello di ricircolo, suggerendo un'imitazione riuscita delle condizioni fisiologiche all'interno del modello.
L'imaging della deposizione di particelle ha rivelato che un livello più elevato di adesione delle particelle alle cellule è stato osservato al di fuori dell'area di ricircolo dove la sollecitazione di taglio della parete era alta. Seguendo questo protocollo, possono essere esplorate particelle funzionalizzate con una cinetica di legame specifica e una coltura fondamentale di cellule all'interno di diversi modelli di arteria umana per migliorare il modello e studiare formulazioni specifiche. Questa tecnica fornisce una nuova piattaforma per lo studio del targeting vascolare dei portatori di farmaci.
Di recente l'abbiamo usato per mostrare come l'additività delle particelle possa essere adattata alle diverse regioni di vasi mascellati.
