We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

NOTA: La cura e la manipolazione sperimentale di tutti i topi in questo documento è stato approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee Cornell University. 1. Impostazione di Chirurgia <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti necessari tramite autoclave o procedure di sterilizzazione approvate. Come minimo, includere un bisturi, forbici, forbici Vanna, pinze, cacciavite del gioielliere, tamponi di cotone, un insieme di divaricatori, l&#39;impianto (Figura 1A) e il suo sistema di erogazione (Figura 1D, E). </li><li> Pulire tutte le superfici, comprese le manopole stereoscopio, con il 70% di etanolo e / o disinfettanti idonei. </li><li> Creare un campo sterile sovrapponendo il stereotax personalizzato (Figura 1D) e da banco circostante con teli sterili. Una piastra elettrica (preferibilmente retroazione controllata) deve essere posto sulla parte superiore della stereotax e sotto i teli sterili. </li></ol> 2. Preparazioneil mouse di Chirurgia <ol><li> Anestetizzare un topo sotto 5% isoflurano / ossigeno in una camera di induzione fino tasso di respirazione rallenta a circa 1 respiro / sec. </li><li> Trasferimento del mouse in un&#39;area intermedia di distanza dal campo sterile, con un cono di continuare l&#39;esposizione isoflurano. Ridurre isoflurano al 2%. Applicare collirio per evitare l&#39;essiccazione della cornea. </li><li> Somministrare glicopirrolato (un farmaco anticolinergico) a 0.05 mg / 100 g del mouse intramuscolare nelle arti posteriori utilizzando 29 - 30 aghi G e 3/10 siringa cc, fornendo circa il 50% del volume di iniezione per ogni arto. NOTA: Glicopirrolato serve per evitare l&#39;accumulo di liquido nei polmoni, mentre il mouse è sotto anestesia. </li><li> Utilizzando tagliatori elettrici, radere una porzione della faccia dorsale del mouse, lunga circa 3 cm di 2 cm di larghezza e centrate sull&#39;arco toracica. Pulire tutti i capelli tagliati ben lontano dalla zona rasata. </li><li> Amministrare i seguenti iniezioni sottocute e distale al rasatapatch con 29 - 30 aghi G e 3/10 siringhe cc: 1 ml / 100 g di mouse 5% di glucosio in soluzione salina (per l&#39;idratazione), 5 mg / kg ketoprofene mouse (un FANS per analgesia), 0,2 mg / kg di mouse desametasone ( uno steroide antinfiammatori per ridurre l&#39;infiammazione). </li><li> Utilizzando tamponi di cotone, effettuare tre lavaggi alternati di iodio e il 70% di etanolo, in attesa 1 min tra lavaggi. </li><li> Somministrare 100 ml di 0,125% bupivacaina (un blocco nervoso periferico) per via sottocutanea con 29-30 aghi G e 3/10 cc siringa al centro della patch rasata per ridurre il dolore al sito di incisione. </li><li> Trasferimento del mouse al stereotax personalizzato (Figura 1D), inserire termometro rettale, e attendere circa 10 minuti per bupivicaina abbia effetto. </li></ol> 3. Esporre e pulire la Dorsale lamine 3 Adiacente Vertebra toracica <ol><li> Usando il bisturi, creare un piccolo (5 mm o meno) incisione sopra le vertebre di interesse (Figura 2A). </li><li&gt; Utilizzando sia pinze o inserendo la punta di forbici chirurgiche e diffondere le maniglie, aumentare la dimensione della apertura nella pelle per dissezione. </li><li> Usando un bisturi o forbici chirurgiche, dissociare delicatamente fascia connettivo tra la pelle e il muscolo sottostante. </li><li> Utilizzare divaricatori per trattenere la pelle, consentendo la più ampia area di lavoro possibile (Figura 2B). Evitare di aumentare il carico sul petto e quindi ostacolare la respirazione. </li><li> Utilizzando un paio di pinze, afferrare il rostrale-più vertebra che sarà esposto attraverso il muscolo sovrastante. Usando un bisturi, tagliare tessuti distanza su entrambi i lati del processo dorsali da ogni 3 vertebre (figura 2c). </li><li> Usando una combinazione di un bisturi, tamponi di cotone, e / o raschietto osso, rimuovere tutto il tessuto sovrastante dal lamine dorsale (Figura 2D). </li><li> Utilizzando le forbici chirurgiche, accuratamente tagliato via i tendini collegati alle vertebre su entrambi Lateral bordi della colonna vertebrale (Figura 2E). </li><li> Usando il bisturi, rimuovere delicatamente più tessuto dai bordi laterali della colonna vertebrale possibile al fine di fornire una superficie di bloccaggio pulita. </li><li> Sbrigliare delicatamente le vertebre di un tessuto molle rimanente con un raschietto osseo e / o tampone di cotone. Tagliare via qualsiasi tessuto incongrua altrove con le forbici chirurgiche (Figura 2F). NOTA: E &#39;essenziale sia per il bloccaggio e l&#39;esecuzione della laminectomia dorsale che le vertebre sono esposti in modo pulito. Un cauterizer può essere utile nel controllo successiva sanguinamento. </li><li> Spostare divaricatori per trattenere il tessuto circostante la colonna vertebrale in aggiunta alla pelle (Figura 2F). </li><li> Fissare le barre laterali di impianto per le punte sui posti di consegna e caricare questi in post-titolari (come in Figura 1E). </li><li> Bloccare il 3 vertebre utilizzando le barre laterali, applicando una pressione sufficiente per tenere securely (Figura 2G, H). Utilizzare pinze per contribuire a garantire un livello di bloccaggio del 3 vertebre. Si noti che diversi tentativi possono essere necessarie. Assicurarsi che le barre laterali sono sia di livello e parallelamente prima di eseguire la laminectomia. </li><li> Pulire e asciugare la superficie dorsale delle vertebre bloccato utilizzando tamponi di cotone. </li></ol> 4. Eseguire una dorsale laminectomia <ol><li> Inserire le punte delle forbici Vännäs nello spazio epidurale della vertebra bloccato mediale e stringere le impugnature leggermente; se l&#39;osso è asciutto, dovrebbe crepa lungo la lunghezza della lamina dorsale. Ripetere questa procedura sul lato controlaterale per rilasciare la lamina. </li><li> Presa delicatamente la lamina sciolto dal processo dorsale con una pinza, tagliare attentamente tutta tessuto connettivo alle estremità rostrale e caudale della lamina e toglierlo. </li><li> Usando 0,9% soluzione salina e / o artificiale cerebrale liquido spinale (ACSF), lavare via ogni overlyi sangueng il midollo spinale. Usare tamponi di cotone per assorbire il liquido in eccesso. </li><li> Utilizzando forbici Vännäs, ritagliare con attenzione i bordi laterali della spina dorsale alle barre laterali della protesi. Anche in questo caso, lavare via e controllare il sanguinamento con tamponi di cotone e saline / ACSF. </li><li> Nel caso in cui una porzione di periostio è staccato e sovrasta il midollo spinale, rimuovere delicatamente questo tessuto utilizzando tamponi di cotone e / o un 29 - ago G 30. Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale in questa parte della procedura. Non confondere il periostio sciolto con la dura madre strettamente avvolto. </li><li> Cautela, sigillare i bordi rimanenti esposte della osso con uno o entrambi acrilico e cianoacrilato dentale (Figura 2I). Fare attenzione a non consentire le colle di scorrere sul midollo spinale esposto. </li></ol> 5. Seal la Camera <ol><li> Posizionare la piastra superiore con attenzione in modo che i 4 slot si allineano con i 4 fori sulle barre laterali e l&#39;apertura sovrappone lo spin espostoal cavo (Figura 1B e 2J). </li><li> Utilizzando un cacciavite il gioielliere, avviare accuratamente la prima vite, stabilizzando l&#39;albero del cacciavite con un altro paio di pinze. Non serrare la vite in questa fase, ma inserirla in modo che i primi fili vengono impegnati. Ripetere questa procedura per gli altri 3 viti. NOTA: È utile usare titanio o altre pinze non magnetizzabili per posizionare le viti in questa fase. </li><li> Con tutti i 4 viti in atto, serrare ogni vite turno dalla stessa quantità di piccoli incrementi fino viti sono saldamente fissate (Figura 2K). Si noti che non è insolito per la piastra superiore di flettersi durante questo processo. Fare attenzione a non stringere le viti troppo, come la testa della vite può rompere e l&#39;eccessiva pressione al ribasso sloggiare il morsetto e / o provocare lesioni del midollo spinale. </li><li> Utilizzare un elastomero siliconico per riempire lo spazio tra il midollo spinale e la finestra di vetro. Perché does non producono acido acetico durante la polimerizzazione, utilizzare KwikSil marca elastomero e punte di miscelazione. Applicare una porzione abbondante di silicone al midollo spinale esposto. Fare attenzione a sbarazzarsi di qualsiasi silicone contenente bolle d&#39;aria dalla punta di miscelazione prima dell&#39;applicazione al midollo spinale. </li><li> Lavorando in fretta, premere delicatamente a 5 mm # 0 coprioggetto nel riquadro nella piastra superiore. Applicare una pressione sufficiente a comprimere gradualmente l&#39;elastomero liquido circondare il midollo spinale, ma non provocare compressione midollare (Figura 2L). Tempo di presa per l&#39;elastomero è di circa 90 sec, in modo da assicurarsi il vetrino viene applicato rapidamente. </li><li> In caso di tenuta fallito, attendere che l&#39;elastomero ha fissato, rimuovere delicatamente dall&#39;impianto con una pinza, e ripetere 5,4-5,5. </li><li> Coprire i bordi di elastomero agglomerato con dentale acrilico / cianoacrilato e rispettare l&#39;osso circostante il più possibile per evitare l&#39;elastomero sposti sulla superficie del midollo spinale. </li><li> Rimuovere divaricatori e tirare la pelle attorno al bordo dell&#39;impianto. Utilizzando cianoacrilato, aderire alla pelle ai bordi dell&#39;impianto (Figura 2M, N). </li><li> Inserisci # 0-80 - 1/4 &quot;set viti nelle ali della piastra superiore (Figura 1C e 2 O). </li><li> Utilizzando acrilico dentale, sigillare eventuali lacune nelle fessure delle viti della piastra superiore (Figura 2P). </li></ol> 6. Cura postoperatoria <ol><li> Rimuovere animali da anestesia e posto in una grande gabbia pulita. Assicurarsi che la gabbia è sufficientemente grande che la camera non intoppo su nulla (come il dip a V per una bottiglia di acqua e / o cibo) nel corso del normale locomozione tutta la gabbia. NOTA: Una gabbia di ratto standard è l&#39;ideale. </li><li> Posizionare la gabbia su una superficie riscaldata mentre l&#39;animale recupera. Non restituire il mouse per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. </li><li> Controllare Beha animaliVior entro 1 - 2 ore postoperation per i segni di dolore o angoscia e l&#39;integrità dell&#39;impianto. NOTA: In condizioni normali, l&#39;animale deve essere in grado di deambulare con modeste perturbazioni al movimento. </li><li> Continuare a controllare animale ogni 8-12 ore per il primo 72 ore, misurare il peso e il comportamento di monitoraggio. Verificare che gli animali sono attivi e mobili durante la notte. Cibo umido in forma di terra Chow mescolato con acqua o gel nutrizionali, pellets Chow, e l&#39;acqua potabile dovrebbe essere fornita a livello del suolo. Ulteriori idratazione con iniezioni sottocutanee o intraperiotoneal dovrebbe essere fornita, se necessario. </li><li> Somministrare 5 mg / kg del mouse ketoprofene e 0,2 mg / kg per via sottocutanea del mouse desametasone a 24 e 48 punti di tempo ora, dopo l&#39;intervento. Inoltre, ,005-,010 mg / 100 g mouse deve essere somministrato ogni 8 ore per iniezione sottocutanea per 72 hr. </li></ol> 7. In Vivo Imaging <ol><li> Anestetizzare un topo sotto5% isoflurano / ossigeno in una camera di induzione frequenza respiratoria rallenta fino a circa 1 respiro / sec. </li><li> Trasferire il mouse per il stereotax personalizzato (Figura 1D) con feedback controllato piastra elettrica e inserire il termometro rettale. Ridurre isoflurano al 2%. </li><li> Somministrare glicopirrolato 0,05 mg / 100 g del mouse intramuscolare nelle arti posteriori utilizzando 29 - 30 aghi G e 3/10 siringa cc, fornendo circa il 50% del volume di iniezione per ogni arto. </li><li> Somministrare 1 ml / 100 g del mouse 5% di glucosio (per idratazione sottocutanea) in soluzione salina volta per ora. </li><li> Inserire i titolari camera filettati nei post-titolari utilizzati per la chirurgia (Figura 1F). Regolare l&#39;altezza e girare i posti sulle viti nella piastra superiore. </li><li> Con entrambi i supporti attaccati, elevare i titolari nel post-titolari fino al torace può espandersi liberamente su ispirazione. NOTA: Sia il fermo attaccamento dei titolari e la libera espansione della significan pettoTLY ridurre artefatti di movimento a causa di respirazione. </li><li> Eseguire l&#39;imaging come desiderato. </li><li> Quando l&#39;imaging è completo, posti più bassi, twist off titolari camera, rimuovere termometro rettale, e posto il mouse su una superficie riscaldata per recuperare. Non restituire il mouse per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. </li></ol>

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D., Neusch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+rapid+morphological+reactions+of+astrocytes+towards+focal+lesions+in+an+ALS+mouse+model.">In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model.</a> Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).</li><li>Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

La tecnica dimostrata qui consente ripetute, temporizzata, imaging in vivo del mouse dorsali SC ad molte settimane post operativamente senza la necessità di ulteriori interventi chirurgici. Questa procedura rappresenta un notevole miglioramento rispetto studi di imaging repeat-chirurgia o su approcci istologici portmortem, dove le informazioni sulle dinamiche cellulari è perso. Abbiamo già 30 hanno dimostrato il valore di questa tecnica per lo studio SCI patologia in vivo. La portata massima longitudinale di imaging è stato determinato dalla crescita di un denso tessuto fibroso sulla superficie dorsale del SC. Nel tempo, questa crescita ha portato alla perdita di contrasto e risoluzione. Questa crescita è stata vista anche in preparazioni chirurgiche alternative 31. Aneddoticamente, abbiamo osservato che questa crescita può essere minimizzato lavando accuratamente la superficie dorsale SC per rimuovere i prodotti del sangue, tenuta la superficie dil&#39;osso taglio con cianoacrilato, bordi della camera di tenuta bene con elastomero di silicone, e minimizzando lo spazio interstiziale tra la SC dorsale e il vetro di copertura. Recentemente, un altro approccio simile alla nostra con una camera di policarbonato è stata dimostrata 32. L&#39;uso di policarbonato è vantaggioso poiché è compatibile con X-ray e modalità di imaging acustiche, che non è il caso per i nostri parti in acciaio inossidabile. Tuttavia, con la tecnologia ormai onnipresente di stampanti 3D, parti della camera possono essere fabbricati da un&#39;ampia varietà di materiali per soddisfare esigenze specifiche. Abbiamo recentemente stampato tutte le nostre parti in un chiaro fotopolimero. Uno svantaggio fondamentale di una camera chiusa è l&#39;incapacità di amministrare ripetuti dosaggi di farmaci o coloranti esogeni adatti per l&#39;imaging SC 34. Tuttavia, capitalizzando sulla stabilità meccanica del nostro sistema attuale, abbiamo già usato la nostra camera presente per il successoly ancorare un catetere intratecale collegato ad una porta di iniezione sottocutanea impiantato, che ha permesso per la consegna della droga in diversi punti temporali anche in un sistema di camera chiusa (inedito). Inoltre, a causa della natura modulare della piastra superiore, versioni future di questa preparazione includeranno una camera richiudibile per consentire l&#39;applicazione ripetuta di entrambi gli agenti terapeutici e etichette fluorescenti. È anche possibile prevedere piastre superiori con supporti per la registrazione di elettrodi, inserti ottici e porte per drug delivery. Tali integrazioni sarebbe probabilmente più difficile attuare utilizzando il sistema più minimalista Fenrich et al. 31. In conclusione, la nostra camera offre una piattaforma di gateway su cui diversi esperimenti possono essere basati.

Time-lapse in microscopia vivo negli organismi intatti permette la visualizzazione diretta di processi biologici complessi che sono inaccessibili ad un&#39;analisi tradizionale unico punto-tempo, come immunoistochimica. In particolare, la microscopia multi-fotone (MPM) 1 permette l&#39;imaging in dispersione tessuti, come la neocorteccia roditore, dove è stato raggiunto immagini fino a 2,3 e in eccesso su 4 1 mm. Quando combinato con preparazioni chirurgiche 5-7 in cui un singolo procedimento consente accesso ottico al cervello per settimane o mesi, questi approcci microscopia sono stati utilizzati per studiare processi dinamici nel cervello in stati sani e malati 8-11. Inoltre, sono stati sviluppati protocolli 12,13 che prevedono l&#39;imaging in vivo in sveglio (cioè, non anestetizzati) animali, consentendo cellulari risoluzione imaging funzionale durante saggi comportamentali. Questi protocolli sono stati utilizzati per comparisons di correlata attività neuronale 14, astrociti calcio segnalazione 15 in animali anestetizzati e sveglio, l&#39;identificazione di specifici task-clusters neuronali 16, e la capacità dei neuroni di discriminare posizione dell&#39;oggetto su baffo stimolazione 17. Dato il potenziale di questo approccio per chiarire i meccanismi sani e patologici, time-lapse imaging in vivo è stato applicato al midollo spinale del mouse (SC), consentendo l&#39;identificazione di degenerazione assonale acuta (AAD) come meccanismo malattia 18. Studi successivi effetti di lesioni periferiche su gangli spinali (DRG) assone rigenerazione 19, il ruolo dei vasi sanguigni in assonale rigenerazione 20, chemiotassi gliali in risposta al danno 21, la migrazione delle cellule T in encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) 22, l&#39;attività indagati di microglia 23,24 e astrociti 25 in risposta a amyotrophsclerosi ic laterale (ALS), il ruolo di STAT-3 in sprouting assonale dopo la lesione SC (SCI) 26, e un meccanismo di perdita di assoni e recupero in EAE 27. Nonostante il successo di questi approcci, tutti questi studi sono stati limitati a una singola sessione di imaging, limitando così gli studi di dinamica a breve termine, o altrimenti richiesto ripetute aperture chirurgiche dell&#39;animale in ogni punto di tempo di imaging, limitando il numero di punti di tempo accessibili e aumentando la probabilità di artefatti sperimentali confondenti. Protocolli per questi interventi sono stati pubblicati in precedenza 28,29. Recentemente, abbiamo pubblicato una tecnica 30 per l&#39;impianto di una camera spinale cronica che ha permesso time-lapse MPM immagini nel topo SC su più settimane senza la necessità di interventi di ripetizione. Brevemente, questa preparazione chirurgica inclusa eseguendo laminectomia nella colonna toracica inferiore e l&#39;impianto di una camera di quattro parti. La camera inclusotre parti in acciaio inox custom-lavorati che serrate le vertebre che circonda la laminectomia, ed un vetrino di vetro posto sopra la SC e fissato con elastomero siliconico. Questa tecnica ha permesso per l&#39;imaging di routine ad più di 5 settimane dall&#39;intervento in stati sani e feriti, senza la necessità di interventi di ripetizione. Il numero di punti di tempo di imaging è stato limitato soltanto dalla frequenza alla quale l&#39;animale può tollerare induzione anestetica. Imaging durata era limitata dalla crescita di una fitta, tessuto fibroso sulla superficie del SC. Inoltre, abbiamo verificato che l&#39;impianto chirurgico non ha avuto effetto a lungo termine sulla funzione motoria. Dato che la nostra prima pubblicazione, approcci alternativi che consentano anche di imaging a lungo termine nella SC sono stati descritti altrove 31-33. Questo protocollo dimostra la nostra procedura per impiantare la camera di midollo abbiamo sviluppato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:68px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:201px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">15000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps, scissors, scalpel, etc.</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">multiple&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -magnetic fixator</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -retractor</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-09</td>
			<td>other retractors may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -elastomer</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">feedback controlled heating blanket</td>
			<td style="width:68px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:115px;">Model: TC-1000 Mouse&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Part No. 08-13000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">stereotax</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber holders</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:68px;">Loctite</td>
			<td style="width:115px;">Loctite 495</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8101</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8501</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycopyrrolate</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:68px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ketoprofen</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Elastomer</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Mixing Tips</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIKMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Seguendo la procedura sopra, ogni fase della chirurgia dovrebbe imitare i risultati per ogni fase della chirurgia delineato nella Figura 2. Particolare cura deve essere presa quando si applica l&#39;elastomero siliconico per eliminare le bolle d&#39;aria sotto la lente, o almeno garantire che siano situato alla periferia dell&#39;area di interesse (Figura 2L). Per un chirurgo esperto, le complicanze chirurgiche che richiedono l&#39;eutanasia sia durante l&#39;intervento chirurgico o entro il primo 24 ore dopo l&#39;intervento chirurgico si verificano in circa il 20% delle operazioni. Queste complicazioni più frequentemente derivano dall&#39;eccessiva emorragie tessuti molli o mancata fissare saldamente la camera alla colonna vertebrale. In camere impiantati con successo, la finestra rimane tipicamente otticamente trasparente per più settimane (Figura 3). Nonostante gli sforzi, una opaca, fibrosa, la crescita neoplastica costituisce spesso entro pochi giorni, con conseguente parziale obscuring della finestra (Figura 3C - F, nero linea tratteggiata). Strutture fluorescenti sono difficili da vedere al microscopio 2PEF sotto questo tessuto fibroso. Troviamo una distribuzione bimodale dei risultati, con circa il 50% delle finestre impiantati con successo rimanendo chiaro per più di 5 settimane dopo l&#39;intervento, e circa il 50% diventando offuscato entro 1 - 3 settimane. Per le finestre che rimangono chiare, la maggior parte dei posti all&#39;interno della finestra di esperienza visiva solo un modesto grado di neovascolarizzazione in o al di sopra della dura (Figura 3D - F, asterischi verde), che non ostacola l&#39;imaging 2PEF. Il nostro studio precedente 30 ha mostrato un aumento di microglia, ma non la densità astrocyte sotto la finestra e vertebre adiacenti, indicando lieve infiammazione analogo a quello visto in finestra preparati cranici 5. Nei topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) in un sottogruppo di dorsale radice Ganglia (DRG) neuroni (linea YFPH; Jackson Labs), gli assoni erano chiaramente distinguibili per settimane dopo l&#39;intervento (Figura 4A e b), e fino a quattro mesi in un animale (dati non riportati). I vasi sanguigni (Figura 4A e B) sono stati resi visibili dal retro-orbitale iniezione fluorescente Texas Red etichettato destrano nel plasma sanguigno. Microglia sono stati visualizzati in topi che esprimono GFP in un CX3CR1 topo knock-in (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) attraversato la linea YFPH (Figura 4C). Contrasto e risoluzione deteriorata modestamente nel tempo (Figura 4C) a causa della formazione di una proliferazione fibrosa 30 precedentemente descritto. Abbiamo regolarmente ripreso per 3 ore in una singola sessione, senza mortalità e come spesso come ogni 12 ore. La durata della sessione e frequenza è limitata dalla tolleranza dell&#39;animale per l&#39;induzione di anestesia, in concomitanza con le considerazioni etiche accompagnano dolore e disagio per animali da laboratorio. &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Figura 1. Una suite chirurgica personalizzata facilita consegna camera durante l&#39;impianto e stabilizza la camera durante sessioni di imaging successive. Due barre laterali e una piastra superiore (A) sono montate (B) utilizzando piccole viti nella camera spinale (C). Un tavolo operatorio con posti estensibili (D) consente per la consegna ed il bloccaggio delle barre laterali per le vertebre con spine di tenuta (E). Sessioni di imaging successive invece utilizzano i messaggi filettati internamente per collegare alla camera tramite le viti di fermo sulle ali della protesi (F). Panel b di questa figura è stata modificata da Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 con il permesso di Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> Figura 2. Un laminectomia dorsale è eseguito e una camera di imaging cronica è impiantato per fornire accesso ottico al midollo spinale. La procedura è descritta nel montaggio. Innanzitutto, la pelle (pannelli A, B; sezioni protocollo 3.1- 3.4 -) e muscoli (C; 3,5) vengono retratti per esporre tre vertebre sottostante. Il tessuto sovrastante questi tre vertebre viene rimossa (D, E, F; 3,6-3,10) ei processi laterali sono raschiati pulite prima di essere fissati su entrambi i lati (G, H, 3.12). Attenzione, la lamina dorsale della vertebra centrale è rimosso ei bordi dell&#39;osso sigillato (I </strong&gt;; 4. 6). Una piastra superiore viene applicata (J, 5.1) e le viti fissata in posizione (K; 5.3) per fissare la camera prima di sigillare la camera con elastomero di silicone e vetro di copertura (L; 5.5). Dopo che le spine di consegna sono rimossi (M; 5.8), la pelle è incollato ai lati della camera (M, N, 5,8) e le viti sono inserite nelle ali (O; 5.9). Infine, gli slot delle viti sono sigillati con materiale acrilico dentale (P; 5.10). E il mouse è posto in una gabbia pulita per recuperare <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> Figura 3. Una camera spinale cronica rimane ov otticamente trasparenteer più settimane. Immagini luce bianca del midollo spinale, che vanno da alcuni minuti (A) a tre settimane dopo l&#39;intervento (F). Punti di riferimento vascolari sono identificabili in tutti i tempi (frecce gialle). Piccolo cambiamento è visto in un giorno dopo l&#39;intervento chirurgico (B). Dense proliferazione fibrosa (C - F, delimitata da linea tratteggiata in basso a destra) è presente fin da tre giorni e risultati di offuscamento parziale l&#39;area di esposizione. Neovascolarizzazione Mild (D, E, F, asterischi verdi) è presente, ma non oscura la vascolarizzazione originale in luce bianca o di imaging 2PEF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Figura 4. Una camera spinale cronica consente ripetuto l&#39;imaging multi-photon senza la necessità di interventi di ripetizione. immagini ripetuta di topi transgenici esprimenti YFP in un sottoinsieme di assoni DRG (verdi) nelle funiculi dorsali del midollo spinale e vascolare (rosso) etichettati da intravascolare iniettabile colorante (A, B). L&#39;attività di microglia (malva) può anche essere seguito nel tempo Thy1-YFP / CX3CR1-GFP doppio topi transgenici (C). Mentre assoni e microglia rimangono visibili, il contrasto e la risoluzione declino modestamente nel corso del tempo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

13.9K Views.  Cornell University.  In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati. 

Video: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Ricerca

Neuroscienze

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusion Imaging nel midollo spinale cervicale Rat

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivo Duo-colore metodo di Imaging vascolare dinamica dopo la lesione del midollo spinale contusivi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...