Name: a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord
Uploaded: 2014-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

NOTA: La cura e la manipolazione sperimentale di tutti i topi in questo documento è stato approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee Cornell University. 1. Impostazione di Chirurgia <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti necessari tramite autoclave o procedure di sterilizzazione approvate. Come minimo, includere un bisturi, forbici, forbici Vanna, pinze, cacciavite del gioielliere, tamponi di cotone, un insieme di divaricatori, l&#39;impianto (Figura 1A) e il suo sistema di erogazione (Figura 1D, E). </li><li> Pulire tutte le superfici, comprese le manopole stereoscopio, con il 70% di etanolo e / o disinfettanti idonei. </li><li> Creare un campo sterile sovrapponendo il stereotax personalizzato (Figura 1D) e da banco circostante con teli sterili. Una piastra elettrica (preferibilmente retroazione controllata) deve essere posto sulla parte superiore della stereotax e sotto i teli sterili. </li></ol> 2. Preparazioneil mouse di Chirurgia <ol><li> Anestetizzare un topo sotto 5% isoflurano / ossigeno in una camera di induzione fino tasso di respirazione rallenta a circa 1 respiro / sec. </li><li> Trasferimento del mouse in un&#39;area intermedia di distanza dal campo sterile, con un cono di continuare l&#39;esposizione isoflurano. Ridurre isoflurano al 2%. Applicare collirio per evitare l&#39;essiccazione della cornea. </li><li> Somministrare glicopirrolato (un farmaco anticolinergico) a 0.05 mg / 100 g del mouse intramuscolare nelle arti posteriori utilizzando 29 - 30 aghi G e 3/10 siringa cc, fornendo circa il 50% del volume di iniezione per ogni arto. NOTA: Glicopirrolato serve per evitare l&#39;accumulo di liquido nei polmoni, mentre il mouse è sotto anestesia. </li><li> Utilizzando tagliatori elettrici, radere una porzione della faccia dorsale del mouse, lunga circa 3 cm di 2 cm di larghezza e centrate sull&#39;arco toracica. Pulire tutti i capelli tagliati ben lontano dalla zona rasata. </li><li> Amministrare i seguenti iniezioni sottocute e distale al rasatapatch con 29 - 30 aghi G e 3/10 siringhe cc: 1 ml / 100 g di mouse 5% di glucosio in soluzione salina (per l&#39;idratazione), 5 mg / kg ketoprofene mouse (un FANS per analgesia), 0,2 mg / kg di mouse desametasone ( uno steroide antinfiammatori per ridurre l&#39;infiammazione). </li><li> Utilizzando tamponi di cotone, effettuare tre lavaggi alternati di iodio e il 70% di etanolo, in attesa 1 min tra lavaggi. </li><li> Somministrare 100 ml di 0,125% bupivacaina (un blocco nervoso periferico) per via sottocutanea con 29-30 aghi G e 3/10 cc siringa al centro della patch rasata per ridurre il dolore al sito di incisione. </li><li> Trasferimento del mouse al stereotax personalizzato (Figura 1D), inserire termometro rettale, e attendere circa 10 minuti per bupivicaina abbia effetto. </li></ol> 3. Esporre e pulire la Dorsale lamine 3 Adiacente Vertebra toracica <ol><li> Usando il bisturi, creare un piccolo (5 mm o meno) incisione sopra le vertebre di interesse (Figura 2A). </li><li&gt; Utilizzando sia pinze o inserendo la punta di forbici chirurgiche e diffondere le maniglie, aumentare la dimensione della apertura nella pelle per dissezione. </li><li> Usando un bisturi o forbici chirurgiche, dissociare delicatamente fascia connettivo tra la pelle e il muscolo sottostante. </li><li> Utilizzare divaricatori per trattenere la pelle, consentendo la più ampia area di lavoro possibile (Figura 2B). Evitare di aumentare il carico sul petto e quindi ostacolare la respirazione. </li><li> Utilizzando un paio di pinze, afferrare il rostrale-più vertebra che sarà esposto attraverso il muscolo sovrastante. Usando un bisturi, tagliare tessuti distanza su entrambi i lati del processo dorsali da ogni 3 vertebre (figura 2c). </li><li> Usando una combinazione di un bisturi, tamponi di cotone, e / o raschietto osso, rimuovere tutto il tessuto sovrastante dal lamine dorsale (Figura 2D). </li><li> Utilizzando le forbici chirurgiche, accuratamente tagliato via i tendini collegati alle vertebre su entrambi Lateral bordi della colonna vertebrale (Figura 2E). </li><li> Usando il bisturi, rimuovere delicatamente più tessuto dai bordi laterali della colonna vertebrale possibile al fine di fornire una superficie di bloccaggio pulita. </li><li> Sbrigliare delicatamente le vertebre di un tessuto molle rimanente con un raschietto osseo e / o tampone di cotone. Tagliare via qualsiasi tessuto incongrua altrove con le forbici chirurgiche (Figura 2F). NOTA: E &#39;essenziale sia per il bloccaggio e l&#39;esecuzione della laminectomia dorsale che le vertebre sono esposti in modo pulito. Un cauterizer può essere utile nel controllo successiva sanguinamento. </li><li> Spostare divaricatori per trattenere il tessuto circostante la colonna vertebrale in aggiunta alla pelle (Figura 2F). </li><li> Fissare le barre laterali di impianto per le punte sui posti di consegna e caricare questi in post-titolari (come in Figura 1E). </li><li> Bloccare il 3 vertebre utilizzando le barre laterali, applicando una pressione sufficiente per tenere securely (Figura 2G, H). Utilizzare pinze per contribuire a garantire un livello di bloccaggio del 3 vertebre. Si noti che diversi tentativi possono essere necessarie. Assicurarsi che le barre laterali sono sia di livello e parallelamente prima di eseguire la laminectomia. </li><li> Pulire e asciugare la superficie dorsale delle vertebre bloccato utilizzando tamponi di cotone. </li></ol> 4. Eseguire una dorsale laminectomia <ol><li> Inserire le punte delle forbici Vännäs nello spazio epidurale della vertebra bloccato mediale e stringere le impugnature leggermente; se l&#39;osso è asciutto, dovrebbe crepa lungo la lunghezza della lamina dorsale. Ripetere questa procedura sul lato controlaterale per rilasciare la lamina. </li><li> Presa delicatamente la lamina sciolto dal processo dorsale con una pinza, tagliare attentamente tutta tessuto connettivo alle estremità rostrale e caudale della lamina e toglierlo. </li><li> Usando 0,9% soluzione salina e / o artificiale cerebrale liquido spinale (ACSF), lavare via ogni overlyi sangueng il midollo spinale. Usare tamponi di cotone per assorbire il liquido in eccesso. </li><li> Utilizzando forbici Vännäs, ritagliare con attenzione i bordi laterali della spina dorsale alle barre laterali della protesi. Anche in questo caso, lavare via e controllare il sanguinamento con tamponi di cotone e saline / ACSF. </li><li> Nel caso in cui una porzione di periostio è staccato e sovrasta il midollo spinale, rimuovere delicatamente questo tessuto utilizzando tamponi di cotone e / o un 29 - ago G 30. Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale in questa parte della procedura. Non confondere il periostio sciolto con la dura madre strettamente avvolto. </li><li> Cautela, sigillare i bordi rimanenti esposte della osso con uno o entrambi acrilico e cianoacrilato dentale (Figura 2I). Fare attenzione a non consentire le colle di scorrere sul midollo spinale esposto. </li></ol> 5. Seal la Camera <ol><li> Posizionare la piastra superiore con attenzione in modo che i 4 slot si allineano con i 4 fori sulle barre laterali e l&#39;apertura sovrappone lo spin espostoal cavo (Figura 1B e 2J). </li><li> Utilizzando un cacciavite il gioielliere, avviare accuratamente la prima vite, stabilizzando l&#39;albero del cacciavite con un altro paio di pinze. Non serrare la vite in questa fase, ma inserirla in modo che i primi fili vengono impegnati. Ripetere questa procedura per gli altri 3 viti. NOTA: È utile usare titanio o altre pinze non magnetizzabili per posizionare le viti in questa fase. </li><li> Con tutti i 4 viti in atto, serrare ogni vite turno dalla stessa quantità di piccoli incrementi fino viti sono saldamente fissate (Figura 2K). Si noti che non è insolito per la piastra superiore di flettersi durante questo processo. Fare attenzione a non stringere le viti troppo, come la testa della vite può rompere e l&#39;eccessiva pressione al ribasso sloggiare il morsetto e / o provocare lesioni del midollo spinale. </li><li> Utilizzare un elastomero siliconico per riempire lo spazio tra il midollo spinale e la finestra di vetro. Perché does non producono acido acetico durante la polimerizzazione, utilizzare KwikSil marca elastomero e punte di miscelazione. Applicare una porzione abbondante di silicone al midollo spinale esposto. Fare attenzione a sbarazzarsi di qualsiasi silicone contenente bolle d&#39;aria dalla punta di miscelazione prima dell&#39;applicazione al midollo spinale. </li><li> Lavorando in fretta, premere delicatamente a 5 mm # 0 coprioggetto nel riquadro nella piastra superiore. Applicare una pressione sufficiente a comprimere gradualmente l&#39;elastomero liquido circondare il midollo spinale, ma non provocare compressione midollare (Figura 2L). Tempo di presa per l&#39;elastomero è di circa 90 sec, in modo da assicurarsi il vetrino viene applicato rapidamente. </li><li> In caso di tenuta fallito, attendere che l&#39;elastomero ha fissato, rimuovere delicatamente dall&#39;impianto con una pinza, e ripetere 5,4-5,5. </li><li> Coprire i bordi di elastomero agglomerato con dentale acrilico / cianoacrilato e rispettare l&#39;osso circostante il più possibile per evitare l&#39;elastomero sposti sulla superficie del midollo spinale. </li><li> Rimuovere divaricatori e tirare la pelle attorno al bordo dell&#39;impianto. Utilizzando cianoacrilato, aderire alla pelle ai bordi dell&#39;impianto (Figura 2M, N). </li><li> Inserisci # 0-80 - 1/4 &quot;set viti nelle ali della piastra superiore (Figura 1C e 2 O). </li><li> Utilizzando acrilico dentale, sigillare eventuali lacune nelle fessure delle viti della piastra superiore (Figura 2P). </li></ol> 6. Cura postoperatoria <ol><li> Rimuovere animali da anestesia e posto in una grande gabbia pulita. Assicurarsi che la gabbia è sufficientemente grande che la camera non intoppo su nulla (come il dip a V per una bottiglia di acqua e / o cibo) nel corso del normale locomozione tutta la gabbia. NOTA: Una gabbia di ratto standard è l&#39;ideale. </li><li> Posizionare la gabbia su una superficie riscaldata mentre l&#39;animale recupera. Non restituire il mouse per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. </li><li> Controllare Beha animaliVior entro 1 - 2 ore postoperation per i segni di dolore o angoscia e l&#39;integrità dell&#39;impianto. NOTA: In condizioni normali, l&#39;animale deve essere in grado di deambulare con modeste perturbazioni al movimento. </li><li> Continuare a controllare animale ogni 8-12 ore per il primo 72 ore, misurare il peso e il comportamento di monitoraggio. Verificare che gli animali sono attivi e mobili durante la notte. Cibo umido in forma di terra Chow mescolato con acqua o gel nutrizionali, pellets Chow, e l&#39;acqua potabile dovrebbe essere fornita a livello del suolo. Ulteriori idratazione con iniezioni sottocutanee o intraperiotoneal dovrebbe essere fornita, se necessario. </li><li> Somministrare 5 mg / kg del mouse ketoprofene e 0,2 mg / kg per via sottocutanea del mouse desametasone a 24 e 48 punti di tempo ora, dopo l&#39;intervento. Inoltre, ,005-,010 mg / 100 g mouse deve essere somministrato ogni 8 ore per iniezione sottocutanea per 72 hr. </li></ol> 7. In Vivo Imaging <ol><li> Anestetizzare un topo sotto5% isoflurano / ossigeno in una camera di induzione frequenza respiratoria rallenta fino a circa 1 respiro / sec. </li><li> Trasferire il mouse per il stereotax personalizzato (Figura 1D) con feedback controllato piastra elettrica e inserire il termometro rettale. Ridurre isoflurano al 2%. </li><li> Somministrare glicopirrolato 0,05 mg / 100 g del mouse intramuscolare nelle arti posteriori utilizzando 29 - 30 aghi G e 3/10 siringa cc, fornendo circa il 50% del volume di iniezione per ogni arto. </li><li> Somministrare 1 ml / 100 g del mouse 5% di glucosio (per idratazione sottocutanea) in soluzione salina volta per ora. </li><li> Inserire i titolari camera filettati nei post-titolari utilizzati per la chirurgia (Figura 1F). Regolare l&#39;altezza e girare i posti sulle viti nella piastra superiore. </li><li> Con entrambi i supporti attaccati, elevare i titolari nel post-titolari fino al torace può espandersi liberamente su ispirazione. NOTA: Sia il fermo attaccamento dei titolari e la libera espansione della significan pettoTLY ridurre artefatti di movimento a causa di respirazione. </li><li> Eseguire l&#39;imaging come desiderato. </li><li> Quando l&#39;imaging è completo, posti più bassi, twist off titolari camera, rimuovere termometro rettale, e posto il mouse su una superficie riscaldata per recuperare. Non restituire il mouse per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. </li></ol>

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+to+a+depth+of+1000+&#956;m+in+living+brains+by+use+of+a+Ti:+Al+2+O+3+regenerative+amplifier.">Two-photon imaging to a depth of 1000 &#956;m in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier.</a> Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).</li><li>Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo,+Deep+Tissue+Three-Photon+Imaging+at+the+1700-nm+Spectral+Window.">In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window.</a> Biomedical Optics. 7 (3), (2012).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Lichtman, J. W., DENK, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Big+and+the+Small:+Challenges+of+Imaging+the+Brain's+Circuits.">The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits.</a> Science. 334 (6056), 618-623 (2011).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake,+Mobile+Mice.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Imaging+of+Neural+Activity+in+Awake,+Head-Restrained+Mice.+.">Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. .</a> Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).</li><li>Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats).">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats).</a> Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).</li><li>Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clustering+of+Neurons+in+Motor+Cortex+Determined+by+Cellular+Resolution+Imaging+in+Awake+Behaving+Mice.">Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice.</a> Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).</li><li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).</li><li>Ylera, B., Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-Injured+Adult+Sensory+Neurons+Gain+Regenerative+Competence+upon+a+Lesion+of+Their+Peripheral+Axon.">Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon.</a> Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).</li><li>Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+by+in+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+vascular+and+axonal+networks+in+injured+mouse+spinal+cord.">Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).</li><li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+imaging+reveals+distinct+inflammatory+activity+of+CNS+microglia+versus+PNS+macrophages+in+a+mouse+model+for+ALS.">In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS.</a> Plos One. 6 (3), 17910 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nature Communications. 3, 1227 (2012).</li><li>Dibaj, P., Steffens, H., Zsch&#252;ntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+rapid+morphological+reactions+of+astrocytes+towards+focal+lesions+in+an+ALS+mouse+model.">In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model.</a> Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).</li><li>Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

La tecnica dimostrata qui consente ripetute, temporizzata, imaging in vivo del mouse dorsali SC ad molte settimane post operativamente senza la necessità di ulteriori interventi chirurgici. Questa procedura rappresenta un notevole miglioramento rispetto studi di imaging repeat-chirurgia o su approcci istologici portmortem, dove le informazioni sulle dinamiche cellulari è perso. Abbiamo già 30 hanno dimostrato il valore di questa tecnica per lo studio SCI patologia in vivo. La portata massima longitudinale di imaging è stato determinato dalla crescita di un denso tessuto fibroso sulla superficie dorsale del SC. Nel tempo, questa crescita ha portato alla perdita di contrasto e risoluzione. Questa crescita è stata vista anche in preparazioni chirurgiche alternative 31. Aneddoticamente, abbiamo osservato che questa crescita può essere minimizzato lavando accuratamente la superficie dorsale SC per rimuovere i prodotti del sangue, tenuta la superficie dil&#39;osso taglio con cianoacrilato, bordi della camera di tenuta bene con elastomero di silicone, e minimizzando lo spazio interstiziale tra la SC dorsale e il vetro di copertura. Recentemente, un altro approccio simile alla nostra con una camera di policarbonato è stata dimostrata 32. L&#39;uso di policarbonato è vantaggioso poiché è compatibile con X-ray e modalità di imaging acustiche, che non è il caso per i nostri parti in acciaio inossidabile. Tuttavia, con la tecnologia ormai onnipresente di stampanti 3D, parti della camera possono essere fabbricati da un&#39;ampia varietà di materiali per soddisfare esigenze specifiche. Abbiamo recentemente stampato tutte le nostre parti in un chiaro fotopolimero. Uno svantaggio fondamentale di una camera chiusa è l&#39;incapacità di amministrare ripetuti dosaggi di farmaci o coloranti esogeni adatti per l&#39;imaging SC 34. Tuttavia, capitalizzando sulla stabilità meccanica del nostro sistema attuale, abbiamo già usato la nostra camera presente per il successoly ancorare un catetere intratecale collegato ad una porta di iniezione sottocutanea impiantato, che ha permesso per la consegna della droga in diversi punti temporali anche in un sistema di camera chiusa (inedito). Inoltre, a causa della natura modulare della piastra superiore, versioni future di questa preparazione includeranno una camera richiudibile per consentire l&#39;applicazione ripetuta di entrambi gli agenti terapeutici e etichette fluorescenti. È anche possibile prevedere piastre superiori con supporti per la registrazione di elettrodi, inserti ottici e porte per drug delivery. Tali integrazioni sarebbe probabilmente più difficile attuare utilizzando il sistema più minimalista Fenrich et al. 31. In conclusione, la nostra camera offre una piattaforma di gateway su cui diversi esperimenti possono essere basati.

Time-lapse in microscopia vivo negli organismi intatti permette la visualizzazione diretta di processi biologici complessi che sono inaccessibili ad un&#39;analisi tradizionale unico punto-tempo, come immunoistochimica. In particolare, la microscopia multi-fotone (MPM) 1 permette l&#39;imaging in dispersione tessuti, come la neocorteccia roditore, dove è stato raggiunto immagini fino a 2,3 e in eccesso su 4 1 mm. Quando combinato con preparazioni chirurgiche 5-7 in cui un singolo procedimento consente accesso ottico al cervello per settimane o mesi, questi approcci microscopia sono stati utilizzati per studiare processi dinamici nel cervello in stati sani e malati 8-11. Inoltre, sono stati sviluppati protocolli 12,13 che prevedono l&#39;imaging in vivo in sveglio (cioè, non anestetizzati) animali, consentendo cellulari risoluzione imaging funzionale durante saggi comportamentali. Questi protocolli sono stati utilizzati per comparisons di correlata attività neuronale 14, astrociti calcio segnalazione 15 in animali anestetizzati e sveglio, l&#39;identificazione di specifici task-clusters neuronali 16, e la capacità dei neuroni di discriminare posizione dell&#39;oggetto su baffo stimolazione 17. Dato il potenziale di questo approccio per chiarire i meccanismi sani e patologici, time-lapse imaging in vivo è stato applicato al midollo spinale del mouse (SC), consentendo l&#39;identificazione di degenerazione assonale acuta (AAD) come meccanismo malattia 18. Studi successivi effetti di lesioni periferiche su gangli spinali (DRG) assone rigenerazione 19, il ruolo dei vasi sanguigni in assonale rigenerazione 20, chemiotassi gliali in risposta al danno 21, la migrazione delle cellule T in encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) 22, l&#39;attività indagati di microglia 23,24 e astrociti 25 in risposta a amyotrophsclerosi ic laterale (ALS), il ruolo di STAT-3 in sprouting assonale dopo la lesione SC (SCI) 26, e un meccanismo di perdita di assoni e recupero in EAE 27. Nonostante il successo di questi approcci, tutti questi studi sono stati limitati a una singola sessione di imaging, limitando così gli studi di dinamica a breve termine, o altrimenti richiesto ripetute aperture chirurgiche dell&#39;animale in ogni punto di tempo di imaging, limitando il numero di punti di tempo accessibili e aumentando la probabilità di artefatti sperimentali confondenti. Protocolli per questi interventi sono stati pubblicati in precedenza 28,29. Recentemente, abbiamo pubblicato una tecnica 30 per l&#39;impianto di una camera spinale cronica che ha permesso time-lapse MPM immagini nel topo SC su più settimane senza la necessità di interventi di ripetizione. Brevemente, questa preparazione chirurgica inclusa eseguendo laminectomia nella colonna toracica inferiore e l&#39;impianto di una camera di quattro parti. La camera inclusotre parti in acciaio inox custom-lavorati che serrate le vertebre che circonda la laminectomia, ed un vetrino di vetro posto sopra la SC e fissato con elastomero siliconico. Questa tecnica ha permesso per l&#39;imaging di routine ad più di 5 settimane dall&#39;intervento in stati sani e feriti, senza la necessità di interventi di ripetizione. Il numero di punti di tempo di imaging è stato limitato soltanto dalla frequenza alla quale l&#39;animale può tollerare induzione anestetica. Imaging durata era limitata dalla crescita di una fitta, tessuto fibroso sulla superficie del SC. Inoltre, abbiamo verificato che l&#39;impianto chirurgico non ha avuto effetto a lungo termine sulla funzione motoria. Dato che la nostra prima pubblicazione, approcci alternativi che consentano anche di imaging a lungo termine nella SC sono stati descritti altrove 31-33. Questo protocollo dimostra la nostra procedura per impiantare la camera di midollo abbiamo sviluppato.

<table><tbody><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td></td></tr><tr><td>forceps, scissors, scalpel, etc.</td><td>Fine Science Tools</td><td>multiple&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -magnetic fixator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-02</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td>other retractors may also be used</td></tr><tr><td>retractor kit -elastomer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-07</td><td></td></tr><tr><td>feedback controlled heating blanket</td><td>CWE Inc.</td><td>Model: TC-1000 Mouse&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Part No. 08-13000</td><td></td></tr><tr><td>stereotax</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber holders</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>Loctite 495</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8101</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8501</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Elastomer</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Mixing Tips</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIKMIX</td><td></td></tr></tbody></table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Seguendo la procedura sopra, ogni fase della chirurgia dovrebbe imitare i risultati per ogni fase della chirurgia delineato nella Figura 2. Particolare cura deve essere presa quando si applica l&#39;elastomero siliconico per eliminare le bolle d&#39;aria sotto la lente, o almeno garantire che siano situato alla periferia dell&#39;area di interesse (Figura 2L). Per un chirurgo esperto, le complicanze chirurgiche che richiedono l&#39;eutanasia sia durante l&#39;intervento chirurgico o entro il primo 24 ore dopo l&#39;intervento chirurgico si verificano in circa il 20% delle operazioni. Queste complicazioni più frequentemente derivano dall&#39;eccessiva emorragie tessuti molli o mancata fissare saldamente la camera alla colonna vertebrale. In camere impiantati con successo, la finestra rimane tipicamente otticamente trasparente per più settimane (Figura 3). Nonostante gli sforzi, una opaca, fibrosa, la crescita neoplastica costituisce spesso entro pochi giorni, con conseguente parziale obscuring della finestra (Figura 3C - F, nero linea tratteggiata). Strutture fluorescenti sono difficili da vedere al microscopio 2PEF sotto questo tessuto fibroso. Troviamo una distribuzione bimodale dei risultati, con circa il 50% delle finestre impiantati con successo rimanendo chiaro per più di 5 settimane dopo l&#39;intervento, e circa il 50% diventando offuscato entro 1 - 3 settimane. Per le finestre che rimangono chiare, la maggior parte dei posti all&#39;interno della finestra di esperienza visiva solo un modesto grado di neovascolarizzazione in o al di sopra della dura (Figura 3D - F, asterischi verde), che non ostacola l&#39;imaging 2PEF. Il nostro studio precedente 30 ha mostrato un aumento di microglia, ma non la densità astrocyte sotto la finestra e vertebre adiacenti, indicando lieve infiammazione analogo a quello visto in finestra preparati cranici 5. Nei topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) in un sottogruppo di dorsale radice Ganglia (DRG) neuroni (linea YFPH; Jackson Labs), gli assoni erano chiaramente distinguibili per settimane dopo l&#39;intervento (Figura 4A e b), e fino a quattro mesi in un animale (dati non riportati). I vasi sanguigni (Figura 4A e B) sono stati resi visibili dal retro-orbitale iniezione fluorescente Texas Red etichettato destrano nel plasma sanguigno. Microglia sono stati visualizzati in topi che esprimono GFP in un CX3CR1 topo knock-in (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) attraversato la linea YFPH (Figura 4C). Contrasto e risoluzione deteriorata modestamente nel tempo (Figura 4C) a causa della formazione di una proliferazione fibrosa 30 precedentemente descritto. Abbiamo regolarmente ripreso per 3 ore in una singola sessione, senza mortalità e come spesso come ogni 12 ore. La durata della sessione e frequenza è limitata dalla tolleranza dell&#39;animale per l&#39;induzione di anestesia, in concomitanza con le considerazioni etiche accompagnano dolore e disagio per animali da laboratorio. &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Figura 1. Una suite chirurgica personalizzata facilita consegna camera durante l&#39;impianto e stabilizza la camera durante sessioni di imaging successive. Due barre laterali e una piastra superiore (A) sono montate (B) utilizzando piccole viti nella camera spinale (C). Un tavolo operatorio con posti estensibili (D) consente per la consegna ed il bloccaggio delle barre laterali per le vertebre con spine di tenuta (E). Sessioni di imaging successive invece utilizzano i messaggi filettati internamente per collegare alla camera tramite le viti di fermo sulle ali della protesi (F). Panel b di questa figura è stata modificata da Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 con il permesso di Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> Figura 2. Un laminectomia dorsale è eseguito e una camera di imaging cronica è impiantato per fornire accesso ottico al midollo spinale. La procedura è descritta nel montaggio. Innanzitutto, la pelle (pannelli A, B; sezioni protocollo 3.1- 3.4 -) e muscoli (C; 3,5) vengono retratti per esporre tre vertebre sottostante. Il tessuto sovrastante questi tre vertebre viene rimossa (D, E, F; 3,6-3,10) ei processi laterali sono raschiati pulite prima di essere fissati su entrambi i lati (G, H, 3.12). Attenzione, la lamina dorsale della vertebra centrale è rimosso ei bordi dell&#39;osso sigillato (I </strong&gt;; 4. 6). Una piastra superiore viene applicata (J, 5.1) e le viti fissata in posizione (K; 5.3) per fissare la camera prima di sigillare la camera con elastomero di silicone e vetro di copertura (L; 5.5). Dopo che le spine di consegna sono rimossi (M; 5.8), la pelle è incollato ai lati della camera (M, N, 5,8) e le viti sono inserite nelle ali (O; 5.9). Infine, gli slot delle viti sono sigillati con materiale acrilico dentale (P; 5.10). E il mouse è posto in una gabbia pulita per recuperare <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> Figura 3. Una camera spinale cronica rimane ov otticamente trasparenteer più settimane. Immagini luce bianca del midollo spinale, che vanno da alcuni minuti (A) a tre settimane dopo l&#39;intervento (F). Punti di riferimento vascolari sono identificabili in tutti i tempi (frecce gialle). Piccolo cambiamento è visto in un giorno dopo l&#39;intervento chirurgico (B). Dense proliferazione fibrosa (C - F, delimitata da linea tratteggiata in basso a destra) è presente fin da tre giorni e risultati di offuscamento parziale l&#39;area di esposizione. Neovascolarizzazione Mild (D, E, F, asterischi verdi) è presente, ma non oscura la vascolarizzazione originale in luce bianca o di imaging 2PEF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Figura 4. Una camera spinale cronica consente ripetuto l&#39;imaging multi-photon senza la necessità di interventi di ripetizione. immagini ripetuta di topi transgenici esprimenti YFP in un sottoinsieme di assoni DRG (verdi) nelle funiculi dorsali del midollo spinale e vascolare (rosso) etichettati da intravascolare iniettabile colorante (A, B). L&#39;attività di microglia (malva) può anche essere seguito nel tempo Thy1-YFP / CX3CR1-GFP doppio topi transgenici (C). Mentre assoni e microglia rimangono visibili, il contrasto e la risoluzione declino modestamente nel corso del tempo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

a-procedure-for-implanting-spinal-chamber-for-longitudinal-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

14.1K Views.  Cornell University.  In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati. 

Video: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Ricerca

Neuroscienze

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

This is a compact visual description of a combination of surgical technique and device for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. While the technique is demonstrated in the animal, the procedure is FDA-approved and currently being used for stem cell transplantation into the spinal cords of patients with ALS. While the FDA has recognized proof-of-principle data on therapeutic efficacy in highly characterized rodent models, the use of large animals is considered critical for validating the combination of a surgical procedure, a device, and the safety of a final therapy for human use. The size, anatomy, and general vulnerability of the spine and spinal cord of the swine are recognized to better model the human. Moreover, the surgical process of exposing and manipulating the spinal cord as well as closing the wound in the pig is virtually indistinguishable from the human. We believe that the healthy pig model represents a critical first step in the study of procedural safety.

Short visual description of the surgical technique and device used for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. The technique is demonstrated in the animal but is entirely translatable and currently being used for human application.

Tecnica chirurgica per la consegna del midollo spinale per le terapie: Dimostrazione di procedura a Gottinga nel maialino

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Medicina

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Bioingegneria

In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The purpose of this method is to describe a novel mouse model of spinal implant infection (SII) that was created to provide an inexpensive, rapid, and accurate in vivo tool to test potential therapeutics and treatment strategies for spinal implant infections.
In this method, we present a model of posterior-approach spinal surgery in which a stainless-steel k-wire is transfixed into the L4 spinous process of 12-week old C57BL/6J wild-type mice and inoculated with 1 x 103 CFU of a bioluminescent strain of Staphylococcus aureus Xen36 bacteria. Mice are then longitudinally imaged for bioluminescence in vivo on post-operative days 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28, and 35. Bioluminescence imaging (BLI) signals from a standardized field of view are quantified to measure in vivo bacterial burden.
To quantify bacteria adhering to implants and peri-implant tissue, mice are euthanized and the implant and surrounding soft tissue are harvested. Bacteria are detached from the implant by sonication, cultured overnight and then colony forming units (CFUs) are counted. The results acquired from this method include longitudinal bacterial counts as measured by in vivo S. aureus bioluminescence (mean maximum flux) and CFU counts following euthanasia.
While prior animal models of instrumented spine infection have involved invasive, ex vivo tissue analysis, the mouse model of SII presented in this paper leverages noninvasive, real time in vivo optical imaging of bioluminescent bacteria to replace static tissue study. Applications of the model are broad and may include utilizing alternative bioluminescent bacterial strains, incorporating other types of genetically engineered mice to contemporaneously study host immune response, and evaluating current or investigating new diagnostic and therapeutic modalities such as antibiotics or implant coatings.

The protocol describes a novel in vivo mouse model of spinal implant infection where a stainless-steel k-wire implant is infected with bioluminescent Staphylococcus aureus Xen36. Bacterial burden is monitored longitudinally with bioluminescent imaging and confirmed with colony forming unit counts after euthanasia.

Modello murino in vivo di infezione da impianto spinale

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The ...

Chirurgia del midollo spinale e impianto di gambo ottico nei roditori

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the spinal cord remains relatively unexplored. The inherently delicate and mobile spinal cord tissue imposes constraints that make the precise implantation of neural probes challenging. Despite recent advances in neuromodulation devices, particularly flexible bioelectronics, opportunities to expand their use in the spinal cord have been limited by the surgical complexities of device implantation. Here, we provide a series of surgical protocols tailored specifically for the implantation of a custom-made optoelectronic device that interfaces with the spinal cord in rodents. The steps to place and anchor an optical shank on a specific segment of the spinal cord via two different surgical implantation methods are detailed here. These methods are optimized for a diverse range of devices and applications, which may or may not require direct contact with the spinal cord for optical stimulation. To elucidate the methodology, the vertebral anatomy is referenced first to identify prominent landmarks before making a skin incision. The surgical steps to secure an optical shank over the cervical spine in rodents are demonstrated. Procedures are then outlined for securing the optoelectronic device connected to the optical shank in a subcutaneous space away from the spinal cord, minimizing unnecessary direct contact. Behavioral studies comparing animals receiving the implants to those undergoing sham surgeries indicate that the optical shanks did not adversely affect hindlimb or forelimb function seven days post-implantation. The present work broadens the neuromodulation toolkit for use in future studies aimed at investigating various spinal cord interventions.

Autore in primo piano: Metodologia innovativa per l'impianto e il fissaggio di sonde neurali nel midollo spinale del roditore

This protocol details a surgical procedure for performing spinal cord surgery and for implanting and securing an optical shank over the spinal cord in rodents.

Impianto di dispositivi optoelettronici nel midollo spinale del roditore

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the ...

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video