The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).

NOTA: Tutte le procedure qui descritte sono stati esaminati e approvati dalla University of Louisville Istituzionale Comitato Biosicurezza (protocollo # 13-056) e Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo # 13-064). 1. Preparazione del colorante <ol><li> Diluire 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue in PBS e sterilizzare filtro con un filtro a siringa da 0,45 micron. </li></ol> 2. Preparazione di Pseudomonas aeruginosa cultura <ol><li> 15 ore prima instillazione, inoculare 3 ml di brodocoltura con una singola colonia batterica. </li><li> Crescere la coltura 15 ore a 37 ° C su un agitatore (200 rpm). </li><li> Centrifuga 1 ml di coltura in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml 12.000 xg per 30 sec. </li><li> Rimuovere il mezzo e risospendere il pellet in 1 ml di PBS. </li><li> Diluire un&#39;aliquota del magazzino sospensione batterica 1:10 in PBS e misurare il diametro esterno 600 della sospensione batterica diluita per determinare lala concentrazione batterica. </li><li> Diluire la sospensione batterica magazzino in PBS alla concentrazione desiderata di inoculo batterico, utilizzando un volume di consegna di 50 microlitri per IMIT inoculazione. </li></ol> 3. IMIT instillazione <ol><li> Inserire un gruppo di topi in isoflurano camera di induzione di anestesia e anestetizzare con un 2 - miscela di isoflurano / ossigeno 3%. </li><li> All&#39;inizio iniziale di sedazione, collottola il mouse, tenendo premuto il mouse verticale, e somministrare 10 ml di una soluzione di lidocaina 2% mediante sonda gastrica dell&#39;ago alla parte posteriore della gola e consentire alla soluzione di scendere verso l&#39;epiglottide. Ritorna il mouse alla camera di anestesia. <ol><li> Lasciare almeno 5 minuti per consentire la lidocaina prendere pieno effetto come anestetico locale. </li></ol></li><li> Quando i topi hanno raggiunto il livello desiderato di sedazione (tasso di ~ 60 bpm respirazione), ridurre la isoflurano al 2% per mantenere la sedazione. </li><li> Precarico tintura o inoculo batterico in 250 ml a tenuta di gasprecisione siringa in forma con un lungo ago smussato 22 G. <ol><li> Prima elaborare 150 microlitri di aria, misurati mediante lo stantuffo della siringa teflon. Successivamente, elabora 50 ml di inoculo facendo avanzare lo stantuffo Teflon dal marchio 150 microlitri al segno 200 microlitri sul corpo siringa. NOTA: Quando il campione viene espulso in un mouse intubato, la sospensione 50 microlitri sarà trasportato primo, seguito da un cuscino d&#39;aria 150 microlitri che distribuirà l&#39;inoculo nel polmone. </li></ol></li><li> Rimuovere un mouse dalla camera di induzione e giaceva supino su una piattaforma intubazione. Fissare il mouse alla piattaforma agganciando i suoi incisivi con un O-ring attaccato al velcro strip, e fissare il velcro alla piattaforma. Sollevare il mouse per una pendenza di 45 °. </li><li> Usando un applicatore di cotone micro, ritrarre la lingua con un moto di rollio, con la mano dominante. </li><li> Con la mano non dominante, utilizzare una misura otoscopio operativo con una specula intubazione sia maintain la ritrattazione della lingua e visualizzare la glottide. </li><li> Con la mano dominante, utilizzare un filo guida filettato attraverso un catetere 20 G intubare il mouse, sedere il catetere ad una profondità da 10 mm nel trachea mouse (catetere è in forma di un manicotto in silicone con 10 mm di catetere esposta). Rimuovere l&#39;otoscopio / specula. </li><li> Verificare che il mouse è stato intubato correttamente, garantendo il catetere con la mano non dominante, mentre per breve tempo il collegamento di un Luer lunghezza collegata di 1/16 &quot;tubo trasparente contenente un colorante. NOTA: Il colorante viene rapidamente migrazione avanti e indietro in risposta alla respirazione. </li><li> Non procedere con i passi successivi, se la conferma di intubazione non è stata stabilita, a questo punto. Se l&#39;intubazione tentata non è riuscita, ripristinare il filo del catetere e la guida per un ulteriore tentativo a intubazione. NOTA: È sconsigliabile tentare più di due intubazioni di un topo in una sessione senza causare traumi al mouse. </li><li> Continuare afissare il catetere con la mano non dominante, mentre l&#39;inserimento della siringa di precisione / ago smussato contenente il cuscino di sospensione / aria liquida. </li><li> Erogare aria / liquido direttamente nei polmoni in un unico movimento fluido e rimuovere immediatamente l&#39;ago / catetere dal mouse. </li><li> Ritorna il mouse in una gabbia e permettere il recupero dall&#39;anestesia. </li></ol> 4. Caratterizzazione di IMT di consegna <ol><li> Dopo IMIT instillazione, eutanasia il mouse da CO 2 asfissia in un post-inoculazione momento opportuno. </li><li> Fissare il mouse eutanasia su una tavola di dissezione e godersi il torace e l&#39;addome con il 70% EtOH usando una bottiglia a zampillo. </li><li> Se la valutazione della distribuzione di un agente di imaging nel polmone, rimuovere i polmoni dal animale con tecnica sterile e visualizzare i polmoni come appropriato per l&#39;imaging. NOTA:. I polmoni possono essere preparate per ulteriori tecniche di colorazione istologiche mediante fissazione o crioconservazione del caso &lt;/ Li&gt; <li> Se la valutazione della carica batterica del tessuto polmonare infetto, togliere i polmoni dall&#39;animale con tecnica sterile. Luogo polmoni in una sterile, pre-pesate 1 sacchetto di campionamento oz. Pesare e registrare il peso del sacchetto di campionamento + polmoni. <ol><li> Aggiungere 1 ml di PBS sterile, 1x per ogni sacchetto di campionamento + tessuti. Richiudere sacchetto di campionamento. </li><li> Omogeneizzare i tessuti da dolce a rotazione un 25 ml pipetta sierologica nel sacchetto di campionamento + tessuto. </li><li> Generare diluizioni seriali del polmone omogenato in PBS sterile e piastra su piastra di agar (LB, o se del caso alla specie batteriche in fase di studio): <ol><li> Condurre una diluizione in serie di sei volte in un U-basso a 96 pozzetti da pipettatore multicanale allora piastra campioni in triplicato dal multicanale sulla piastra di agar. </li></ol></li><li> Incubare le piastre di agar per una notte a 37 ° C ed enumerare le unità formanti colonie il giorno successivo. </li></ol></li></ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+Klebsiella+pneumoniae+comparative+genetic+analyses+with+virulence+profiles+in+a+murine+respiratory+disease+model.">Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model.</a> PLoS ONE. In revision, (2014).</li><li>Soto-Montenegro, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+airway+distribution+of+transnasal+solutions+in+mice+by+PET/CT+imaging.">Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging.</a> Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

IMIT instillazione offre miglioramenti chiave per modelli di malattie respiratorie già esistenti nella capacità di infondere riproducibile reagenti direttamente nei polmoni. Si tratta di un approccio veloce che si trova in posizione ideale per una squadra di due ricercatori, uno dei quali gestisce la logistica di anestesia e ingabbiamento, e l&#39;altro che esegue la tecnica IMIT. I grandi studi possono essere condotti utilizzando IMIT con un impegno medio di tempo di 2 - 3 minuti per mouse. Poiché l&#39;approccio fa uso di isoflurano come anestetico, topi recuperare rapidamente dall&#39;anestesia, riducendo il tempo di allevamento di animali controllo attraverso il recupero. L&#39;aspetto più tecnicamente impegnativo del metodo IMIT è il passo iniziale di intubazione topi. Gli individui che imparano a svolgere IMIT sono in grado di concentrarsi su questo primo passo di posizionamento del catetere e la garanzia che l&#39;intubazione è stato raggiunto attraverso la conferma visiva di movimento tintura. Il vantaggio di questo approccio è che il polmone-specific instillazione è garantita attraverso l&#39;uso della conferma di intubazione, che aumenta la fiducia sia del nuovo ricercatore nonché l&#39;esperto tentativo di intubazione un animale difficile. Gli elementi chiave per ottimizzare la probabilità di una intubazione di successo sono: i) il raggiungimento di un sedazione profonda per dare il tempo di lavoro sufficienti, ii) il corretto posizionamento del specula in bocca per permettere una buona visualizzazione della epiglottide, iii) l&#39;inserimento di una buona profondità del specula in modo che la linguetta rimane retratto durante tutta la procedura, e iv) utilizzo della piattaforma di ribaltamento per supportare mani del ricercatore in modo che la procedura è condotta rilassata e con un comportamento costante. Uno dei limiti della procedura IMIT è legato alla frequenza degli eventi IMIT instillazione. A causa del trauma potenziali associati con intubazione perso, non è consigliabile che più di due tentativi di intubazione essere condotti in una singola sessione (fino a due miss). IMITha un ottimo potenziale nella sua capacità di essere utilizzato per fornire terapie nel polmone murino, i regimi terapeutici ma che si avvalgono di consegna molto frequente di reagente nei polmoni non possono essere adatti per IMIT. Può essere possibile che IMIT potrebbe essere utilizzato quotidianamente per fornire reagenti in un polmone murino senza causare traumi significativi, ma solo se condotta da un ricercatore altamente qualificato, come la maggior parte dei traumi associati con intubazione è pensato per essere associato ad un evento intubazione perdere . Tale IMIT ad alta frequenza dovrebbe essere discusso con i veterinari locali e IACUC. Un potenziale limite ulteriore IMIT è la dimensione del mouse che viene intubato. La procedura IMIT sopra descritta è stata sviluppata usando topi di circa 17-22 g, dove è stato trovato un catetere 20 G per essere un formato adatto per la trachea di topi in questo intervallo di grandezza. Cateteri più grandi sono stati utilizzati con successo nei topi anziani; lo sviluppo iniziale di IMIT muso facciata di un catetere 18 G topi BALB / c che sono&gt; 20 g. È importante sottolineare che, se si utilizzano i formati alternativi cateteri, aghi smussati devono essere di provenienza che si adattano il lume del catetere e sono tagliati ad una lunghezza che si estende appena 1 millimetro al di là della punta del catetere. Intubazione di topi di dimensioni inferiori a 17 g può essere possibile, ma non è raccomandato a causa della esperienza richiesta, e richiederebbe l&#39;uso di cateteri più piccoli e specula che sono descritti in precedenza. Abbiamo usato IMIT per la consegna di diversi patogeni respiratori oltre a P. aeruginosa, compresi B. pseudomallei 9 e Klebsiella pneumoniae 10. Il modello IMIT ha conseguito notevoli progressi per i nostri studi di B. malattie respiratorie pseudomallei, dopo aver individuato che l&#39;inoculazione intranasale provoca un precoce, morbilità URT-correlata di topi piuttosto che l&#39;endpoint malattia sistemica osservata nella malattia umana 9. B. pseudomallei è un Tier 1 Selecagente t di impatto biodefense, e come si stanno sviluppando tali, modelli di malattie respiratorie per l&#39;esposizione di aerosol che modelli un biodefense correlato potenziale via di ingresso per patogeni come arma. Dato che i modelli attuali aerosol provocano l&#39;infezione sia della URT e LRT, gli stessi potenziali fenotipi presto morbilità abbiamo individuato per il modello intranasale di B. malattie respiratorie pseudomallei può applicare al modello di aerosol. Un futuro adattamento del modello IMIT potrebbe essere una consegna di aerosol intubazione-mediata (IMAD), in cui i topi sono intubato per la consegna porta aerosol solo nel polmone. Ventilatori meccanici sono attualmente disponibili per mantenere l&#39;anestesia isoflurano, che potrebbe essere adattato per fornire una, piuttosto che a base liquida, sfida patogeno aerosol. IMIT stato sviluppato inizialmente come un approccio per ottimizzare l&#39;erogazione dei batteri al polmone, ma ha anche un&#39;applicazione per la consegna di altri reagenti nel polmone del mouse. Come disdiscussi sopra, consegna intranasale di composti in topi determina una bassa efficienza, consegna altamente variabile dei reagenti nell&#39;organo bersaglio del polmone. Consegna intranasale di Positron Emission Tomography (PET) reagenti di imaging al polmone murino ha prodotto un rendimento di consegna del 40% 11, mentre abbiamo dimostrato che IMIT offre un&#39;ottima alternativa per l&#39;altra consegna del polmone si avvicina con il suo&gt; 98% di efficacia consegna e la distribuzione multilobare. Questo miglioramento somministrazione mirata al polmone ha il potenziale per aumentare la riproducibilità di consegna terapeutico per il trattamento della malattia polmonare. IMIT simile potrebbe offrire vantaggi agli studi di: i) l&#39;impatto delle sostanze irritanti polmonari ambientali, ii), del cancro del polmone studi fenotipici, iii) specifici siRNA-polmone knock-down.

I topi sono stati utilizzati per modellare numerose manifestazioni della malattia umana, compresa una miriade di malattie respiratorie. Modelli di malattia surrogate sono spesso in grado di ricapitolare tutti gli aspetti di una malattia modellato, in genere a causa di importanti fisiologica o differenze immunitarie nei due modelli di accoglienza. Pertanto, l&#39;obiettivo di migliorare i sistemi di modello è quello di sviluppare approcci che consentono surrogati a specchio più da vicino un processo patologico o ospitano risposta come osservato nel sistema host originale. Ci sono parecchie differenze fisiologiche fondamentali tra i topi e gli esseri umani nel meccanismo con cui si ispirano l&#39;aria. Inclusi in queste differenze sono significative differenze raziometriche di dimensioni tra vie aeree superiori e LRT. È stato stimato che i topi possiedono&gt; 100 volte la superficie URT rispetto agli esseri umani, normalizzati contro totale 1,2 capacità polmonare. Così, turbinati nasali del mouse consentono più ampio filtraggio dell&#39;aria inspirata per facilitare una maggiore velocità di breathing, che può avere un impatto significativo sugli studi di polmonite se l&#39;infezione della cavità nasale svolge un ruolo significativo nella progressione della malattia. Diversi approcci sono stati impiegati per infondere batteri nei polmoni di topi per studiare le malattie respiratorie simile a quella umana. Il più comune di questi approcci è inoculazione intranasale, in cui una sospensione liquida viene applicato in una o entrambe le narici di un mouse. Mentre relativamente semplice, avvertimenti come volume instillazione e tipo di anestesia utilizzati possono influenzare l&#39;efficienza della instillazione nel LRT via intranasale inoculazione 3-5. In particolare, Miller et al. hanno dimostrato che l&#39;instillazione intranasale di Francisella tularensis in volumi meno di 50 ml non hanno comportato l&#39;instillazione dei batteri nel LRT 6. Essi hanno inoltre osservato meglio LRT instillazione quando si usa isoflurano per via inalatoria rispetto a iniettato ketamina / xylazina per l&#39;anestesia. Tuttavia, la nostra esperienze con Yersinia pestis inoculazione intranasale indica inoculazione più coerente può essere raggiunto utilizzando ketamina / xylazina rispetto a isoflurano (MBL, dati non pubblicati). Queste differenze potrebbero essere attribuite a patogeno usata o variabilità nella procedure di laboratorio, ma soprattutto evidenziare il potenziale di variabilità in questa tecnica. Inoltre, polmoni raccolte poco dopo instillazione intranasale mostrano che una percentuale relativamente bassa dell&#39;inoculo batterico iniziale raggiunge il polmone (nel caso di Y. pestis, solo il 10% sono stati recuperati 1 ora dopo l&#39;instillazione 7), suggerendo che un gran numero di batteri potrebbe essere mantenuta nel URT (o ingerito nel tratto GI). In alcuni modelli di malattia, questo significativo deposito di batteri sulla mucosa URT può confondere la nostra comprensione della progressione della malattia se l&#39;organismo è in grado di colonizzare la cavità nasale murino in modo incompatibile con la malattia umana. Per esempio, usando in vivo &lt;/ Em&gt; di imaging, è stato osservato che Burkholderia pseudomallei, che non colonizzano l&#39;URT umana, provoca un&#39;infezione opportunistica schiacciante della cavità nasale murino al momento della consegna con il metodo instillazione intranasale 8. Altri metodi per instillare i batteri nei polmoni di topi sono stati impiegati nella ricerca sulle malattie infettive. Tuttavia, rispetto al instillazione intranasale questi metodi tendono a richiedere maggiore competenza tecnica e / o costose attrezzature senza eliminare il rischio di infezione da iniziazione in più siti (ad esempio, aerosol [URT e LRT]; transoral [tubo digerente e LRT], e intratracheale chirurgica [LRT e sangue]). Date le complicazioni potenziali che potrebbero essere associati con i siti secondari di infezione, abbiamo cercato di sviluppare un approccio endotracheale che bypassa vie aeree superiori e fornisce patogeno direttamente nei polmoni di topi anestetizzati, ma limita anche inoculat accidentaleione nel flusso sanguigno o del tratto gastrointestinale. A tal fine, l&#39;intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione è stato sviluppato come una procedura non chirurgica che garantisce LRT instillazione di inoculo, includendo una fase intermedia per verificare il corretto posizionamento del catetere prima della instillazione. Questo metodo viene descritto usando colorante instillazione di dimostrare visivamente ampia distribuzione dell&#39;inoculo nel polmone, e P. aeruginosa instillazione per dimostrare la consegna altamente efficace (&gt; 98% dell&#39;inoculo) di questo metodo per il polmone. È importante sottolineare che, mentre originariamente sviluppato per la consegna batterica, IMIT offre anche un efficace strumento per: i) instillazione di varie molecole per lo studio di altri modelli di malattie respiratorie, ii) la consegna terapeutiche particolari-polmone, e iii) studi di funzionalità polmonare di base, tra cui mirate consegna di siRNA al polmone.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1035">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:447px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Rodent, Tilting WorkStand</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">000A3467</td>
			<td>Base should be detached when working in a BSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Operating Otoscope Head</td>
			<td style="width:160px;">Welch Allyn</td>
			<td style="width:119px;">21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Otoscope 3.5 V Li Battery</td>
			<td style="width:160px;">Welch Allyn</td>
			<td style="width:119px;">71900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:311px;">Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">200A3589S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Incisor Loops</td>
			<td style="width:160px;">Hallowell EMC</td>
			<td style="width:119px;">210A3490A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Cotton fine tip applicator</td>
			<td style="width:160px;">Puritan</td>
			<td style="width:119px;">871-PC DBL&#160;</td>
			<td>Used for tongue retraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">I.V. Catheter, 20G</td>
			<td style="width:160px;">Exel Int</td>
			<td style="width:119px;">26741</td>
			<td>Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Gas tight syringe, 250ul</td>
			<td style="width:160px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">81120</td>
			<td>Used for delivery of liquid inoculum by IMIT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Blunt Needle, 22G</td>
			<td style="width:160px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">91022</td>
			<td>Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm)</td>
			<td style="width:160px;">TheFiberOpticStore.com</td>
			<td style="width:119px;">FOF .50</td>
			<td>Cut to 6&#34; length: used as guide wire for intubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Tuberculin syringe, 1ml</td>
			<td style="width:160px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td>Assemble with fiber optic wire as guide wire</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Brilliant Blue R (Coomassie)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Tygon tubing, 1/16&#34;</td>
			<td style="width:160px;">Saint Gobain</td>
			<td style="width:119px;">ALC00002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Male luer 1/16&#34; barb</td>
			<td style="width:160px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">45503-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Female luer 1/16&#34; barb</td>
			<td style="width:160px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">45500-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Lidocaine, USP</td>
			<td style="width:160px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">LI102</td>
			<td>pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Sample bag, 1oz</td>
			<td style="width:160px;">Whirl-Pak</td>
			<td style="width:119px;">B01067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">U-bottom 96 well plate, sterile</td>
			<td style="width:160px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">650161</td>
			<td></td>
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intubation-mediated intratracheal (imit) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system

Studi sulle malattie respiratorie in genere comportano l&#39;uso di modelli murini come sistemi sostitutivi. Tuttavia, ci sono notevoli differenze fisiologiche tra il topo e respiratorio umano, in particolare nelle loro vie respiratorie superiori (URT). In alcuni modelli, queste differenze nella cavità nasale murino possono avere un impatto significativo sulla progressione della malattia e la presentazione nel tratto respiratorio inferiore (LRT) quando si utilizzano tecniche di instillazione intranasale, potenzialmente limita l&#39;utilità del modello di topo per studiare queste malattie. Per questi motivi, sarebbe vantaggioso sviluppare una tecnica di instillare batteri direttamente nei polmoni topo per studiare la malattia LRT in assenza di coinvolgimento delle vie aeree superiori. Abbiamo chiamato questa specifica tecnica di fornitura intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione del polmone. Questa tecnica non invasiva minimizza il potenziale per instillazione nel sangue, che può verificarsi durante tradizio più invasiveapprocci chirurgici onal intratracheali infezione, e limita la possibilità di consegna tratto digestivo incidentale. IMIT è un processo in due fasi in cui i topi vengono prima intubati, con una fase intermedia di garantire il posizionamento del catetere corretta nella trachea, seguiti da inserimento di un ago smussato nel catetere di mediare consegna diretta dei batteri nei polmoni. Questo approccio permette un&#39;efficacia&gt; 98% della fornitura nei polmoni un&#39;eccellente distribuzione del reagente nel polmone. Così, IMIT rappresenta un nuovo approccio per studiare le malattie LRT e spedizione terapeutica direttamente nel polmone, migliorando sulla capacità di utilizzare topi come surrogati per studiare malattie respiratorie umane. Inoltre, la precisione e la riproducibilità del sistema di erogazione rende anche suscettibili di buona prassi di laboratorio (GLP), così come la consegna di una vasta gamma di reagenti che richiedono elevata efficienza di consegna al polmone.

Per visualizzare la distribuzione di materiale instillato attraverso il metodo IMIT, 50 ml di 0,1% Coomassie Brilliant Blue tintura è stato instillato nei polmoni di un topo anestetizzato. Il mouse è stato immediatamente eutanasia ei polmoni sono stati rimossi dalla necroscopia sterile. La figura 1 mostra che il colorante è stato consegnato a tutti i lobi del polmone. Per determinare la quantità di batteri consegnato ai polmoni tramite il metodo IMIT, tre gruppi di topi (n = 3) sono stati instillato con tre differenti concentrazioni di P. aeruginosa (1.21 x 10 8, 1.21x10 7, e 1,21 x 10 6 unità formanti colonie [CFU] per 50 microlitri). Subito dopo IMIT instillazione, i topi sono stati sacrificati, polmoni rimossi e numeri batteriche sono state enumerate e confrontate con i inoculums (Figura 2). Consegna dell&#39;inoculo è molto efficace tramite questo metodo, con&gt; 98% dell&#39;inoculo recuperato dai polmoni di instillatoanimali. Inoltre, IMIT instillazione era altamente riproducibile indipendentemente dalla concentrazione di inoculo (R 2 = 0,9951). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Figura 1: IMIT instillazione distribuisce inoculo nel corso dei polmoni polmoni di topi instillato con 50 ml di 0,1% Coomassie Brilliant Blue spettacolo colorante blu distribuite in tutti i lobi.. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Figura 2:. IMIT instillazione di batteri nei polmoni topi sono stati instillato con P. aeruginosa e il numero di batteri instillati nei polmoni (Log 10 CFU - recuperata) sono stati confrontati con l&#39;inoculo stimato (Log 10 CFU - distribuito). Ogni cerchio rappresenta la UFC / polmone di un mouse individuale (n = 3 per ogniDose batterica).

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Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

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Medicine

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

24.0K Views.  University of Louisville Medical School.  Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica. 

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A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

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Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

Endometriosis is a common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this study was to demonstrate the use of a blue dye (methylene blue) to stain peritoneal surfaces during laparoscopy (L/S) to detect the loss of peritoneal integrity in patients with pelvic pain and suspected endometriosis. Forty women with CPP and 5 women without pain were evaluated in this pilot study. During L/S, concentrated dye was sprayed onto peritoneal surfaces, then aspirated and rinsed with Lactated Ringers solution. Areas of localized dye uptake were evaluated for the presence of visible endometriotic lesions. Areas of intense peritoneal staining were resected and some fixed in 2.5% buffered gluteraldehyde and examined by scanning (SEM) electron microscopy. Blue dye uptake was more common in women with endometriosis and chronic pelvic pain than controls (85% vs. 40%). Resection of the blue stained areas revealed endometriosis by SEM and loss of peritoneal cell-cell contact compared to normal, non-staining peritoneum. Affected peritoneum was associated with visible endometriotic implants in most but not all patients. Subjective pain relief was reported in 80% of subjects. Based on scanning electron microscopy, we conclude that endometrial cells extend well beyond visible implants of endometriosis and appear to disrupt the underlying mesothelium. Subtle lesions of endometriosis could therefore cause pelvic pain by disruption of peritoneal integrity, allowing menstrual or ovulatory blood and associated pain factors access to underlying sensory nerves. Complete resection of affected peritoneum may provide a better long-term treatment for endometriosis and CPP. This simple technique appears to improve detection of subtle or near invisible endometriosis in women with CPP and minimal visual findings at L/S and may serve to elevate diagnostic accuracy for endometriosis at laparoscopy.

Loss of peritoneal integrity provides a new paradigm to understand and treat chronic pelvic pain in women with mild forms of endometriosis and can be easily detected using intraoperative instillation of dye at the time of laparoscopy.

Rilevazione intraoperatoria di endometriosi sottile: un nuovo paradigma per la rilevazione e il trattamento del dolore pelvico associato con la perdita di integrità peritoneale

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Instillazione e fissaggio Metodi utili in mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations over time in the blood-oxygenation level dependent signal. rs-fcMRI has been applied extensively to identify abnormalities in brain connectivity in different neurologic and psychiatric diseases. However, the relationship among rs-fcMRI connectivity abnormalities, brain electrophysiology and disease state is unknown, in part because the causal significance of alterations in functional connectivity in disease pathophysiology has not been established. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a technique that uses electromagnetic induction to noninvasively produce focal changes in cortical activity. When combined with electroencephalography (EEG), TMS can be used to assess the brain's response to external perturbations. Here we provide a protocol for combining rs-fcMRI, TMS and EEG to assess the physiologic significance of alterations in functional connectivity in patients with neuropsychiatric disease. We provide representative results from a previously published study in which rs-fcMRI was used to identify regions with abnormal connectivity in patients with epilepsy due to a malformation of cortical development, periventricular nodular heterotopia (PNH). Stimulation in patients with epilepsy resulted in abnormal TMS-evoked EEG activity relative to stimulation of the same sites in matched healthy control patients, with an abnormal increase in the late component of the TMS-evoked potential, consistent with cortical hyperexcitability. This abnormality was specific to regions with abnormal resting-state functional connectivity. Electrical source analysis in a subject with previously recorded seizures demonstrated that the origin of the abnormal TMS-evoked activity co-localized with the seizure-onset zone, suggesting the presence of an epileptogenic circuit. These results demonstrate how rs-fcMRI, TMS and EEG can be utilized together to identify and understand the physiological significance of abnormal brain connectivity in human diseases.

Resting-state functional-connectivity MRI has identified abnormalities in patients with a wide range of neuropsychiatric disorders, including epilepsy due to malformations of cortical development. Transcranial Magnetic Stimulation in combination with EEG can demonstrate that patients with epilepsy have cortical hyperexcitability in regions with abnormal connectivity.

Un multimodale Imaging- e stimolazione a base di metodo di valutazione relativi alla connettività del cervello eccitabilità pazienti con epilessia

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. Irreparable cell damage results in a chronic loss of salivary function that impairs basic oral activities, and increases the risk of oral infections and dental caries. Salivary hypofunction and its complications gravely impact a patient's comfort. Current symptomatic management of the condition is ineffective, and newer therapies to assuage the condition are needed. 
Salivary glands are exocrine glands, which expel their secretions into the mouth via excretory ducts. Cannulation of these ducts provides direct access to the glands. Retroductal delivery of a contrast agent to major salivary glands is a routine out-patient procedure for diagnostic imaging. Using a similar procedure, localized treatment of the glands is feasible. However, performing this technique in preclinical studies with small animals poses unique challenges. In this study we describe the technique of retroductal administration in rat submandibular glands, a procedure that was refined in Dr. Bruce Baum's laboratory (NIH)1, and lay out a procedure for local gland irradiation.

Salivary gland hypofunction, a major adverse effect of head and neck radiotherapy diminishes a patient's quality of life. The demonstration of efficacy of new therapies in animal models is a prerequisite before clinical transition. This protocol describes retroductal administration and local irradiation of rat submandibular glands.

Retroductal ghiandola sottomandibolare instillazione e localizzati frazionato irradiazione in un modello murino di salivare Ipofunzione

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study these pulmonary diseases. Previous pleural effusion models paid more attention to biological factors rather than nanoparticles in the environment. Here, we introduce a model to make pleural effusion in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica, and a method of nanoparticle isolation in the pleural effusion. By intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica with concentrations of 3.125, 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL, the pleural effusion in rats presented on day 3, peaked at days 7-10 in 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL groups, then slowly decreased and disappeared on day 14. When the concentration of polyacrylate/nanosilica increased, the pleural effusion is produced more and faster. This pleural fluid was detected by ultrasound examination or CT chest scanning and confirmed by dissection of rats. Silica nanoparticles were observed in the rats' pleural effusion by transmission electron microscope. These results showed that the exposure to polyacrylate/nanosilica leads to the induction of pleural effusion, which was consistent with our previous report in humans. Additionally, this model is beneficial for the further study of nanotoxicology and the pleural effusion diseases.

Here, we present a protocol to construct a pleural effusion model in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica.

Un modello di effusione pleurica in ratti mediante instillazione intratracheale di poliacrilato/nanosilice

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...