Il protocollo che segue descrive un sistema che funziona bene in 20-35 g topi. Il metodo può essere facilmente adattabile a topi grandi o più piccoli semplicemente modificando la dimensione del catetere. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalla Università cura e l&#39;uso degli animali Comitato Johns Hopkins. 1. Lung instillazione <ol><li> Selezionare un lungo 20 g cannula commerciale un pollice endovenosa da utilizzare per l&#39;intubazione. </li><li> Modificare il catetere punta piegatura manualmente per generare una leggera curvatura all&#39;estremità come illustrato in figura 1. </li><li> Anestetizzare il mouse con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg) iniettata IP, e confermare anestesia dall&#39;assenza di movimento riflesso. Applicare una pomata veterinaria sugli occhi subito dopo l&#39;anestesia. Subito dopo l&#39;anestesia applicano unguento veterinario per gli occhi e dare carprofen (5-10 mg / kg SQ) per l&#39;analgesia post-chirurgico e instillazione. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma inclinata. Come mostrato in figura 2, un grande raccoglitore ufficio con anse sutura registrato on funziona perfettamente. </li><li> Radere la parte ventrale del collo e pulire e disinfettare la zona del collo con il 70% di alcol. Con i nuovi guanti senza senza lattice e a polvere, utilizzare strumenti chirurgici disinfettati con il 70% di alcol. </li><li> Utilizzo di forbici affilate fare una piccola incisione chirurgica nel collo circa 12 mm sotto l&#39;incisivo inferiore. </li><li> Con una pinza tirare delicatamente la pelle del collo caudale fino a quando la parete ventrale della trachea può essere visto. </li><li> Ritrarre delicatamente la lingua e inserire la cannula con la punta piegata inclinato verso la superficie ventrale del mouse. Come in 1.4, tirare delicatamente sulla pelle del collo, e inserire la cannula nella trachea. NOTA: Con una poca pratica, il catetere sarà visibile muoversi lungo la trachea. Se va nell&#39;esofago, allora non vi sarà alcuna segnalazione visiva del movimento del catetere. Nessun incisionisono realizzati nella trachea. </li><li> Una volta che il catetere è visto nella trachea del collo, avanzato è circa 5 mm di essere affidabile superato le corde vocali ma ancora ben al di sopra della carena. </li><li> Preparati a infondere fino a 50 ml di liquido iniettando attraverso il catetere con un puntale caricamento del gel. Posizionare la punta nel mozzo luer, ma prima di iniettare look particolarmente per osservare il movimento del fluido in sincrono con punta respirazione del mouse. Poi iniettare il instillate. </li><li> Con una siringa da 1 ml, immediatamente fare una relativamente rapida inflazione di 0,6 ml di aria nei polmoni attraverso il catetere per distribuire il liquido profondità nei polmoni. Rimuovere la cannula. </li><li> Rimuovere la cannula. </li><li> Utilizzare una piccola quantità di cianoacrilato per chiudere la piccola ferita chirurgica secondo le istruzioni foglietto illustrativo Vetbond. Mettere i topi in gabbie individuali e monitorare visivamente fino a quando si svegliano e si comportano normalmente, senza alcuna indicazione di discomfort. </li></ol> 2. Lung Fissazione NOTA: Una volta che tutte le procedure sperimentali sono fatte in un mouse, i polmoni per essere pronto per l&#39;elaborazione istologica da fissazione con formaldeide (o qualsiasi altro fissativo desiderato). <ol><li> Sacrifica il mouse con una procedura accettabile IACUC. Per il mouse rappresentante mostrato nel video, viene utilizzato dislocazione cervicale di un mouse anestetizzato. </li><li> Eseguire una tracheostomia (se non già fatto) chirurgicamente esponendo il lato ventrale della trachea, facendo un piccolo taglio, e l&#39;inserimento di uno stub punta dell&#39;ago 18 G nella trachea, e legandola con filo. </li><li> Aprire con cautela il torace con una incisione mediana, tagliare via il diaframma, e rimuovere le pareti laterali del torace per esporre i polmoni. </li><li> Collegare l&#39;estremità luer dell&#39;ago ad un serbatoio su un supporto ad anello contenente formaldeide. Vedere la Figura 3. </li><li> Impostare la superficie superiore della formaldeide 25 cm sopra il livello del mouse. Vedere Figura 3. Successiva assicurarsi che non vi sia aria nel tubo di fissazione eseguendo liquido verso la fine di un rubinetto. Collegare l&#39;estremità luer della cannula tracheale al tubo serbatoio. Aprire il rubinetto per gonfiare i polmoni con la formaldeide. Lasciare i polmoni sotto pressione per almeno 20 min. </li><li> Aprire il rubinetto per gonfiare i polmoni con la formaldeide. Lasciare i polmoni sotto pressione per almeno 20 min. </li><li> Avanti, legare la trachea oltre la fine dell&#39;ago stub. Essa può contribuire a tirare indietro lentamente sul ferro per esporre più della trachea uncannulated. Quando legato in modo sicuro, togliere il rubinetto. </li><li> Sezionare con cautela i polmoni. </li><li> Posizionare i polmoni di formaldeide durante la notte. Tempi più lunghi vanno bene, e alcune macchie o procedure possono specificare orari specifici. Anche altri fissativi liquidi, come z-correzione può essere utilizzato per l&#39;instillazione e l&#39;immersione. </li><li> Prima di ulteriori elaborazioni istologico, misurareil volume polmonare fissa come descritto in seguito. </li></ol> 3. Misurazione del volume polmonare fisso <ol><li> Misurare il volume polmonare utilizzando il principio di Archimede, come illustrato nella figura 4. Rimuovere il polmone fissato dalla formaldeide e sezionare il cuore e qualsiasi altro tessuto non-polmonare. </li><li> Utilizzare un semplice dispositivo di supporto filo casalingo costruito in precedenza che viene utilizzato per mantenere i polmoni completamente sott&#39;acqua. NOTA: Questo dispositivo deve essere reso compatibile con qualunque equilibrio viene utilizzato. Un tipico dispositivo di figura 5 è costituito da una pipetta in plastica e sottile (20 G) fili. Questo sistema funziona bene con la bilancia utilizzata nel video, ma potrebbe essere facilmente adattato alla maggior bilance da laboratorio. </li><li> Posizionare un becher con ≈200 ml di acqua sulla bilancia e tarare con la gabbia di supporto in posto in acqua. Vedere Figura 6 Rimuovere la gabbia metallica.; collocare il polmone sulla superficie dell&#39;acqua e premere sott&#39;acquacon la gabbia. </li><li> Registrare il peso sulla bilancia. Questo numero riflette il volume di acqua spostata ed è quindi una misura diretta del volume polmonare. Prestare attenzione per assicurarsi che il polmone o di sutura o di qualsiasi parte del gabbietta non toccare i lati o fondo del bicchiere. </li><li> Per la precisione, ripetere questa misura. Rimuovere il polmone dall&#39;acqua, e secco su un tessuto. Tarare di nuovo il bicchiere con gabbia in posizione e ripetere la misurazione del volume polmonare. Le due misure di volume devono quindi essere mediate. NOTA: Se i polmoni vengono lasciati in formalina per più di una settimana, l&#39;aria nei polmoni sarà dissolto nel liquido. Quando questo accade, il polmone affonderà, quindi non è più necessario utilizzare un qualsiasi dispositivo come in figura 5 per mantenere il polmone sommerso. In tal caso, il volume può essere misurata semplicemente tenendo il polmone da una delle stringhe sutura finché non è completamente sommerso come illustrato nella figura 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice.">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li><li>Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cellular+profile+and+lung+function+with+repeated+bronchoalveolar+lavage+in+individual+mice.">Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice.</a> Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).</li><li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation:+description,+evaluation+and+comparison+with+transillumination.">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).</li><li>Spoelstra, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+endotracheal+intubation+of+mice.">A novel and simple method for endotracheal intubation of mice.</a> Laboratory. 41, 128-135 (2007).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+retrograde+intubation+in+mice.">A technique for retrograde intubation in mice.</a> Lab animal. 35, 39-42 (2006).</li><li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies.">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).</li><li>Vergari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+orotracheal+intubation+in+mice.">A new method of orotracheal intubation in mice.</a> European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).</li><li>Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-assisted+orotracheal+intubation+in+mice.">Video-assisted orotracheal intubation in mice.</a> Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).</li><li>Hastings, R. H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Laryngoscopy+in+Mice.">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li><li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).</li><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li><li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives.">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).</li><li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice.">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li></ol>

Le procedure qui descritte hanno diversi vantaggi. Innanzitutto l&#39;attrezzatura necessaria è semplice e poco costoso. In secondo luogo, l&#39;intubazione può essere rapidamente fatto con pochi errori. In terzo luogo, la possibilità di fissare i polmoni a pressione costante, e quindi misurare il volume polmonare numeri consente un&#39;adeguata quantificazione delle strutture o cellule nel polmone 10. Un possibile inconveniente: l&#39;intubazione è la chirurgia minore. Ciò può limitare la capacità di ripetere la procedura se è richiesta una instillazione 2 nd. Tuttavia, con un&#39;attenta chirurgia e applicazione dell&#39;adesivo siamo stati in grado di fare regolarmente una seconda instillazione una o due settimane dopo. Se continui instillazioni ripetuti sono necessari o se sono necessari ripetuti test di funzionalità polmonare, un altro approccio intubazione può essere più desiderabile 13,14. Nel fare l&#39;instillazione, ci sono diverse questioni pratiche che dovrebbero essere menzionati. È importante to essere più delicata possibile con movimento della lingua nella prima apertura della bocca. Se si utilizzano pinze, le punte dovrebbero essere coperti con tubi in gomma, poiché è facile ferire la lingua, e questo può portare alla morte del mouse. Anche se i metodi qui sono stati progettati per l&#39;intubazione di topi di età superiore a 6 settimane, potrebbero facilmente essere adattati a giovani topi. La nostra procedura instillazione stato inizialmente progettato come alternativa al metodo di aspirazione orofaringeo 11. Mentre quest&#39;ultimo metodo può essere facilmente appreso, il volume effettivo consegnato al polmone rimane incerta, poiché alcuni dei instillate rimane nella faringe e viene inghiottita. Con un instillazione diretta nella trachea e il successivo l&#39;inflazione polmone come abbiamo dimostrato qui, la instillate viene consegnato direttamente al polmone. Vale la pena notare che, anche se è possibile utilizzare intubazione per fornire sostanze direttamente alla trachea 11,12, tale da intubazione puòMAGE delle vie aeree superiori o corde vocali, e, in generale, richiede un livello molto più alto di formazione per garantire il tasso di successo del 100% che la nostra procedura consente. La procedura di fissaggio che descriviamo è simile a quello che molti ricercatori usano. C&#39;è spesso una certa variabilità nella pressione di gonfiaggio utilizzata per il fissativo, ma riteniamo che il 25 cm H 2 O è un ragionevole compromesso che mantiene il polmone completamente gonfio senza possibili danni da eccesso di inflazione. Va notato, tuttavia, che anche se può sembrare che un polmone gonfiato con fluido 25 cm H 2 O dovrebbe avere un volume di quello che la capacità polmonare totale potrebbe essere con inflazione dell&#39;aria a 35 cm H 2 O, questo è lontano dalla verità. Infatti, l&#39;insufflazione di un fissativo comporta generalmente un volume a 70% della capacità polmonare 15,16 dell&#39;aria. E con successivo trattamento con paraffina, il volume polmonare efficace visti in sezioni istologiche è probabile sotto funzionale residua capacità (FRC). Il fissativo più comune è formalina o z-fix, ma per la colorazione immunologica, una miscela glutaraldehye è spesso richiesto. Gli investigatori dovranno scegliere un fissativo a seconda di ciò che si ha bisogno di essere macchiato, ma ulteriori discussioni del fissativo ottimale è oltre la portata di questo metodi carta. Per fare una corretta analisi quantitativa di sezioni istologiche è essenziale disporre di una misura del volume polmonare 10. Sebbene sia possibile ottenere volume polmonare dalla sequenza completa di sezioni seriali (metodo Cavalieri), nei polmoni del mouse è spesso più semplice misurare semplicemente il volume polmonare fissati come abbiamo descritto in questo documento e video. La procedura che descriviamo sufficienti pochi secondi per fare e deve essere controllata regolarmente fatto con tutte le fissazioni polmonari. Tenere presente, tuttavia, che il volume così misurata non tiene conto di qualsiasi ritiro con successiva lavorazione e incorporamento, e se questo è importante, il metodo dovrebbe Cavalieriessere usato. Una nota finale riguardo a questa misura del volume fisso è che la frazione del volume polmonare nel polmone sinistro nei polmoni fissi è significativamente inferiore a quella che è stata misurata in vivo. CT imaging polmoni in vivo di due ceppi di topi a capacità funzionale residua mostrato il polmone sinistro a circa il 40% del totale 17, che è generalmente solo il 30% nelle suddette misurazioni da polmoni fissati a 25 cm H 2 O . Al momento, non capiamo perché questo dovrebbe essere così diversi, ma dovrebbe essere tenuto presente quando si analizza i cambiamenti nelle analisi istologica quantitativa. Per quanto riguarda gli studi di cancro ai polmoni, aventi una misura del volume polmonare permette un investigatore per normalizzare i dati correttamente su desnsities chimici specifici o la densità di vari tipi cellulari di numeri assoluti in tutta tumore o polmone intero. In sintesi, la procedura di intubazione descrivere qui è poco costoso da fabbricaree semplice da usare, e dovrebbe consentire la maggior parte dei ricercatori e tecnici di laboratorio per imparare rapidamente a infondere con successo i liquidi nei polmoni del mouse con relativamente poca esperienza. Inoltre, la procedura di fissaggio e volume polmonare misurazione delle analisi istologica dei polmoni fornisce un mezzo per una corretta analisi quantitativa e ripetibile delle cellule polmonari e struttura dei polmoni.

Per una serie di ragioni, cancro polmonare non è stata ampiamente studiata nel topo. Una ragione di ciò è che l&#39;accesso al polmone in vivo è molto difficile, e l&#39;analisi quantitativa dei polmoni fissi non viene comunemente fatto. I metodi descritti in questo documento sono stati progettati per porre rimedio a questa situazione. Gli obiettivi sono qui per descrivere i metodi semplici che sarà di grande aiuto nella messa a punto e l&#39;analisi dei polmoni del mouse con cancro ai polmoni o altre patologie. Anche se nessuno di questi approcci sono del tutto nuova, che non sono state presentate insieme come metodi autonomi in maniera semplificata come descritto qui. Ci sono stati una serie di manoscritti che sono descritti i metodi per l&#39;intubazione del polmone del mouse principalmente al fine di fare della funzione polmonare di ripetizione o lavaggio broncoalveolare nei singoli topi in studi longitudinali. Dato che la carta originale, ci sono stati diversi altri giornali che hanno descritto i diversi approcci per protocolli d&#39;intesae intubazione 1 -9. Mentre tutti questi metodi possono essere usati con successo, di solito richiedono un notevole addestramento, e non sono spesso senza un tasso di fallimento non banale. Inoltre, al fine di effettuare misure di funzionalità polmonare, la cannula deve misura trachea abbastanza saldamente in modo che non ci siano perdite di aria. Tuttavia, un altro uso pratico per intubazione è quello di fornire agenti specifici (le cellule del cancro o altri insulti) o di farmaci terapeutici direttamente al polmone. Tale procedura non richiede una cannula aderente né sofisticate apparecchiature di funzionalità polmonare. La caratteristica innovativa di questo metodo qui illustrato prevede una procedura chirurgica minore che consente intubazione senza possibilità di cannula entrare nell&#39;esofago. Questo semplice approccio consente intubazione di successo con relativamente poca formazione o esperienza. Fino a 30 topi / ora possono essere trattati con questo approccio con un tasso di fallimento si avvicina allo zero. Una volta che tegli topi sono pronti per essere sacrificato, i polmoni feriti o cancerose possono poi essere rimossi per istologico e l&#39;analisi patologica. Tuttavia, al fine di quantificare correttamente eventuali variabili istologiche per il confronto con altre polmoni, è essenziale standardizzare le procedure di fissaggio e quantificare correttamente il volume polmonare fisso 10. Questo documento descrive in dettaglio le semplici procedure che consentano procedure di fissaggio standardizzati, nonché un metodo per misurare il volume polmonare fisso. Il volume è una metrica essenziale nella quantificazione della istologia, poiché altrimenti la determinazione del volume, solo densità relative possono essere misurati 10. Una volta che il volume polmonare è noto, tuttavia, le misurazioni assolute di cellule e di altre misure strutturali nel polmone possono essere quantificati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laboratory Balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Adventurer Pro Model AV 313&#160;</td>
			<td>Other balances can be used if they have a range of 1 - 300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 g Luer intravenous catheter</td>
			<td>Insylte</td>
			<td></td>
			<td>Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL laboratory bottle</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Several other possible vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research

La capacità di infondere agenti dal vivo, cellule o sostanze chimiche direttamente nel polmone senza ferire o uccidere i topi è uno strumento importante per la ricerca sul cancro al polmone. Anche se ci sono una serie di metodi che sono stati pubblicati che mostra come intubare topi per le misure di funzionalità polmonare, nessuno è senza i potenziali problemi per una rapida instillazione tracheale in grandi coorti di topi. Nel presente lavoro, un metodo semplice e rapido è descritto che consente un investigatore effettuare tali instillazioni in modo efficiente. Il metodo non richiede utensili speciali o illuminazione e può essere appreso con molto poca pratica. Si tratta anestetizzante un mouse, una piccola incisione nel collo di visualizzare la trachea, e quindi inserendo direttamente un catetere endovenoso. La piccola incisione viene rapidamente chiuso con tessuto adesivo, ei topi sono autorizzati a recuperare. Uno studente qualificato o tecnico può fare instillazioni ad un tasso medio di 2 min / mouse. Una volta che tegli cancro è stabilito, vi è spesso una necessità di un&#39;analisi istologica quantitativa dei polmoni. Tradizionalmente patologi di solito non si preoccupano di standardizzare inflazione polmone durante la fissazione, e le analisi si basano spesso su un sistema di punteggio che può essere molto soggettiva. Mentre questo può talvolta essere sufficientemente adeguata stime grossolane delle dimensioni di un tumore del polmone, qualsiasi corretta quantificazione stereologica struttura polmone o cellule richiede una procedura di fissazione riproducibile e la successiva volume polmonare. Qui si descrive semplici procedure affidabili per entrambi, che fissa i polmoni sotto pressione e poi misurare con precisione il volume polmonare fisso. L&#39;unico requisito è una bilancia da laboratorio che è accurato in un range di 1 mg-300 g. Le procedure qui presentate quindi potrebbero migliorare notevolmente la capacità di creare, trattare e analizzare tumori polmonari nei topi.

Il procedimento descritto nel primo protocollo non di per sé portare ad alcun risultato generalizzati. Esso descrive solo un mezzo molto affidabili per infondere sostanze direttamente nella trachea. Figura 7 mostra un esempio di un polmone in cui è stato instillato trypan blu con il metodo qui descritto. Vi è un&#39;ampia distribuzione del colorante, simile a quanto già visto con altri coloranti o traccianti forniti direttamente in trachea o topi 11,12. Abbiamo usato questo metodo per fornire sia bleomicina o elastasi al polmone, che si traduce nella fibrosi diffusa o enfisema, rispettivamente. Le procedure descritte per quantificare i cambiamenti strutturali nei polmoni autoptici forniscono dati sui volumi polmonari fissati ad una pressione di 25 cm H 2 O. Tali misurazioni del volume sono essenziali per convertire le successive misurazioni istologiche imparziali di cellule o tessuti densità in numero totale di 10. Questa carta solo describi i mezzi per ottenere un volume polmonare molto accurate. In nove 10-12 settimane di età topi sani Balb / c abbiamo misurato una media (± DS) volume polmonare fisso di 0,82 ± 0,09 ml con il volume polmone sinistro essendo circa il 30% del totale. In topi Balb / c riportato 3 U di elastasi pancreatica (con il metodo descritto in questo documento) per generare l&#39;enfisema sperimentale, il volume fisso polmonare aumentato a 1,15 ± 0,13 ml, con la frazione restante polmone sinistro al 30%. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52964/52964fig1.jpg" /> Figura 1: catetere endovenoso con punta leggermente ricurva utilizzato per l&#39;instillazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52964/52964fig2.jpg" /> Figura 2: inclinata raccoglitore dei 3 anelli utilizzati per sostenere i topi per l&#39;intubazione Questo raccoglitore creato per contenere 3 topi.. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52964/52964fig3.jpg" /> Figura 3:. Formalina serbatoio riempito sull&#39;anello stand collegato al topo, con la parte superiore di liquido a soli 25 cm sopra il mouse Questa fissazione dovrebbe normalmente essere fatto in una cappa aspirante. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52964/52964fig4.jpg" /> Figura 4:. Archimede Principio Il peso dell&#39;acqua spostata da un oggetto sommerso è uguale al volume dell&#39;oggetto. Poiché il polmone mantiene normalmente alcuni aria residua, è necessario un dispositivo come in figura 5 per mantenere il polmone completamente sommerso. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52964/52964fig5.jpg" /> Figura 5: Lab ha reso il supporto per mantenere i polmoni completamente sott&#39;acqua periferiche.costruita pipette di plastica e filo metallico. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52964/52964fig6.jpg" /> Figura 6: bilancia da laboratorio con bicchiere e dispositivo sommersione tarato pronto per la misurazione del volume polmonare. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52964/52964fig7.jpg" /> Figura 7: Esempio di un polmone in trypan blu attraverso il catetere intubazione.

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Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

L&#39;obiettivo di questo lavoro è quello di descrivere i metodi semplici che sarà di grande aiuto nella messa a punto e l&#39;analisi dei polmoni del mouse con cancro ai polmoni o altre patologie. Vi presentiamo 3 protocolli modo semplice e affidabile per effettuare instillazioni polmone, la fissazione, e misurazioni del volume polmonare.

Instillazione e fissaggio Metodi utili in mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

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Video: Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

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Medicina

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Diagnostic Ultrasound Imaging di funzione mouse Diaframma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as models of pulmonary disease often resemble the situation of the human lung much better than mice do. Working with large animals also offers the opportunity to sample the same animal repeatedly over a certain course of time, which allows long-term studies without sacrificing the animals.
The aim was to establish in vivo sampling methods for the use in a bovine model of a respiratory Chlamydia psittaci infection. Sampling should be performed at various time points in each animal during the study, and the samples should be suitable to study the host response, as well as the pathogen under experimental conditions.
Bronchoscopy is a valuable diagnostic tool in human and veterinary medicine. It is a safe and minimally invasive procedure. This article describes the intrabronchial inoculation of calves as well as sampling methods for the lower respiratory tract. Videoendoscopic, intrabronchial inoculation leads to very consistent clinical and pathological findings in all inoculated animals and is, therefore, well-suited for use in models of infectious lung disease. The sampling methods described are bronchoalveolar lavage, bronchial brushing and transbronchial lung biopsy. All of these are valuable diagnostic tools in human medicine and could be adapted for experimental purposes to calves aged 6-8 weeks. The samples obtained were suitable for both pathogen detection and characterization of the severity of lung inflammation in the host.

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

This article describes bronchoscopic techniques in the bovine lung under experimental conditions, i.e. bronchoscopically guided inoculation, bronchoalveolar lavage, bronchial brushing, and transbronchial lung biopsy.

Il polmone bovino in ricerca biomedica: Visivamente guidata broncoscopia, intrabronchiale Semina ed<em&gt; In Vivo</em&gt; Tecniche di campionamento

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.