Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo tossicologico della linea germinale umana, come il modo in cui vengono creati o riparati i danni nel genoma delle cellule germinali primordiali umane. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule germinali primordiali umane possono essere generate in due settimane dalle cellule iPS a pluripotenza innescate che ospitano un background genetico di predisposizione della malattia. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la prevenzione della compromissione genomica nelle cellule germinali umane, perché il nostro modello di coltura cellulare può aiutarci a ridurre la tossicità germinale di un farmaco terapeutico.
Per iniziare con la generazione di cellule germinali primordiali umane, o PGCLC umani, preparare piastre rivestite di proteine a matrice extracellulare e sospensione cellulare degli iPSC umani, come descritto nel protocollo di testo. Preparare una sospensione a singola cellula degli iPSC umani a pluripotenza innescata nel mezzo mTeSR1 contenente l'inibitore della rho chinasi Y-27632. Regolare con cura la densità cellulare a 100.000 cellule per millilitro.
Inoculare due millilitri di sospensione cellulare di iPSC umani innescati in ogni pozzo della proteina della matrice extracellulare rivestita con piastre a sei possedimenti, assicurandosi che le cellule siano distribuite uniformemente scuotendo le piastre verticalmente e orizzontalmente. Incubare le piastre in un incubatore di CO2 tri-gas a 37 gradi Celsius. È molto importante inoculare esattamente 200.000 cellule in ogni pozzo di una piastra di sei posse.
Il conteggio accurato delle cellule è fondamentale. Dopo il completamento della conversione transitoria in pluripotenza ingenua, le cellule dovrebbero apparire troppo confluenti, il che è normale. La tempistica esatta del cambiamento medio è importante per ottenere alti PGCLC umani e riproducibilità sperimentale.
La densità della coltura 4i hiPSC è alta in queste condizioni, e si prevede che la cellula diventi confluente alle 48-72 ore successive all'inoculazione. 24 ore dopo l'inoculazione, cambiare il mezzo con due millilitri per pozzo di mezzo mTeSR1 senza Y27632. Inizia la conversione degli iPSC umani allo stato di pluripotenza innescati in 4i ingenue cellule staminali pluripotenti, riscaldando 50 millilitri di mezzo completo 4i in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti.
A 48 e 72 ore dall'inoculazione, rimuovere le piastre dall'incubatore e cambiare il mezzo con 2 millilitri per pozzo di mezzo completo 4i. Centrifugare la piastra microwell rivestita con detersivo a 1.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Ispezionare i pozzi con microscopio invertito per garantire l'assenza di bolle d'aria.
Risciacquare i pozzi come descritto nel protocollo di testo e ripetere la centrifugazione. Aggiungere 4i mezzo completo ai pozzali risciacquati. Centrifugare la piastra a 1.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente e ispezionare nuovamente i pozzi.
Per inoculare 4i iPSC umani nella piastra microwell, preparare la sospensione cellulare iPSC umana come descritto nel protocollo. Filtrare questa sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare di dimensioni dei pori di 40 micrometri per rimuovere gli aggregati cellulari. Lavare il colino con un millilitro di mezzo completo 4i pre-riscaldato tre volte per raccogliere tutte le cellule dal colino e contare le cellule con un contatore di coltura.
Quindi, diluire questa sospensione a singola cellula di 4i iPSC umani ingenui a 27-32,4 milioni di cellule in 9 millilitri pre-riscaldato 4i mezzo completo contenente Y27632. Rimuovere la piastra di microwell precedentemente preparata contenente 1 millilitro di 4i mezzo completo per pozzo da un incubatore di tri-gas. Inoculare 1 millilitro di 4i ingenua sospensione iPSC umana in ogni pozzo, per raggiungere una concentrazione da 3,0 a 3,6 milioni di cellule per pozzo.
Pipettare delicatamente per distribuire uniformemente le cellule. Centrifugare la piastra a 100 g per 3 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra in un incubatore di CO2 a tri-gas, assicurandosi di non disturbare le cellule pellettate in microliette e incubare per 24-30 ore, perché un'incubazione notturna è insufficiente per la formazione di corpi embrionali stretti o EB.
Prewarm 5 millilitri di mezzo basale PGCLC umano e 20 millilitri di mezzo completo PGCLC umano per almeno cinque minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius Posizionare con cura un colino cellulare di dimensioni pori di 40 micrometri capovolto su un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri. Per staccare gli EB dai microwell, pipettare delicatamente ogni pozzo della piastra. Per rimuovere le celle non incorporate negli EB, filtrare il contenuto di tutti i pozzi attraverso il filtro cellulare.
Lavare delicatamente gli EB trattenuti sulla membrana del filtro cellulare con 1 millilitro di mezzo basale PGCLC umano preri riscaldato e ripetere il lavaggio cinque volte. Posizionare un tubo conico fresco da 50 millilitri sul filtro cellulare, in modo che il filtro cellulare sia ora posizionato sul lato destro verso l'alto nel nuovo tubo. Invertire rapidamente il filtro cellulare con il nuovo tubo, che posizionerà gli EB sotto la membrana del filtro cellulare.
Aggiungere 18 millilitri di pgclc umano prerifabbricato mezzo completo alla membrana del filtro cellulare per raccogliere gli EB nel tubo conico. Quindi, piastra 3 millilitri per pozzo della sospensione di EB in pozzi di una piastra a sei pozzi a basso attacco. Posizionare la piastra su un rocker a vista in un incubatore di tri-gas e impostare con cura la velocità di dondolo a circa 20 giri al minuto.
Il settimo e il 13° giorno dell'esperimento, preparare appena 20 millilitri di mezzo completo PGCLC umano ogni giorno. Rimuovere la piastra dal rocker, che farà affondare gli EB sul fondo dei pozzi. Rimuovere il vecchio mezzo senza asciugare gli EB in modo che in ogni pozzo rimangano circa 0,2 millilitri di vecchio mezzo.
Aggiungere 3 millilitri per pozzo di mezzo completo PGCLC umano fresco, dopo aver rimosso il vecchio mezzo ogni giorno. Per identificare i PFC umani come cellule positive agli OCT4, raccogliere gli EB in un tubo di microcentrifugo a bassa legante da 1,5 millilitri. Lasciare che gli EB affondino verso il basso a temperatura ambiente e scartare il mezzo.
Risciacquare gli EB con 1X PBS ghiacciato. Dopo aver rimosso il PBS, incubare gli EB in 1 millilitro di ghiaccio freddo 1% di peso in volume azide di sodio in PBS sul ghiaccio per cinque minuti. Lasciare che gli EB sprofondno verso il basso a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il supernatante, sciacquare gli EB con PBS ghiacciato. Scongelare 200 microlitri di proteine della matrice extracellulare sul ghiaccio. Aggiungere la proteina al tubo contenente EB.
Lasciare il tubo a temperatura ambiente per circa 10 minuti, fino a quando il gel non viene solidificato e gli EB sono incorporati. Per fissare gli EB, aggiungere 1 millilitro di formaldeide al 4% in PBS al tubo e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti con un dolce dondolo. Successivamente, scartare la formaldeide e sciacquare gli EB una volta con PBS ghiacciato.
Aggiungere 1 millilitro di 70% di etanolo. Conservare in etanolo al 70% a 4 gradi Celsius per un massimo di una settimana o procedere alla loro valutazione con un protocollo FFPE standard. La densità cellulare e la distribuzione uniforme delle cellule su ogni pozzo sono fondamentali.
Gli IPSC umani in 2 millilitri di Y27632 integrati media per pozzo di una piastra a sei pozzi, raggiungono il 20-30% di confluenza dopo 24 ore. Dopo un'ulteriore coltura di 24 ore nel mezzo mTeSR1, in assenza di Y27632, le cellule si sono aggregate e formate colonie, occupando circa il 30% dell'area di crescita. Dopo 24 ore di coltura nel mezzo di riprogrammazione 4i, le cellule hanno raggiunto la confluenza.
Dopo altre 24 ore di coltura nel mezzo 4i, le cellule divennero più densamente imballate. Dopo un'incubazione di 24 ore in microliette nel mezzo di riprogrammazione 4i, le cellule formavano EB con il loro contorno circolare visibile a 24-30 ore dopo l'inoculazione. Gli EB tenuti nel mezzo PGCLC umano, in condizioni non a dondolo non arent, hanno mantenuto la loro forma sferica senza aggregazione dopo 24 ore.
Dopo 192 ore, gli EB erano più grandi, mantenendo la stessa morfologia. Dopo 5 giorni, le cellule sono emerse come OCT4 esprimendo cellule sulla superficie degli EB, aumentando il loro numero dopo 8 giorni. Le cellule provenienti dalla sospensione a singola cellula dei PGCLC umani sono state arricchite come cellule CD38 positive dalla FACS.
Le celle che non esprimono CD38 erano un controllo negativo. Per evitare la contaminazione, le porte FACS CD38-positive e CD38-negative sono state separate da un ampio margine. Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire il conteggio esatto delle celle e i tempi di cambiamento medio.
Omettere il cambiamento di mezzo anche un solo giorno, o ridurre il volume di quel mezzo in qualsiasi fase, può causare una massiccia morte cellulare. La velocità della coltura a dondolo dei corpi embrioidi deve essere attentamente ottimizzata.
