Gli autori desiderano ringraziare l&#39;Università degli Studi di Milano per il sostegno a Eliana Di Cairano (borsa di studio post-dottorato) e Stefania Moretti (Ph.D. fellowship). Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca dell&#39;Università di PUR CP Vorremmo ringraziare il Prof. Jeremy M. Henley, Facoltà di Biochimica, Università di Bristol, Regno Unito, per il pHluorin costruire e Dr. Francesco Dotti per l&#39;assistenza nell&#39;analisi dei dati, e di Silvia Marsicano per l&#39;assistenza tecnica.

1. Cella Cultura e Transfection <ol><li> Coltura cellulare SH-SY5Y NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti con il neuroblastoma umano SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. Cellule SH-SY5Y crescono come una miscela di ammassi galleggianti e cellule aderenti. Seguire le istruzioni riportate nel protocollo (densità cellulare, rapporto di scissione, ecc.) Per avere cellule che crescono saldamente attaccati alla copertura in vetro, che è cruciale per TIRFM. <ol><li> Prima di iniziare, sotto l&#39;armadio biosicurezza flusso laminare, rendere il volume opportuno di soluzione di fosfato sterile salina tampone (PBS) e terreno di coltura. <ol><li> Effettuare 50 ml di PBS con concentrazioni di 150 mM NaCl, 24 mM tampone fosfato, pH 7,4. Filtrare la soluzione. </li><li> Effettuare 50 ml di terreno cellulare da Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, siero inattivato al calore fetale bovino 10% (FBS), penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 mcg / ml), L-glutammina ( 2 mM), epiruvato di sodio (1 mM). Filtrare la soluzione. </li></ol></li><li> Rimuovere mezzo di crescita completo e lavare le cellule con 3 ml di PBS. </li><li> Incubare le cellule con 2 ml di 0,05% tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (per 6 piatto Petri cm) per 5 min a 37 ° C, 5% CO 2 e staccare cellule usando pipetta. </li><li> Inattivare tripsina aggiungendo 2 ml di DMEM, e raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 1 ml di DMEM al pellet e pipetta la soluzione su e giù sufficientemente per disperdere le cellule in una sospensione di cellule singole. </li><li> Dividerli 1: 4 in un nuovo diametro Petri piatto 6 centimetri contenente 3 ml di terreno completo. Mantenere le cellule in coltura in 6 centimetri di diametro Petri, a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Sub-coltura una volta alla settimana o quando hanno raggiungimento di 80 - 90% della superficie. </li></ol></li><li> Placcatura cellule SH-SY5Y per l&#39;imaging <ol><li> Per gli esperimenti TIRFM, piastracellule su coperture in vetro. Impiegare vetro copre con 0,17 ± 0,005 millimetri di spessore e un indice di rifrazione 1,5255 ± 0,00015. Prima di iniziare, preparare i vetrini come segue: <ol><li> Vetro Pulire copre con il 90% di etanolo, O / N. </li><li> Risciacquare accuratamente in acqua distillata (tre porzioni di acqua distillata). Vetro copre secco in forno. </li><li> Luogo copre in vetro di Petri e sterilizzare in forno preriscaldato a 200 ° C per 3 ore. </li></ol></li><li> Il giorno prima transfezione, posizionare ogni coprioggetto in una capsula di Petri 3,5 centimetri, aggiungere 1 ml di terreno di coltura e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Trypsinize cellule come descritto ai punti 1.1.3 - 1.1.5, sospendere il pellet in 1 ml di terreno completo e contare. Calcolare il corretto volume di sospensione cellulare per aggiungere a ciascuna piastra di Petri per produrre 3 x 10 5 cellule / pozzetto. È richiesto Questo densità per la crescita cellulare ottimale e trasfezione efficiente. Incubare a 37 ° Cin un incubatore CO 2 5% O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection da polyethylenimine (PEI) NOTA: Per visualizzare sinaptiche dinamiche vescicole, è stato utilizzato pCB6 vettore contenente Synapto-pHluorin. Il Synapto-pHluorin è stato generato da telaio in fusione di una variante sensibile al pH della proteina verde fluorescente (GFP) 16 e la proteina di membrana vescicolare sinaptobrevina 2. Il costrutto è stato ampiamente impiegato per indagare le proprietà vescicole sinaptiche all&#39;interno neuroni 9. <ol><li> Prima di iniziare trasfezione, fare 10 ml delle seguenti soluzioni. Conservare le soluzioni massima esempio 1 mese. <ol><li> Fare una soluzione 150 mM NaCl. Regolare a pH 5.5 con 0,01 N HCl. </li><li> Fare una soluzione PEI al 10% polyethylenimine (PEI; 25 kDa lineare) in soluzione di NaCl 150 mm. Il pH della soluzione di sale a 8.8. Regolare il pH a 7,8 con 0,01 N HCl. </li></ol></li><li> 24 ore dopo la placcatura, rimuovere il supporto e aggiornare con 1,5 ml diterreno completo. Conservare le cellule a 37 ° C, in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Sotto il cabinet biosicurezza flusso laminare, in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 3 g di plasmide DNA a 25 ml di soluzione di NaCl 150 mm e 100 ml di soluzione di PEI per 3,5 centimetri piastra di Petri. </li><li> Vortex per 10 secondi, poi incubare la miscela DNA / PEI per 30 minuti a RT. </li><li> Aggiungere con cautela la miscela di DNA / PEI alla piastra di Petri contenente vetrini con le cellule e scuotere delicatamente per distribuire equamente il reagente nella scatola di Petri. </li><li> Dopo 4 ore cambiare il supporto e incubare le cellule O / N a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Effettuare esperimenti di imaging 24-48 ore dopo la trasfezione. </li></ol></li></ol> Imaging 2. Cell di Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) <ol><li> Imaging set-up <ol><li> Eseguire l&#39;imaging TIRF con il set-up descritto in Figura 1. Esso comprende un motore invertitomicroscopio (figura 1, riquadro A), la sorgente laser (Figura 1, riquadro B) e il TIRF-cursore (figura 1, riquadro C). Raggiungere l&#39;illuminazione TIRFM attraverso un elevato apertura numerica (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) olio 100X, obiettivo ad immersione. </li><li> Per illuminazione TIRFM, impiegare un multi-linea (458/488/514 nm) 100 mW argon laser-ion. Utilizzando una fibra in modalità mono, introdurre la luce laser polarizzata linearmente nel percorso ottico, tramite il cursore TIRF. Inserire il cursore TIRF nel piano diaframma di campo luminoso del percorso raggio riflesso di luce. <ol><li> Per un&#39;ampia illuminazione campo, collegare il microscopio ad un tradizionale lampada al mercurio ad arco corto HBO luce bianca. Un doppio prisma a mantenimento di polarizzazione nel cursore assicura la combinazione simultanea di illuminazione TIRF e luce bianca. </li></ol></li><li> Filtrare la luce laser con un filtro di eccitazione (larghezza di banda 488/10 nm) montato su una ruota del filtro, introdotto nel percorso laser. Impiegaread alta velocità, software-controllato, otturatore per consentire il controllo rapido dell&#39;illuminazione laser. Per l&#39;analisi pHluorin, montare una banda passante del filtro 525/50 nm emissione. Catturare immagini digitali (512 x 512 pixel) in una camera CCD raffreddata veloce con il software immagine ProPlus. </li></ol></li><li> Il raggiungimento di illuminazione TIRF (Figura 2) <ol><li> Accendere i laser, il computer, la macchina fotografica, la ruota del filtro, e dei controllori di scatto; poi, attendere 20 minuti prima di iniziare l&#39;esperimento come i laser hanno bisogno di riscaldarsi e stabilizzarsi. </li><li> Prima di imaging, rendere il volume opportune delle seguenti soluzioni. <ol><li> Effettuare 50 ml di soluzione di Krebs (KRH) a 125 mM NaCl, KCl 5 mM, 1,2 mM MgSO4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-idrossietil) piperazina-1-acido etansolfonico (HEPES) (tamponi per pH 7,4), 2 mM CaCl 2, e 6 mM di glucosio. </li><li> Fare 10 ml di soluzione KCl-KRH (pH 7,4) a NaCl 80 mm, 50 mM KCl, 1.2 MgSO4 mM, 1,2 mm KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (tamponata a pH 7,4), 2 mM CaCl 2, e 6 mM di glucosio. </li></ol></li><li> Togliere il coperchio di vetro con cellule trasfettate e inserirlo nella camera di imaging appropriata. Montare la camera e aggiungere 500 ml di soluzione KRH nel centro del vetro. </li><li> Aggiungere olio sopra l&#39;obiettivo. Posizionare la camera di imaging sul palco del microscopio e posizionare l&#39;obiettivo sotto il vetrino di vetro. Posizionare il coperchio di sicurezza sul campione. </li><li> In modalità epifluorescenza, concentrarsi sul vetrino (superficie superiore) e scegliere cellule trasfettate poste al centro della camera. Selezionare le celle cui segnale fluorescente può essere registrato in modo chiaro con un tempo di esposizione al di sotto di 80 msec. </li><li> Sotto il controllo del software, passare a illuminazione TIRF in modalità live. </li><li> Per impostare la configurazione TIRF, controllare la posizione del raggio che emerge dell&#39;obiettivo, sul coperchio del campione (Figura 2B). Quando il fascio è posizionato nel centro di tegli obiettivo (Figura 2A, a sinistra), un punto è visibile nel centro della copertura del campione TIRF (Figura 2B, sinistra) e la cella viene ripreso in modalità epifluorescenza (più piani fuoco, sfondo elevata fluorescenza; la figura 2C, sinistra) . </li><li> Per raggiungere l&#39;angolo critico, spostare il punto focalizzato nella direzione Y (in avanti o all&#39;indietro; la figura 2B, centrale) tramite la vite di regolazione dell&#39;angolo sul cursore TIRF (Figura 1C). Quando il fascio converge sul piano del campione ad un angolo superiore all&#39;angolo critico (Figura 2A, a destra), il punto scompare e diritta, sottile linea concentrata è evidente al centro del coperchio campione (Figura 2B, destra). </li><li> Per regolare l&#39;angolo TIRF utilizzare il campione di cellule (Figura 2C). Guarda l&#39;immagine di fluorescenza sul video, in questa fase, una immagine epifluorescenza simile è ancora visibile. Delicatamente, spostare la vite fino TIRF concondizione si ottiene: un solo piano ottico della cella è a fuoco (cioè, la membrana plasmatica a contatto con il coperchio antiscivolo), questo si traduce in un&#39;immagine piatta con elevato contrasto (Figura 2C, destra). </li></ol></li><li> Immagini di esempio <ol><li> Impostare l&#39;esperimento time-lapse singolo canale. Per ridurre al minimo photobleaching, catturare l&#39;immagine utilizzando il minimo di esposizione e ad alto guadagno. Tempi di esposizione adeguati sono tra i 40 - 80 msec. Acquisire le immagini a 1 - 2 Hz frequenza di campionamento. Cinetica vescicole possono essere meglio apprezzato campionamento a frequenza più alta (10 Hz). Il tempo normale di osservazione è di solito 2 min. </li><li> Aggiungere 500 ml di soluzione e registrare cellule KRH in modalità TIRFM. Questa è la condizione di riposo. Salvare le immagini sequenziali di tempo. </li><li> Focus sulla stessa cella e registrare nelle stesse condizioni di riposo (di potenza laser, tempo di esposizione, numero di telaio). Dopo cinque fotogrammi, aggiungere 500 ml di soluzione di KCl-KRH e mantenere KCl nella camera.Questa è la condizione stimolato; salvare le immagini in sequenza di tempo. </li></ol></li></ol> 3. Immagine Analisi ed elaborazione dati NOTA: Per analizzare le immagini, le macro sono state sviluppate in laboratorio, sulla base di funzioni esistenti del software di analisi di immagine; macro simili sono disponibili online (URL fornito in Tabella dei Materiali e attrezzature). <ol><li> Quantificazione dell&#39;intensità di fluorescenza <ol><li> Utilizzare una macro &quot;Sequenza intensità di fluorescenza&quot; per la quantificazione intensità di fluorescenza in una regione di interesse (ROI) dell&#39;immagine, nel corso del film. </li><li> Aprire le immagini in tempo-sequenziale. Vai al menu macro e selezionare &#39;Sequence intensità di fluorescenza&#39;. Nella finestra &#39;Analysis&#39; appare &quot;selezionare il ROI&quot;. </li><li> Scegli uno degli strumenti di selezione nel menu per creare il ROI. Mettere 3 ROI nelle regioni della membrana cellulare senza macchie (sfondo ROI). Impiegare this &quot;background ROI&quot; per valutare il photobleaching e per impostare la soglia per l&#39;analisi evento di fusione (Figura 3A). </li></ol></li><li> Photobleaching correzione e la determinazione della soglia (Figura 3B) <ol><li> Per valutare il photobleaching, aprire i fluorescenza intensità righe &quot;ROI di fondo&quot;, (Figura 3BA). Normalizzare i valori di intensità di fluorescenza in ogni fotogramma al valore intensità iniziale (F0) (F / F0) (Figura 3BB). La media dei valori. </li><li> Evidenziare i dati medi e creare un grafico linea utilizzando le opzioni del menu grafico. </li><li> Dal menu di analisi dei dati, selezionare &quot;linea di tendenza&quot; per aprire la finestra di analisi trama. Selezionare il tipo di regressione. Impostare regressione &quot;esponenziale&quot;. Quindi selezionare &quot;equazione display grafico&quot;. Nella finestra del grafico, viene visualizzata l&#39;equazione esponenziale ed i valori dei parametri vengono assegnati automaticamente, (Figura 3BC </strong&gt;). </li><li> Applicare la correzione esponenziale per i valori di intensità in ogni fotogramma come segue: Fn (corretto) = Fn / exp (-n * a) Fn = intensità di fluorescenza sperimentale misurato a telaio n; n = numero di fotogrammi; a = fattore di sbiancamento (costante che esprime il tasso di perdita di intensità a causa di photobleaching; &#160; Figura 3BD). </li><li> Per impostare la soglia, aprire un normalizzato e corretto &quot;background ROI&quot;, calcolare il segnale media di fluorescenza e la sua deviazione standard (SD). Il valore medio più 3 SD rappresenta la soglia (Figura 3BE). Utilizzare questa soglia per l&#39;analisi dei dati. </li></ol></li><li> Selezione di eventi di fusione utilizzando una procedura semiautomatica <ol><li> Aprire le immagini in tempo-sequenziale con il software di analisi delle immagini. Applicare un filtro gaussiano per la sequenza di immagini attiva. </li><li> Analizzare le immagini utilizzando funzione &quot;contare oggetti&quot; o una macro che permette la selezionedi un oggetto la cui pixel hanno intensità media di fluorescenza in un intervallo definito. Impostare l&#39;intensità gamma manualmente, utilizzando la funzione di soglia (andare al menu bar, impostare la soglia misura → per evidenziare l&#39;area di interesse). Una soglia adeguata è del 30% rispetto al segnale di fondo fluorescente locale. </li><li> Applicare una macro &quot;Filtri oggetti&quot; per selezionare solo gli oggetti che soddisfano i seguenti criteri: <ol><li> Applicare l&#39;opzione range (min e max compreso) per aspetto. Aspect riporta il rapporto tra l&#39;asse maggiore e l&#39;asse minore dell&#39;ellisse equivalente all&#39;oggetto. Aspect è sempre ≥1. I valori sono adeguati min = 1, max = 3. </li><li> Applicare gli intervalli per il diametro. Diametro riporta la lunghezza media dei diametri misurati a intervalli di due gradi unisce due punti della struttura e passante per il baricentro dell&#39;oggetto. Impostare l&#39;intervallo di pixel (o micron, se si utilizza un sistema calibrato). </li><li> Definire il range ottimale in preliminEsperimenti ary: selezionare manualmente i punti di interesse e quindi misurare il loro diametro utilizzando la funzione di profilo trama. </li></ol></li><li> Seleziona &quot;oggetti di visualizzazione&quot;: oggetti selezionati appariranno sovrapposte all&#39;immagine TIRFM (Figura 4B). </li><li> Includere nell&#39;analisi solo i punti che mostrano una breve (1-3 fotogrammi) transitorio aumento di intensità di fluorescenza, immediatamente seguita da una marcata perdita di segnale (macchie transitorie). Impiegare la selezione circolare per creare un ROI del diametro di circa un punto radialmente attorno alle vescicole / spot selezionati (ROI sperimentale). Eseguire questo passaggio manualmente. </li><li> Con le ROI selezionato, calcolare l&#39;intensità media di fluorescenza di ogni ROI nel corso del film. </li></ol></li><li> Analisi dei dati (Figura 3C-D) <ol><li> Esportare il tempo-corso dei cambiamenti fluorescenza misurati in ogni &quot;ROI sperimentale&quot; ad un foglio di calcolo; (Figura 3DA). Normalizzare il valore di intensità in ogni frame per l&#39;intensità iniziale di fluorescenza (F / F0), (Figura 3Db). </li><li> Applicare la correzione esponenziale per i valori di intensità in ciascun frame come riportato al punto 3.2.4 (Figura 3Dc). </li><li> Per calcolare il numero totale di eventi di fusione (numero di picco), la volta che si verifica ogni fusione (larghezza del picco) e l&#39;ampiezza del picco fluorescente (altezza del picco e AUC) si applicano le funzioni logiche che utilizzano fogli di calcolo o di matematica pacchetti. Un esempio di analisi degli eventi di fusione con formule logiche è riportato in Figura 3DD e 3De. </li><li> Assumere l&#39;aumento dell&#39;intensità della fluorescenza supera la soglia (intensità di fluorescenza di fondo media ± 3SD) come fusione delle vescicole alla membrana plasmatica ed il picco risultante come un evento di fusione. </li><li> Calcolare la larghezza del picco come differenza tra l&#39;ultimo ed il primo valore x di ogni picco. Moltiplicate questo valore per 1 / (frequenza di campionamento). Considerate questo valore uns il tempo di fusione delle vescicole e l&#39;adesione a livello della membrana plasmatica prima vescicole ri-acidificazione e riciclaggio (Figura 3DD). </li><li> Calcolare la AUC whole-cell come una somma di valori sopra soglia. Considerate questo valore come variazione netta fluorescente durante il tempo di registrazione grazie alla spontanea (a riposo) o evocata (stimolato) attività sinaptica. </li><li> Calcolare l&#39;altezza di picco come differenza tra il valore y massimo di ciascun picco e la soglia. Considerate questo valore come indicativo del tipo di fusione (singolo vs. fusione sequenziale / simultanea o transitoria vs. completa fusione). </li></ol></li></ol>

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Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo articolo presenta un protocollo di immagine e analizzare vescicole dinamica in cellule secernenti, utilizzando vettori cDNA codificati fluorescenti e TIRFM. Gli elementi chiave del successo di imaging da TIRFM sono la selezione del modello di cellulare e trasfezione delle cellule con indicatori ottici geneticamente codificate di rilascio delle vescicole e riciclo. TIRFM è ideale per le cellule in crescita aderenti a una copertura in vetro e sufficientemente piatto per permettere la v...

Trasmissione sinaptica chimica tra neuroni è un importante meccanismo di comunicazione nel sistema nervoso. Essa si basa sul rilascio di neurotrasmettitori attraverso un ciclo dinamico di fusione della vescicola e recupero nel sito presinaptico. Molte delle proteine ​​coinvolte nella dinamica vescicole sono stati identificati; tuttavia, il loro contributo specifico al fenomeno resta da chiarire 1. La nostra comprensione è in parte limitata dal fatto che i dosaggi più utilizzati per eso / endocitosi non sono sempre la più appropriata. Diversi studi relativi alla fusione delle vescicole e dinamiche si basano su tecniche elettrofisiologiche. Questa tecnica fornisce una risoluzione temporale ottimale ed è eccellente per studiare la fusione iniziale delle vescicole alla membrana plasmatica, ma è in grado di rilevare molti degli eventi molecolari alla base che supportano la funzione presinaptica. La microscopia elettronica, dall&#39;altro lato, fornisce la migliore morphologicaDescrizione l di ogni passo singolare, ma l&#39;aspetto dinamico della manifestazione non può essere catturato, perché i campioni devono essere fissati in modo da analizzare. L&#39;avvento di nuove tecniche di registrazione ottica 2,3, in combinazione con i progressi nella fluorescente sviluppo sonde molecolari 4-6, consente la visualizzazione dei processi di esocitosi in cellule vive, fornendo così nuovi livelli di informazioni sulla struttura e la funzione sinaptica. Gli studi iniziali sfruttati coloranti attività-dipendente stirilici (FM1-43 e coloranti organici relativi) 7,8. State-of-the-art tecniche di imaging utilizzano varianti pH-sensibili della proteina verde fluorescente (GFP) (pHluorin) legato alle vescicole luminali proteine ​​9. Queste sonde sono normalmente spenti quando presenti nelle vescicole a causa del basso pH luminale. Dopo la fusione con la membrana plasmatica, l&#39;interno della vescicola è esposta allo spazio extracellulare neutra, il pH<html> aumenta bruscamente, allevia la tempra protone-dipendente di pHluorin e appare rapidamente il segnale fluorescente. Come la variazione pHluorin è più veloce l&#39;evento di fusione, monitorando aumenti fluorescenza, vescicole fusione con la membrana può essere misurato e analizzato. Poiché molecole pHluorin-tag superficie sono endocitosi, il segnale di fluorescenza successivamente ritorna al livello basale, quindi lo stesso costrutto può anche essere usato per monitorare riciclo 9 vescicole. Mentre il pH-sensore vescicole-tagged assicura la visualizzazione solo di quelle che in realtà vescicole si fondono con la membrana plasmatica, imaging ad alta risoluzione spaziale e temporale è richiesto di descrivere in dettaglio i passi necessari nei processi endocitiche eso /. La tecnica ottico che fornisce la risoluzione spazio-temporale necessaria è riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM), un&#39;applicazione di microscopia a fluorescenza 10. &quot;&gt; Riflessione interna totale si verifica all&#39;interfaccia tra il vetro di copertura antiscivolo e il campione. Quando il percorso luce raggiunge il vetro di copertura antiscivolo con un angolo di incidenza maggiore dell&#39;angolo critico, la luce di eccitazione non è trasmesso nel campione, ma è completamente riflessa. In queste condizioni, un evanescenti forme d&#39;onda della luce all&#39;interfaccia e si propaga nel mezzo con meno densità ottica (campione). Come l&#39;intensità del campo evanescente decade esponenzialmente con la distanza dall&#39;interfaccia (con una profondità di penetrazione circa 100 nm) solo i fluorofori in vicinanza vicina alla copertura antiscivolo può essere eccitato mentre quelli più lontani dal confine no. In cellule trasfettate con GFP-costrutti, questa profondità corrisponde a proteine ​​espresse sulla membrana plasmatica o in strutture vescicolari avvicinandosi. Come fluorofori nell&#39;interno delle cellule non possono essere eccitati, la fluorescenza di fondo è ridotto al minimo, e l&#39;immagine con un segnale alto / sfondo ratio si forma 11. Diverse caratteristiche rendono TIRFM la tecnica di scelta per il monitoraggio vescicole dinamica. Il contrasto perfetta e l&#39;alto rapporto segnale-rumore rapporto permettono di rilevare segnali molto bassi derivanti dalle singole vescicole. Basato su chip di acquisizione delle immagini in ogni fotogramma fornisce la risoluzione temporale necessario per rilevare i processi altamente dinamici. Infine, l&#39;esposizione minima di cellule a luce in qualsiasi altro aereo nel campione riduce fortemente fototossicità e consente la registrazione lungo time-lapse durata 12. L&#39;analisi dei dati rimane l&#39;aspetto più impegnativo e cruciale di questa tecnica. Il modo più semplice per monitorare fusione della vescicola è quello di misurare l&#39;accumulo di proteine ​​reporter fluorescente sulla superficie cellulare, nel tempo 13. Con l&#39;aumento della fusione, gli aumenti netti segnali di fluorescenza così. Tuttavia, questo metodo può sottostimare il processo, in particolare in grandi cellule ed in condizioni di riposo,perché i processi endocitosi e photobleaching compensare l&#39;aumento di intensità di fluorescenza a causa vescicole esocitosi. Un metodo alternativo è quello di seguire ogni singolo evento di fusione 14. Quest&#39;ultimo metodo è molto sensibile e può rivelare importanti dettagli circa i meccanismi di fusione. Tuttavia, esso richiede la selezione manuale di singoli eventi, perché procedure completamente automatizzate per seguire vescicole e di registrare la fluttuazione dei loro segnali fluorescenti non sono sempre disponibili. Osservazione delle dinamiche vescicole richiede celle di campionamento ad alta frequenza. Ciò genera una grande quantità di dati che può difficilmente essere analizzati manualmente. La proposta di questo lavoro è quello di ottimizzare la tecnica di imaging TIRFM per monitorare il basale e rilascio di neurotrasmettitore stimolato nella linea cellulare di neuroblastoma SH-5YSY, e di descrivere, passo-passo, una procedura definita in laboratorio per analizzare i dati, sia a livelli di cellule intere e single-vescicole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Vescicole sinaptiche rilasciano neurotrasmettitori alla sinapsi chimiche attraverso un ciclo dinamico di fusione e di recupero. Monitoraggio attività sinaptica in tempo reale e sezionare le diverse fasi di eso-endocitosi a livello di singolo-vescicole sono fondamentali per la comprensione funzioni sinaptiche in salute e malattia. Geneticamente codificato sonde pH-sensibili direttamente mirate a vescicole sinaptiche e Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) forniscono la risoluzione spazio-temporale necessario per seguire la dinamica delle vescicole. Il campo evanescente generato per riflessione interna totale può eccitare solo fluorofori collocati in uno strato sottile (&lt;150 nm) sopra il coperchio di vetro su cui le cellule aderiscono, esattamente dove i processi di eso-endocitosi avvengono. Le immagini ad alto contrasto risultanti sono ideali per le vescicole monitoraggio e l&#39;analisi quantitativa di eventi di fusione. In questo protocollo, SH-SY5Y umano ncellule euroblastoma sono proposti come modello utile per studiare il rilascio dei neurotrasmettitori a livello singolo vescicole da TIRFM, a causa della loro superficie piana e la presenza di vescicole dispersi. Vengono forniti i metodi per la coltivazione SH-SY5Y come cellule aderenti e per loro trasfezione con Synapto-pHluorin, così come la tecnica per effettuare TIRFM e imaging. Infine, una strategia che mira a selezionare, contare e analizzare gli eventi di fusione a livello di cellule intere e single-vescicola è presentato. Per convalidare l&#39;approccio di analisi procedura di imaging e di dati, le dinamiche di vescicole pHluorin-tag vengono analizzati sotto il riposo e stimolati (depolarizzante concentrazioni di potassio) condizioni. Depolarizzazione della membrana aumenta la frequenza degli eventi di fusione e provoca un aumento parallelo del segnale di fluorescenza netto constatato cellula intera. Analisi singola vescicola rivela modifiche di comportamento fusion-evento (altezza maggiore di picco e larghezza). Questi dati suggeriscono tha depolarizzazione potassio induce non solo un massiccio rilascio di neurotrasmettitore, ma modifica anche il meccanismo di fusione della vescicola e riciclaggio. Con la sonda fluorescente caso, questa tecnica può essere impiegata in sistemi cellulari diversi per sezionare i meccanismi di secrezione costitutiva e stimolata.

Le procedure TIRF imaging e analisi dei dati descritti sono stati concepiti per studiare vescicole dinamiche in sistemi cellulari. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare gli effetti di molecole di segnalazione e farmaci sugli eventi di fusione e le dinamiche neurotrasmettitore vescicole 17. Utilizzando proteine ​​di membrana plasmatica GFP-tagged, l&#39;analisi TIRFM è stato impiegato per caratterizzare il traffico costitutiva di GFP-tagged trasportatori del glutammato in gliali e cellule ...

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  Università degli Studi di Milano. This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

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Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Ricerca

Neuroscienze

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

Test di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte del neuroblastoma da parte di iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized cells use this process to execute vital body functions such as insulin secretion from &#946; cells and neurotransmitter release from chemical synapses. Owing to its physiological significance, exo-/endocytosis has been one of the most studied topics in cell biology. Many tools have been developed to study this process at the gene and protein level, because of which much is known about the protein machinery participating in this process. However, very few methods have been developed to measure membrane lipid turnover, which is the physical basis of exo-/endocytosis.
This paper introduces a class of new fluorescent lipid analogs exhibiting pH-dependent fluorescence and demonstrates their use to trace lipid recycling between the plasma membrane and the secretory vesicles. Aided by simple pH manipulations, those analogs also allow the quantification of lipid distribution across the surface and the intracellular membrane compartments, as well as the measurement of lipid turnover rate during exo-/endocytosis. These novel lipid reporters will be of great interest to various biological research fields such as cell biology and neuroscience.

This protocol presents a fluorescence imaging method that uses a class of pH-sensitive lipid fluorophores to monitor lipid membrane trafficking during cell exocytosis and the endocytosis cycle.

Misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...