Ringraziamo Homaira Nawabi, Frederic Moret e Isabelle Sanyas per il loro aiuto. Questo lavoro è supportato da CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B e A.J sono supportati rispettivamente da borse di studio La Ligue contre le cancer e Labex DevWeCan.

1. Strategia di clonazione per taggare il recettore PlexinA1 con pHluorin
<ol><li>Scegli un vettore di espressione appropriato come spinadorsale (ad esempio il vettore di espressione plexinA1 del recettore del topo, un dono gentile del Dr. Andreas Puschel11). Nota: Questo vettore plexinA1 è stato progettato per ottenere un efficiente inserimento del recettore con tag HA o VSV nella membrana plasmatica.</li>
	<li>Amplificare da PCR la sequenza di codifica della pHluorina eclittica utilizzando il plasmide adeguato come modello(ad esempio il recettore GABA A con tag pHluorin, un dono gentile del Dr. Jacob2). Se necessario, aggiungere un sito di restrizione all'estremità 5 ' del primer per facilitare la fase di clonazione nella spina dorsale.</li>
	<li>Inserire la sequenza di pHluorina nel fotogramma tra il peptide del segnale e la sequenza di codifica delrecettore utilizzando siti di restrizione ( ad esempio siti di restrizione NruI/Kpn2I come descritto nella figura 1B). Nota: Poiché il peptide del segnale che garantisce il corretto targeting dei recettori è scisto, la pHluorina deve essere posizionata dopo di essa. Ciò garantisce il riconoscimento del peptide del segnale e impedisce la scissione della pHluorina dal recettore di interesse.</li>
	<li>Sequenziare i costrutti ottenuti per garantire che nessuna mutazione sia stata introdotta dalla PCR.</li>
</ol>2. Caratterizzazione del recettore taggato con pHluorina in vitro nelle cellule COS7
La capacità della proteina di fusione di raggiungere la membrana plasmatica e la sua reversibile perdita di fluorescenza man mano che il pH viene abbassato possono essere confermate utilizzando la seguente procedura.
<ol><li>Giorno 1. Piastra 1,5 x 105 cellule COS7 in un piatto con fondo di vetro da 35 mm in 2 ml di mezzo aquila modificato di Dulbecco completo (DMEM - siero bovino fetale al 10% - 1 mM di piruvato di sodio - 25 U/ml penicillina/stretomicina - 2,5 μg/ml Amphotericina B - pH 7,4).</li>
	<li>Giorno 2. Celle transfette: Nota: le cellule devono essere confluenti al 70-80%.<ol>
<li>Preparare 200 μl NaCl 150 mM e aggiungere 3 μg di DNA, cioè il recettore vettoriale codificante con tag pHluorina. Delicatamente vortice e girare brevemente verso il basso. Nota: Una mappa del vettore pHluorin-plexinA1 utilizzato in questi esperimenti è mostrata nella figura 1B.</li>
		<li>Aggiungere 10 μl di reagente di trasfezione (o la quantità appropriata del reagente utilizzato). Vortice immediatamente.</li>
		<li>Incubare 10 minuti a RT.</li>
		<li>Aggiungere 200 μl del reagente di trasfezione/miscela DNA alle cellule.</li>
		<li>Spostare delicatamente la piastra per ottenere la ripartizione della miscela e posizionare le cellule nell'incubatore a 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 3. Rimuovere il mezzo di trasfezione e sostituirlo con 2 ml di DMEM fresco completo.</li>
	<li>Giorno 4. Eseguire immagini di cellule vive di cellule trasfetate COS7 pHluorin-plexinA1:<ol>
<li>Preparare due aliquote di dmem mezzo completo e regolare il pH rispettivamente a 3,5 e a 9,5. Nota: Per una piastra da 35 mm, sono necessari 1,5 ml di ogni soluzione per eseguire l'esperimento.</li>
		<li>Rimuovere il supporto cellulare e sostituirlo con 1 ml di DMEM pH medio completo 7.4.</li>
		<li>Preparare una siringa da 5 ml con un tipo appropriato di tubi per iniettare vari componenti direttamente nel mezzo di coltura cellulare senza aprire la camera del microscopio.</li>
		<li>Utilizzare un modulo che consenta la manutenzione di un'atmosfera di lavoro umida di 37 °C, 5% CO2. Nota: Un approccio alternativo all'uso di una camera di CO2 è quello di utilizzare un mezzo tamponato con HEPES (di solito nell'intervallo di 10-25 mM a seconda del tipo di cella).</li>
		<li>Posizionare le cellule nella camera e regolare il tubo e la siringa. Nota: Il microscopio deve essere equilibrato prima di iniziare a evitare deriva meccanica durante la registrazione.</li>
		<li>Aprire il software di imaging e selezionare il programma di acquisizione multidimensionale.</li>
		<li>Trova celle COS7 trasfette con l'obiettivo 40X e segna la posizione nel software per ognuna di esse.</li>
		<li>Configurare la pila Z in modo da avere un'acquisizione di profondità di 15 μm (la messa a fuoco può cambiare quando si aggiungono supporti nella piastra).</li>
		<li>Impostare l'esposizione per il filtro GFP e la fase.</li>
		<li>Configurare i tempi di acquisizione. Nota: Per l'intero esperimento con 5 campi di interesse, l'acquisizione ogni 20 secondi per 10 minuti dovrebbe essere sufficiente.</li>
		<li>Inizia l'acquisizione e scatta 5 immagini di controllo in dmem pH 7.4 medium.</li>
		<li>Sospendere l'acquisizione, iniettare 1,25 ml di pH 3.5 dmem completo per ottenere un pH di 5,5 nel mezzo di coltura, contrassegnare l'evento nel software e riprendere l'acquisizione per altri 5 punti di tempo. Nota: la fluorescenza verde dovrebbe scomparire progressivamente.</li>
		<li>Sospendere l'acquisizione, iniettare 1,2 ml di pH 9,5 dmem completo per ottenere un pH 7.4 nel mezzo di coltura, contrassegnare l'evento nel software e riprendere l'acquisizione per altri 5 punti di tempo. Nota: La fluorescenza verde dovrebbe riapparire sulla membrana plasmatica.</li>
		<li>Analizza le immagini. La figura 2 mostra le immagini rappresentative ottenute con tale protocollo con il costrutto pHluorin-plexinA1.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. In ovo Elettroporazione del costrutto pHluorin-plexinA1
<ol><li>Manipolazione delle uova prima dell'elettroporazione:<ol>
<li>Conservare le uova fecondate in frigorifero a 14 °C fino a una settimana prima dell'incubazione.</li>
		<li>Incubare le uova a 38,5 °C (101,3 °F) in un'incubatrice con umidità satura per 50-52 ore fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio HH1412. Nota: Le uova devono essere posizionate orizzontalmente durante l'incubazione in modo che l'embrione sia correttamente posizionato per l'elettroporazione, galleggiando sulla parte superiore del tuorlo. Lo stadio HH14 è adatto per ottenere l'espressione dei plasmidi nei neuroni differenziati nel midollo spinale e nel ganglio della radice dorsale con un adeguato tasso di sopravvivenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embrioni elettroporati8-10:<ol>
<li>Preparare l'elettroporazione:<ol>
<li>Preparare plasmidi di DNA senza endotossine con una concentrazione superiore a 2 μg/μl, per poterlo diluire come concentrazione desiderata.</li>
			<li>Tirare abbastanza capillari di vetro per iniettare le diverse soluzioni di DNA.</li>
			<li>Preparare PBS sterile (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicillina/streptomicina ed equilibrare a 38,5 °C.</li>
			<li>Sterilizzare il cappuccio, le forbici curve e le forcep fini.</li>
			<li>Controllare la spaziatura degli elettrodi. Nota: viene generalmente utilizzato uno spazio di 4 mm tra gli elettrodi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Finestral'uovo 13 (Figura 3A):<ol>
<li>Usa forbici curve per perforare il guscio sul lato smussato dell'uovo.</li>
			<li>Rimuovere 2 ml di albume utilizzando un ago da 0,9 mm x 25 mm e una siringa da 5 ml. Orientare l'ago verticalmente per evitare di danneggiare il sacco del tuorlo.</li>
			<li>Coprire la parte superiore dell'uovo con nastro adesivo per mantenere l'integrità del guscio.</li>
			<li>Usando forbici curve, perforare il guscio al centro del nastro per equalizzare la pressione quando si rimuovono 2 ml di albume dall'uovo. Quindi, taglia una finestra abbastanza grande da visualizzare l'embrione ed essere in grado di lavorarti.</li>
			<li>Aggiungere ~2 ml di PBS caldo sterile (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicillina/streptomicina per evitare la disidratazione dell'embrione e renderlo più accessibile al manipolatore.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Iniettare DNA ed elettroporare l'embrione<ol>
<li>Diluire il plasmide in PBS (-Ca2+; -Mg2+) ad una concentrazione compresa tra 0,5-2 μg/μl e aggiungere colorante verde veloce per raggiungere una concentrazione finale dello 0,025%. Caricare il mix di DNA in un capillare. Si consiglia l'uso di un iniettore. Nota: Verificare che la resistenza capillare non sia né troppo grande (il che significa che potrebbero esserci difficoltà durante l'iniezione di embrioni) né troppo piccola (il che significa che il capillare potrebbe essere troppo grande e potrebbe danneggiare l'embrione). Inoltre, la concentrazione di acidi nucleici superiori a 2 μg/μl può causare effetti non specifici e deve essere controllata.</li>
			<li>Forare il tuorlo-sacco e il tubo neurale sul lato caudale con il capillare caricato. Entra nel tubo neurale con un angolo poco profondo e riempi il lume dalla coda alla testa con il mix di DNA(Figura 3B). Nota: Il verde veloce consente di controllare l'accuratezza dell'iniezione.</li>
			<li>Posizionare rapidamente gli elettrodi di platino da 4 mm su entrambi i lati del tubo neurale al livello che si desidera elettroporare e applicare 3 impulsi a 31 V per 50 msec con intervalli di 500 msec(Figura 3C). Nota: Evitare di posizionare gli elettrodi sul cuore o su grandi vasi embrionali extra per evitare di danneggiare l'embrione in via di sviluppo. Le bolle dovrebbero formarsi sugli elettrodi.</li>
			<li>Con l'ago, rimuovere 2 ml di albume per diminuire il livello nel guscio.</li>
			<li>Sigillare la finestra e il lato smussato ermeticamente con del nastro adesivo.</li>
			<li>Rimettere le uova a 38,5 °C nell'incubatrice fino a raggiungere lo stadio desiderato.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Incorporamento e criosezione degli embrioni
<ol><li>48 ore dopo l'elettroporazione, raccogliere con cura embrioni elettroporati (stadio HH24). Tagliare il nastro e metà della membrana corioallantoide. Per evitare che gli embrioni sprofondano nel tuorlo, posizionare un colino sotto l'embrione e tagliare la seconda metà della membrana corioallantoide.</li>
	<li>Trasferire l'embrione in un piatto di dissezione riempito con PBS ghiacciato.</li>
	<li>Controlla l'efficienza dell'elettroporazione cercando la fluorescenza nel tubo neurale con un microscopio stereo a fluorescenza. Nota: La coelettroporazione di un plasmide di controllo che codifica per la RFP può aiutare a visualizzare l'area elettroporata.</li>
	<li>Sezionare embrioni utilizzando un microscalpel per selezionare l'area elettroporata del midollo spinale.</li>
	<li>Trasferire embrioni sezionati su una piastra a 24 po', fissarli in pH 7,4 4% Paraformaldeide (PFA) - Phosphate Buffer Saline (PBS), O/N a 4 °C. Nota: La fase di fissazione è fondamentale per consentire la stabilizzazione della pHluorina nella sua conformazione "viva" e quindi essere in grado di utilizzare la pHluorina nel tessuto fisso / permeabilizzato. Sebbene la fissazione rallenti drasticamente il cambiamento di fluorescenza dipendente dal pH, si deve tenere conto del fatto che i cambiamenti conformazionali / protonazione possono ancora verificarsi dopo la fissazione. Pertanto, il seguente protocollo (incorporamento, criosezioni e osservazione) deve essere eseguito entro 3 giorni dalla fase di fissazione, con tutti i buffer a pH 7. Se la fissazione non è necessaria, si consiglia di eseguire osservazioni su sezioni di tessuto vivo.</li>
	<li>Rimuovere il 4% di PFA e lavare gli embrioni in pH 7.4 PBS.</li>
	<li>Incubare gli embrioni in saccarosio PBS-15% e conservarsi a 4 °C fino a quando gli embrioni affondano.</li>
	<li>Incubare embrioni fissi in pH 7,4 7,5% gelatina- 15% saccarosio per 45 min a 37 °C in modo che gli embrioni siano completamente incorporati.</li>
	<li>Posizionare gli stampi di incorporamento sul ghiaccio e aggiungere 400 μl di pH 7,4 7,5% di gelatina- 15% di saccarosio per ottenere una base solida di 2 mm.</li>
	<li>Aspirare l'embrione incorporato con una punta tagliata e posizionare l'embrione sulla base di gelatina solida.</li>
	<li>Coprire con pH 7,4 7,5% gelatina- 15% saccarosio e posizionare l'embrione con pini prima che la gelatina si solidifichi.</li>
	<li>Una volta che la gelatina è solida, preparare un bagno isopropanolo -40 °C (utilizzare ghiaccio secco o azoto liquido) e congelare il blocco di gelatina per 5 minuti.</li>
	<li>Mantenere i blocchi congelati a -80 °C.</li>
	<li>Posizionare il blocco congelato a -20 °C per 1 ora.</li>
	<li>Rimuovere lo stampo e fissare il blocco su un mandrino con un mezzo di polietilene glicole.</li>
	<li>Una volta che il blocco è ben fissato, posizionare il mandrino nel sistema criostato. Nota: utilizzare diapositive rivestite per evitare la perdita di tessuto durante la colorazione.</li>
	<li>Eseguire criosezioni seriali (di solito vengono eseguite criosezioni da 20 μm).</li>
	<li>Lasciare asciugare le criosezioni per 15 minuti a RT. Nota: le criosezioni devono essere protette da un'esposizione alla luce non necessaria per evitare lo sbiancamento della fluorescenza GFP.</li>
</ol>5. Analisi microscopica delle criosezioni
<ol><li>Criosezioni reidrate in pH 7.4 PBS a RT per 10 min. Nota: se necessario, i nuclei possono essere macchiati con Hoechst.</li>
	<li>Utilizzare una soluzione di Hoechst da 0,5 μg/ml in PBS e incubare criosezioni per 15 minuti.</li>
	<li>Risciacquare le diapositive 3 volte con pH 7.4 PBS per 5 min.</li>
	<li>Procedere al montaggio dello scivolo. È possibile utilizzare una soluzione di montaggio alcoliche polivinilico pH 7.4 (o più basico) che indurisce O/N: posizionare con cura il coverslip per evitare la formazione di bolle d'aria tra lo scivolo e il coverslip.</li>
	<li>Lasciare indurire il mezzo di montaggio O/N a 4 °C al buio.</li>
	<li>Utilizzare un microscopio confocale invertito per visualizzare con precisione la proteina fusion pHluorin-plexinA1: eseguire z-stack al foro di spillo ottimale e risoluzione ottica e utilizzare lenti 20X (NA 0.75) o 40X (NA 1.3). Nota: la pHluorina è rilevabile con gli stessi parametri utilizzati per rilevare la GFP(cioè picco di emissione a 509 nm). Le impostazioni del filtro di eccitazione e rilevamento della lunghezza d'onda sono definite in modo ottimale dal software di imaging. Hoechst viene rilevato tra 425-460 nm (l'eccitazione è a 405 nm), GFP o pHluorin viene rilevato tra 485-545 nm (l'eccitazione è a 473 nm) e RFP viene rilevato tra 575-675 nm (l'eccitazione è a 559 nm).</li>
</ol>Immagini rappresentative dell'espressione pHluorin-plexinA1 ed eGFP nel midollo spinale dell'embrione del pulcino sono mostrate nella figura 4.

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).</li><li>Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+cell+labeling+for+cell+tracing+in+avian+development.">Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development.</a> CSH Protoc.. 2008, (2008).</li><li>Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application.">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li><li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses.">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li><li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per seguire la dinamica di un recettore di guida dell'assone sia nella coltura cellulare che nel contesto dello sviluppo del midollo spinale dell'embrione del pulcino.
Per progettare una proteina etichettata con pHluorina de novo, è necessario considerare due punti per quanto riguarda la strategia di clonazione. In primo luogo, l'etichetta pHluorina deve essere esposta al lume degli endosomi acidi e, di conseguenza, al compartiment...

Durante la loro navigazione, gli assoni integrano più segnali ambientali che li guidano verso il loro obiettivo. Questi segnali attivano recettori di guida sulla superficie dei terminali di axon, i coni di crescita, che a loro volta avviano un'appropriata via di segnalazione. Pertanto, la regolazione temporale e spaziale della distribuzione della superficie cellulare dei recettori è fondamentale per impostare la sensibilità del cono di crescita1. In questo contesto, l'attraversamento della linea mediana da parte degli assoni commissurali è un modello eccellente per indagare la regolazione dei livelli superficiali delle cellule recettoriali. Nel midollo spinale in via di sviluppo, gli assoni commissurali sono inizialmente attratti verso la piastra del pavimento ventrale dove attraversano la linea mediana. Dopo l'attraversamento, perdono la loro reattività agli attrattori della piastra del pavimento e ottengono risposta ai repellenti per piastre del pavimento in modo che possano uscire dalla piastra del pavimento e navigare verso la loro destinazione finale nel lato contralaterale del sistemanervoso 2,3. La regolazione della disponibilità del recettore sulla superficie del cono di crescita è uno dei meccanismi alla base del passaggio di reattività ai segnali della lineamediana 4,5. Pertanto, il monitoraggio selettivo dei recettori presenti nella membrana plasmatica dei coni di crescita è di primaria importanza. Descriviamo qui un metodo basato sulla proprietà di fluorescenza dipendente dal pH di una variante di proteina fluorescente verde (GFP) per visualizzare specificamente i recettori di guida dell'assone che sono indirizzati alla membrana plasmatica in vitro e in vivo,nel midollo spinale del pulcino in via di sviluppo.
Rothman e colleghi progettati da mutazioni puntili varianti sensibili al pH della GFP tra cui la pHluorina eclittica6. La pHluorina eclittica ha la proprietà di essere non fluorescente se esposta al pH acido (<6), pur essendo fluorescente a pH neutro. Ciò consente di distinguere i recettori non fluorescenti localizzati nei compartimenti acidiintracellulari (cioè endosomi, vescicole di traffico) dai recettori fluorescenti incorporati nella membrana plasmatica e quindi esposti al pH neutro extracellulare7. Ne abbiamo approfittato per monitorare la localizzazione della membrana plasmatica della plexinA1, un recettore di guida dell'assone che media la risposta del cono di crescita alla semaphorin repellente della linea mediana 3B5 (Figura 1A). Descriviamo qui la caratterizzazione in vitro di un costrutto pHluorin-plexinA1, insieme all'elettroporazione ovo 8-10 di questo costrutto nel midollo spinale del pulcino in via di sviluppo seguito dall'analisi microscopica delle criosezioni che consentono di seguire la dinamica del recettore della guida dell'assone in vivo con risoluzioni spaziali e temporali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">COS7 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:219px;">CRL-1651</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">DMEM GlutaMAX</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:264px;">Exgen500 reagent</td>
			<td style="width:147px;">Euromedex Fermentas</td>
			<td style="width:219px;">ET0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">PBS -Ca2+ -Mg2+</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fast green dye</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscopy</td>
			<td style="width:219px;">15714-S</td>
			<td>Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryomount</td>
			<td style="width:147px;">Histolab</td>
			<td style="width:219px;">00890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Hoechst 34580</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:219px;">H21486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:219px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Bottom-glass 35 mm dish</td>
			<td style="width:147px;">MatTek</td>
			<td style="width:219px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">5 ml Syringe</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">SS-05S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Needles 0.9 mm x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Capillaries</td>
			<td style="width:147px;">CML</td>
			<td style="width:219px;">PP230PO</td>
			<td>capillaries are stretched manually in the flame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">10316-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">Dumont #5 REF#11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Equipment/software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Time lapse microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:219px;">Observer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Temp module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">CO2 module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:147px;">Metamorph</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Eggs incubator</td>
			<td style="width:147px;">Sanyo</td>
			<td style="width:219px;">MIR154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electroporator apparatus</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electrodes</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY611P7-4</td>
			<td>4 mm platinum electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">LEICA</td>
			<td style="width:219px;">MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryostat</td>
			<td style="width:147px;">MICROM</td>
			<td style="width:219px;">HM550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;">FV1000, X81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluoview software</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLC Main Workbench software</td>
			<td style="width:147px;">CLC Bio</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo

Durante lo sviluppo, i recettori di guida dell'assone svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della sensibilità degli assoni a segnali attraenti e ripugnanti. Infatti, l'attivazione dei recettori di guida è il primo passo dei meccanismi di segnalazione che consentono alle punte dell'assone, ai coni di crescita, di rispondere ai ligandi. Come tale, la modulazione della loro disponibilità sulla superficie cellulare è uno dei meccanismi che partecipano all'impostazione della sensibilità del cono di crescita. Descriviamo qui un metodo per visualizzare con precisione la dinamica superficiale della cellula spazio-temporale di un recettore di guida dell'assone sia in vitro che in vivo nel midollo spinale del pulcino in via di sviluppo. Abbiamo approfittato della proprietà di fluorescenza dipendente dal pH di una variante di proteina fluorescente verde (GFP) per rilevare specificamente la frazione del recettore di guida dell'assone che è indirizzata alla membrana plasmatica. Descriviamo prima la convalida in vitro di tali costrutti dipendenti dal pH e ne dettagliamo ulteriormente l'uso in vivo,nella corda spinale del pulcino, per valutare la dinamica spazio-temporale del recettore della guida dell'assone di interesse.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> Figura 1. A. Schema delle proprietà di fluorescenza pHluorin-plexinA1 in un contesto cellulare. La pHluorina non è fluorescente nei compartimenti intracellulari dove il pH è acido (<6) come nelle vesciche di traffico o negli endosomi ed è fluorescente quando esposto al mezzo extracellulare dove il pH è ...

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Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Descriviamo qui l'uso di una variante di proteina fluorescente verde sensibile al pH, la pHluorina, per studiare la dinamica spazio-temporale dei recettori di guida dell'assone che trafficano sulla superficie cellulare. Il recettore taggato con pHluorina è espresso sia in coltura cellulare che in vivo, utilizzandol'elettroporazione dell'embrione del pulcino.

Uso di pHluorin per valutare la dinamica dei recettori di guida axon nella coltura cellulare e nell'embrione del pulcino

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Views.  University of Lyon. Descriviamo qui l'uso di una variante di proteina fluorescente verde sensibile al pH, la pHluorina, per studiare la dinamica spazio-temporale dei recettori di guida dell'assone che trafficano sulla superficie cellulare. Il recettore taggato con pHluorina è espresso sia in coltura cellulare che in vivo, utilizzandol'elettroporazione dell'embrione del pulcino.

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Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Ricerca

Neuroscienze

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

L'uso di traccia Eyeblink condizionamento classico per valutare la disfunzione Hippocampal in un modello del ratto dei disturbi dello spettro fetale alcol

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Uso di neuroni ippocampali coltivati primari per studiare l'assemblaggio dei segmenti iniziali di Axon

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Isolamento e cultura dei neuroni del Ganglione Ciliario

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury are essential for translating novel therapeutic strategies from rodent models to clinical application due to their closer similarities to humans in size and anatomy. Here we describe some in vivo methods to evaluate the function and structure of the retinal ganglion cells (RGCs) and optic nerve (ON) in large animals, including visual evoked potential (VEP), pattern electroretinogram (PERG) and optical coherence tomography (OCT). Both goat and non-human primate were employed in this study. By presenting these in vivo methods step by step, we hope to increase experimental reproducibility among different labs and facilitate the usage of large animal models of optic neuropathies.

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

Here we demostrate several in vivo tests (flash visual evoked potential, pattern electroretinogram and optic coherence tomography) in goat and rhesus macaque to understand the structure and function of the optic nerve and its neurons.

In vivo Metodi per valutare la funzione e la struttura delle cellule gangliari retiniche e del nervo ottico in animali di grandi dimensioni

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury ...

Methods Article

Uso di pHluorin per valutare la dinamica dei recettori di guida axon nella coltura cellulare e nell'embrione del pulcino