Negli ultimi decenni, la durata della vita umana è stata estesa, a causa del miglioramento del tenore di vita e dei progressi nella scienza medica. L'età è il principale fattore di rischio per molte malattie potenzialmente letali, tra cui i disturbi neurodegenerativi, come l'Alzheimer, il morbo di Parkinson e il morbo di Huntington. Qui, dimostriamo metodologie che utilizzano alcuni nuovi modelli di metodo versatili, tra cui necrosi indotta da canali ionici iperattivi e aggregati proteici induce la neurotossicità, per monitorare e sezionare il meccanismo molecolare cellulare della degenerazione neurale.
Picco di larve healthful di fare quattro e fare tre nematodi Newton su nematode crescita media piastra, setacciando con E.Coli utilizzando sezionando microscopio stereo. Posizionare dieci e quattro nematodi, piastra enzimatica parassita e farli crescere alla temperatura standard, di 20 gradi celsius. Cinque giorni dopo, lavare la piastra con 1 ml e 9 tampone e raccogliere gli animali in un tubo da 1,5 ml.
Centrifugare a 30.000 g per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di placcatura. La soluzione di placcatura viene conservata a temperatura ambiente.
Vortice e monitor periodicamente fino a quando non si sono sciolti tutti. Evitare la placcatura per periodi superiori a cinque minuti. Centrifugare a 10.000 g per 30 secondi e rimuovere il supernatante.
Lavare il doppio della tavolozza con 1 mL e nove buffer. Centrifugare a 10000 g per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Dopo il lavaggio, rimorsi le uova in 200 microlitri M9 tamponare e incubarle per 25 minuti, a 34 gradi Celsius in un bagno d'acqua.
Mantenere un gruppo separato di uova a 20 gradi Celsius. Pipettare 100 microlitri contenenti uova trattate con controllo o shock termico e posizionarle su una piastra da 10 GN senza piombo. Ogni piatto contiene almeno da 100 a 200 uova.
Incubare le uova a 20 gradi celsius fino alla schiusa. Utilizzare e M9 tamponare per lavare le piastre e raccogliere la durata dell'L1 e i nematodi in un tubo da 1,5 ml. Centrifuga a 10.000 g per 30 secondi.
Rimuovere il supernatante e mantenere la tavolozza. Aggiungere 100 microlitri di tampone levangiale M9 da 20 millimolare per anestetizzare i nematodi. Pipetta 10 microlitri di tampone levangiale M9, contenenti orologio L1 e montarli in un punto 2%agar-ls posizionare delicatamente un coverslip sulla parte superiore del campione.
Osservare l'orologio utilizzando la microscopia DIC. Scansione della degenerazione dei 630 neuroni recettoriali contando le cellule con un caratteristico aspetto virtualmente aiutato di quel nematode. Sincronizza i nematodi selezionando e trasferendo da 15 a 20 larve L4 di ciascuna in sforzo sui batteri C e poi sulle piastre GM.
Incubare e lasciare che i nematodi crescano alla temperatura standard di 20 gradi Celsius. Eseguire la precondizione giornaliera per 30 minuti trasferendo le piastre in un incubatore impostato a 34 gradi Celsius. Quindi riportare i nematodi precondizione alla temperatura standard di 20 gradi Celsius.
Aggiungere 10 microlitri di tampone levangiale M9 da 20 millimolare al centro del punto agar-ls. Raccogliere i rispettivi nematodi transgenici e trasferirli in caduta levangiale M9. Posizionare da 20 a 30 nematodi per goccia.
Posizionare delicatamente coprire lo scivolamento sulla parte superiore del campione. Sigillare lo scivolo del coperchio con smalto per preservare l'umidità durante tutto il processo di imaging. Utilizzando un microscopio a fluorescenza combinato con una fotocamera, rileva e cattura le immagini di studio della regione della testa con un ingrandimento di 20 x.
Monitora sette giorni di nematodi transgenici per la morte delle cellule neuronali dopaminergiche. Misurare gli aggregati policulali neuronali nella regione testa di animali transgenici di quattro giorni che esprimono 240 fusioni con persone vive. La morte necrotica delle cellule ha indotto un canale ionico iperattivo è il più principale nei nematodi che hanno le uova precondizioni per shock termico precedenti.
Precondizione da shock termico, promuovendo una previsione contro la morte cellulare indotta da alfa-sinuleina nell'enfafrodite adulta di sette giorni e diminuisce gli aggregati proteici Q40 nella regione principale degli adulti di quattro giorni. L'invecchiamento è una conseguenza dei danni causati dalla graduale degenerazione dell'omeostasi cellulare e tissutale. Quindi la comprensione della manipolazione della rottura neuronale legata all'età sono le priorità dei primi posti.
Le tecniche presentate combinate con la genetica e gli schermi farmacologici potrebbero portare ad una notifica di normali modulatori di morte cellulare con potenziale interesse terapeutico.
