This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.

Questo protocollo si basa sulle seguenti risorse, che devono essere di cui per ulteriori dettagli e considerazioni particolari 3, 25-28. 1. Densità corrispondenza di micelle detergenti con 2 H 2 O Nota: La densità della soluzione tampone deve essere abbinato alla densità delle micelle detergenti. Agenti comuni densità-regolazione includono 2 H 2 O, H 2 18 O, 2 H 2 O 18, glicerolo e saccarosio 29. H 2 O 18 ha la stessa densità 2 H 2 O e può essere una scelta migliore se deuterazione di protoni scambiabili nella proteina non è desiderato. In questa procedura, la densità di 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) detersivo in 50 mM Tris pH 7,3, NaCl 100 mM sarà abbinato con 2 H 2 O. Come un tentativo iniziale le seguenti concentrazioni di2 H 2 O sarà utilizzato: 10, 30, e 50% v / v. 1.1. Preparazione del campione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni di magazzino e filtro sterilizzare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron: 50 mL Tris 500 mM pH 7,3 e 1 M NaCl (10X soluzione tampone); 1 ml 250 C14SB mm (soluzione detergente 50X). </li><li> Preparare 200 ml di soluzione campione mescolando 20 microlitri 10X tampone, 4 microlitri soluzione detergente 50X, 20 microlitri 2 H 2 O (99,9%), e 156 microlitri deionizzata H 2 O. Anche preparare 200 ml di soluzione di riferimento mescolando 20 microlitri tampone 10X, 20 microlitri 2 H 2 O (99,9%), e 160 microlitri deionizzata H 2 O. </li><li> Ripetere il punto 1.1.2 per le altre 2 H 2 O concentrazioni, cioè il 30% e il 50%, regolando gli importi 2 H 2 O e H 2 O in modo appropriato. </li></ol> 1.2. Assemblaggio di 6 canali AUC cellule e caricamento dei campioni nelle cellule. Nota: Ci sono due tipi di cellule AUC seconda del metodo di caricamento del campione. Le cellule senza riempimento esterno deve essere caricato prima della sigillatura della cella, mentre esterno-riempiono le celle possono essere caricati dopo che le cellule sono sigillati. Assemblaggio di una cella AUC esterna riempimento è stato descritto in precedenza 3. In questo protocollo, il montaggio di una cella di 6 canali AUC senza riempimento esterno è descritto. La differenza principale è che ha anelli vite su entrambi i lati che devono essere serrate separatamente e non ha bisogno di tappi di alloggiamento (Fig. 1). La differenza di fasi di montaggio sono evidenziati di seguito. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Figura 1. vista di una cella di AUC 6 canali senza riempimento esterno Esploso. Questo dato è stato modificato dalla Beckman Coulter An-50 Ti e An-60 Ti Analytical Rotor, Celle, e l&#39;utente elev manuale. <ol><li> Preparare due finestre per ogni cella AUC con finestra zaffiro invece di finestra di quarzo (Fig. 2). Posizionare la guarnizione finestra nel supporto finestra. Piegare leggermente il rivestimento finestra e posizionarlo nel supporto finestra in modo che il gap si forma di fronte alla scanalatura titolare finestra. Posizionare la finestra di zaffiro all&#39;interno della fodera finestra, allineando il segno con la chiavetta porta finestra. Nota:. La finestra di quarzo è comprimibile e quindi produrrà rifrazione più luce ad alta velocità 28, 30 Pertanto per misure di interferenza sopra 30000 rpm, come in questo esperimento corrispondenza densità, sono utilizzati finestre zaffiro. Una finestra di zaffiro è più pesante finestra di quarzo e ha una &quot;X&quot; inciso su un lato. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Figura 2. Esploso of l&#39;assemblea finestra. Questo dato è stato modificato dalla Beckman Coulter An-50 Ti e An-60 Ti Analytical Rotor, Celle, e manuale utente elev <ol><li> Posizionare la custodia cella con il numero di parte capovolta. Con le chiavette allineate con la chiave alloggi, far scorrere nel corpo cellule in primo luogo un centrotavola 6-settore con il lato smussato verso il basso, seguita da una assemblea finestra con la finestra rivolta verso il basso (Fig. 1, a sinistra). </li><li> Leggermente cappotto la rondella vite discussioni ring e ghiera con spinkote. Inserire una rondella anello vite sulla parte superiore del gruppo finestra. Installare l&#39;anello vite nell&#39;alloggiamento finestra con la scritta &quot;OUT&quot; rivolto verso l&#39;esterno. Serrare l&#39;anello di vite utilizzando lo strumento di allineamento delle cellule. </li><li> Utilizzando la chiave coppia, serrare la ghiera di soli 60 pollici-libbre. </li><li> Posizionare la cella con il numero di parte in posizione verticale e posizionato a 12-ore. Load 120 microlitri riferimento nelle righe di sinistra e di 110 campioni microlitri nelle righe giuste. Assicurarsi che ogni campione e il riferimento è abbinato correttamente. Nota: volume del campione esatta non è critica, ma il riferimento deve avere poco più volume di campione (5-10 microlitri) in modo che il menisco campione sarà distinti. </li><li> Far scorrere con attenzione nel gruppo alloggiamento della cella una finestra con la finestra rivolta verso il basso (Fig. 1, a destra). Fare attenzione a non disturbare la cellula eccessivamente e versare il contenuto. </li><li> Ripetere il passaggio 1.2. 3 e 1.2. 4, stringendo il secondo anello vite a 120 pollici-libbre. Invertire la cella e serrare il primo anello della vite a 120 pollici-libbre. </li><li> Caricare le cellule nel rotore, installare il rotore nella centrifuga e installare il monocromatore secondo le istruzioni del produttore 28. Nota: Dettagli su questo step si possono trovare anche in questo riferimento 3. </li></ol> 1.3. Impostazione misura interferenze <ol><li> Avviare il software di interfaccia utente per lo strumento AUC ed eseguire l&#39;installazione e la calibrazione laser radiale per ogni cella a 3000 rpm, secondo le istruzioni del produttore, che saranno brevemente riassunti nel passaggio seguente. </li><li> 1.3.1.1 Dopo vuoto sufficiente è stato raggiunto (&lt;100 micron), eseguire il centrifugare a 3000 rpm. Visualizzare in anteprima il modello di interferenza nel software di interfaccia utente e regolare i parametri del laser per ottenere il massimo contrasto. </li><li> Creare un nuovo file creato (File | Nuovo File) specificando &quot;Equilibrio&quot; e &quot;interferenze&quot; di misura. Impostare un metodo di sedimentazione di equilibrio (tasto &quot;Method&quot;) per l&#39;esecuzione a 45000 rpm oppure quella più alta prevista per i campioni di proteine, se superiore, con la temperatura corsa a 20 ° C e raccogliere 1 scansione ogni 15 minuti. Monitor equilibrio progressi aprendo i file di dati in HeteroAnalysis e selezionando la funzione &quot;Match&quot;, dopo almeno 12 ore (circa durante la notte, Fig. 3). Nota: una funzione simile è disponibile in SEDFIT (Opzioni | Caricamento Opzioni | Prova approccio alla Equilibrium) anche. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Figura 3. Risultato funzione HeteroAnalysis Match. La funzione match può essere utilizzata per monitorare i progressi equilibrio confrontando RMSD tra le scansioni successive e l&#39;ultima scansione. Questo esempio mostra raggiungimento dell&#39;equilibrio dopo 8 ore come indicato dai valori RMSD asintotica all&#39;asse X. 1.4. Analisi dei dati <ol><li> Per ciascuna serie di campioni, tracciare la pendenza del profilo di distribuzione radiale contro la concentrazione di H 2 O 2. Nota: La distribuzione sarà molto superficiale esponenziale che apapprocci linearità. Asse X intercetta corrisponde alla concentrazione di H 2 O 2 corrispondente. </li><li> Per precisare, eseguire l&#39;esperimento in più repliche. In alternativa, ripetere l&#39;esperimento con una gamma più ristretta di 2 H 2 O concentrazione. </li></ol> 2. sedimentazione equilibrio SH in micelle C14SB 2.1. Parametri della corsa <ol><li> Calcolare la densità e la viscosità del buffer, la proteina volume specifico parziale e velocità di centrifugazione utilizzando SEDNTERP. Per calcolare la densità e la viscosità del buffer, selezionare Calcola sezione &quot;Buffer Select&quot; e inserire i componenti tampone di conseguenza, tra cui il D 2 O concentrazione. </li><li> 2.1.1.1 Per calcolare proteina volume specifico parziale, selezionare Calcola sezione &quot;V-bar&quot; e inserire la sequenza aminoacidica della proteina. Specificare la dimensione oligomerica più alto previsto in &quot;Crea un oligomero da questo monomero: N =&quot;campo, in questo caso N = 5. Calcolare la velocità inserendo valori nel campo RPM nella finestra principale fino σ ≈ 1; questa è una regola per garantire una buona forma esponenziale del profilo di distribuzione radiale 25. Nota: I valori calcolati per questo esperimento è la seguente: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 CP = 0,7569 ml / g, ω 1 = 16000 rpm. </li><li> Calcolare velocità successivi da seguire per garantire sufficiente differenza tra il profilo di distribuzione ad una velocità e il successivo 25. Nota: questo può essere fatto anche dalla funzione &quot;Stimare rotore equilibrio velocità funzione&quot; in SEDFIT, che tiene conto della colonna soluzione (volume di riempimento). </li></ol> 2.2. Preparazione dei campioni <ol><li> Preparare 1 ml di soluzione di riferimento con 5 C14SB mM e il 32,3% 2 H 2 O, come determinato da esperimento corrispondenza densità (sezione 1), mescolando 100 microlitri di buffer 10X solution (fase 1.1.1), 20 microlitri soluzione 50X detergente (fase 1.1.1), 323 microlitri 2 H 2 O (99,9%) e 527 microlitri deionizzata H 2 O. </li><li> Sciogliere liofilizzato, peptidi SH-HPLC purificato (espressione e purificazione descritto in precedenza 31) in opportuno solvente come metanolo o 50% v / v acetonitrile acquoso. Misurare A280 dei peptidi disciolti in un microlitro scala UV spettrofotometro / Vis e aliquota per tre campioni per dare 280 A, 12mm = 0,3, 0,5, e 0,8 (A 280, 10mm = 0,25, 0,417 e 0,67) ogni volta diluito per 130 ml. Lyophilize i campioni durante la notte e risospendere in 130 ml soluzione di riferimento (punto 2.2.1) per dare le soluzioni campione. Nota: proteina SH può essere rilevato da UV / Vis assorbanza a 280 nm perché contiene Trp e Tyr residui. Proteine ​​senza residui aromatici possono essere rilevati da loro tagging con un cromoforo adeguato, utilizzando un mutante Trp contenente, o utilizzando interferiscemisure SNO invece di assorbanza. </li><li> Seguire i passaggi nella sezione 1.2 per assemblare una cella AUC 6 canali con finestre di quarzo. Caricare il campione di concentrazione più alta (A 280, 12mm = 0.8) nel canale più vicino al centro del rotore e disponibilità campione concentrazione (A 280, 12mm = 0,3) più lontana dal centro del rotore. </li></ol> 2.3. Impostazione misure di assorbanza <ol><li> Creare un nuovo file creato (File | Nuovo File) specificando &quot;Equilibrium&quot; e valutazione &quot;assorbanza&quot;. Specifica 280 nm come lunghezza d&#39;onda del rivelatore. </li><li> Eseguire la calibrazione radiale a 3000 rpm controllando &quot;calibratura Radial prima prima scansione&quot; in Opzioni di scansione, specificando la raccolta di dati a bassa risoluzione, ad esempio, con passo radiale = 0,01 centimetri, Repliche = 3 (bassa risoluzione, veloce), e l&#39;esecuzione di una scansione singola . Dopo la scansione, deselezionare l&#39;opzione. </li><li> Impostare un metodo di sedimentazione di equilibrio (&quot;Methotasto &quot;) d per girare alla prima velocità calcolata al punto 2.1.3, a 20 ° C, e raccogliere 1 scansione ogni 30 minuti. In &quot;Detail&quot; reciproche cellule, specificare la raccolta di dati a bassa risoluzione come al punto 2.3.2. Monitorare i progressi equilibrio aprendo i file di dati in HeteroAnalysis e selezionando la funzione &quot;Match&quot;, dopo almeno 18 ore (circa durante la notte, Fig. 4). Nota: raggiungimento dell&#39;equilibrio può richiedere tempo sostanzialmente più lunga per la prima velocità, mentre le velocità successive avranno meno tempo. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> Figura 4. I risultati di funzione HeteroAnalysis Match. La prima e la seconda velocità (in alto a sinistra e destra) sembrano aver raggiunto l&#39;equilibrio, ma è meglio aspettare qualche ora in più per essere sicuri. In confronto, il terzo e il quarto le velocità (in basso a sinistra ea destra) hanno chiaramente raggiunto l&#39;equilibrioin un tempo più breve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Una volta che l&#39;equilibrio è stato raggiunto, raccogliere una singola scansione ad alta risoluzione, ad esempio con passo radiale = 0,001 centimetri, Repliche = 10 (alta risoluzione, lento). </li><li> Dopo la scansione è completata, ripetere il punto 2.3.3 e 2.3.4 per la velocità successiva. </li><li> Facoltativamente, quando il tempo necessario per raggiungere l&#39;equilibrio per ogni velocità è noto (calcolata o per esperienza), impostare il metodo di scansione di sedimentazione di equilibrio a tutte le velocità calcolate nel passo 2.1.3 e per raccogliere 1 scansione dopo il tempo di equilibrio per ogni velocità. In questo caso, specificare raccolta di dati ad alta risoluzione in &quot;dettaglio&quot; reciproche cellule. </li></ol> 2.4. L&#39;analisi dei dati in SEDFIT e SEDPHAT Nota: Per ulteriori dettagli e considerazioni in lettore di analisi dei dati si riferisce to il seguente sito web: www.analyticalultracentrifugation.com. <ol><li> Aperte le scansioni ad alta risoluzione in SEDFIT (Dati | dati carico sedimentazione di equilibrio) e dividere i dati in 3 canali (queste corrispondono a diverse concentrazioni per ogni campione; Opzioni | Caricamento Opzioni | Salva 6 canali di dati grezzi in 3 sottoinsiemi). </li><li> Riaprire i file di dati che appartengono allo stesso campione e la stessa concentrazione, ma diverse velocità in SEDFIT. Regolare il menisco (linea rossa verticale), fondo cella (verticale linea blu) e limiti di montaggio (linee verdi verticali), ed esportare i dati per l&#39;utilizzo in SEDPHAT (Dati | Esportazione dati per SEDPHAT). Ingresso i parametri calcolati nel passaggio 2.1.1, così come il tipo di rotore e tipo fulcro come richiesto. Ripetere questa operazione per ogni campione e la concentrazione. </li><li> Aprire tutti i dati dallo stesso campione (tutti concentrazioni e velocità) in SEDPHAT e compilare parametri dell&#39;esperimento; un esempio è mostrato in Fig. 5. Nota: quando viene aggiunto D 2 O nel buffer, Deut<html> razione di protoni scambiabili potrebbe alterare significativamente il peso molecolare della proteina, in particolare per le proteine ​​solubili in acqua. Le proteine ​​di membrana, in particolare quelle di piccole dimensioni come la proteina SH, sono meno colpiti perché le regioni di membrana-embedded sono protetti dallo scambio. Per correggere questo, inserire il &quot;buffer D frazione molecolare&quot;. Nota: A questo punto si consiglia di salvare il set di dati modificato separatamente selezionando menu Dati | copiare tutti i dati e salvare come nuova configurazione. </li><li> Selezionare un modello e compilare parametri globali per quel modello. Nota: Ad esempio, il modello &quot;monomero-n-Mer Self-associazione&quot; ei suoi parametri sono mostrati in Fig. 6. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Figura 5. Un esempio su come compilare parametri sperimentali. files / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Un esempio di come compilare parametri globali per il modello monomero-n-Mer Self-Association. <ol><li> Eseguire un globale Fit selezionando il menu Fit | globale Fit e attendere che converge in forma. Annotare (o prendere uno screenshot) i risultati di montaggio, in particolare la riduzione del chi-quadrato globale e log K a valori. Estrarre altri dati, come i dati in forma e residui di montaggio dal menu Copia e display | display termodinamico informazioni. </li><li> Torna a parametri globali e verificare M (1) in base al peso molecolare monomero e ripetere il punto 2.4.5. Annotare il peso molecolare, arredata e globale ridotta chi-quadrato. </li><li> Ripetere il punto 2.4.3 a 2.4.6 per ogni modello da testare e confrontare la qualità adattamento di ogni modello confrontando il valore ridotto chi-quadro globale e residui di montaggio. Nota: I piccoli e casuali residui di montaggio indica generalmente una buona misura, e il modello che si adatta meglio sarebbehanno la più piccola ridotta chi-quadrato globale. Il peso molecolare monomero arredata e il suo valore chi-quadrato non dovrebbero differire in modo sostanziale da quello del (teorica) di peso molecolare fisso. </li><li> Calcola l&#39;intervallo di confidenza per il registro ottenuto Ka per valore selezionando prima Statistiche | Critical chi-quadrato per le proiezioni di superficie errore e inserendo l&#39;intervallo di confidenza desiderato. Poi, vai a Statistiche | Generare 1-dimensionale proiezione in superficie di errore e deselezionare il login Ka in dialogo parametri globali per ottenere i valori di chi-quadrato per log Ka. Nota: i lettori sono invitati a consultare le seguenti fonti (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) per maggiori dettagli sul metodo 32 e illustrazione di questo metodo 33. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+respiratory+syncytial+virus+SH+gene.">Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene.</a> J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+protein+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+forms+pentameric+ion+channels.">The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment.">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li><li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation:+Different+methods+for+density+matching.">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li><li>Laue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+20.3.">Ch. 20.3.</a> Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels.">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).</li><li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1.">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li><li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins.">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li><li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus).">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li><li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions.">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li><li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+endocytosis:+Close+encounters+of+many+kinds.">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo documento fornisce un protocollo sperimentale per la preparazione e l&#39;analisi di oligomerizzazione di una piccola proteina di membrana in detergente utilizzando equilibrio sedimentazione campione. Il protocollo descritto è ugualmente valido -e simpler- per proteine ​​solubili, non è necessaria la fase corrispondente densità. Infatti, il sistema è costituito da una miscela di detergente e proteine. Per condurre studi sedimentazione, il detergente deve essere invisibile al campo gravitazionale modo che ...

Ultracentrifugazione analitica 1-5 è uno dei metodi più importanti per studiare le interazioni di macromolecole in condizioni fisiologiche, essendo accessibile sia interazioni deboli e forti. Il metodo è privo di etichetta e utilizza assorbimento della luce o interferenze, e anche sistemi ottici fluorescenza può essere utilizzata per accedere intervalli di concentrazione di diversi ordini di grandezza 6. Questo metodo è particolarmente utile in quanto la maggior parte dei processi biochimici dipendono interazioni reversibili. La stechiometria e la forza di tali interazioni devono essere caratterizzate quantitativamente comprendere processi biologici, e un certo numero di metodi esistono per questo scopo 7, 8. Tuttavia, interazioni transienti sono difficili da studiare 9. La scelta di un metodo per caratterizzare le interazioni macromolecolari dipende dalla sua natura statica o dinamica. Nel primo caso, Sedim<html> velocità entazione (SV) viene utilizzato, dove la velocità di trasporto radiale viene misurato e complessi sono frazionata sulla base delle differenze di massa galleggiante e forma. Al contrario, le associazioni dinamiche che sono reversibili sulla scala temporale dell&#39;esperimento non possono essere separati fisicamente. In questo caso, auto o etero-interazioni conducono a interazioni non-covalenti sono in un equilibrio che dipende dalla concentrazione totale di proteine. Queste interazioni dinamiche possono essere studiati sia equilibrio di sedimentazione (SE) e la velocità di sedimentazione (SV) 10. Tuttavia, il primo metodo è semplice da eseguire e viene descritto qui. In SE, centrifugazione viene eseguita ad una velocità sufficientemente bassa in modo da raggiungere un equilibrio tra diffusione e sedimentazione. A questo punto, il profilo di equilibrio di un segnale ottico (UV-VIS) in funzione della distanza radiale, può essere analizzato usando modelli termodinamici pre-impostato per associazioni 11. ve_content &quot;&gt; Nel presente documento, uno studio sedimentazione equilibrio è presentato di auto-associazione di una proteina di membrana virale che forma canali ionici. A causa della sua idrofobicità, l&#39;esperimento viene eseguito in presenza di detergente, e in questo caso la densità di solvente deve essere abbinato a quello del detergente. Tuttavia, il protocollo descritto sarebbe identica nel caso di una proteina solubile in acqua, salvo che nessuna corrispondenza densità solvente sarebbe necessaria. La proteina utilizzata è codificato nel virus sinciziale respiratorio umano (HRSV), un pneumovirus avvolto nel famiglia Paramyxoviridae che causa malattie respiratorie del tratto inferiore nei bambini, anziani e delle popolazioni di tutto il mondo 12 immunocompromessi. Fino a 64 milioni di casi segnalati di infezione HRSV e 160.000 decessi si verificano ogni anno. Il genoma HRSV trascrive 11 proteine, comprese le tre proteine ​​di membrana F, G, e piccola idrofoba (SH). Proteina SH è coinvoltanella patogenesi dell&#39;infezione RSV. RSV manca il gene SH (RSVΔSH) è vitale, ha causato la formazione di sincizi e crebbe così come la wild-type (WT) virus 13-16. Tuttavia, virus RSVΔSH replicato 10 volte meno efficiente rispetto al WT nel tratto respiratorio superiore 15, 16. Inoltre, il virus è stato attenuato in RSVΔSH nel topo vivo e modelli scimpanzé 13, 17. La proteina SH è un (RSV sottogruppo A) 64 o 65 (RSV sottogruppo B) aminoacidi lungo tipo II proteina integrale di membrana che si accumula prevalentemente alle membrane del vano 18 Golgi. Proteina SH ha un unico previsto a-elica transmembrana (TM) di dominio 19, che è altamente conservata 20,21. I domini extramembrane C- e N-terminale sono orientati lumenally / extracellulare e cytoplasmically rispettivamente. Entrambi dominio TM sintetico (residui 18-43) E lunghezza piena SH proteine ​​hanno dimostrato di formare homopentamers in una varietà di detergenti. La forma homopentameric è responsabile per l&#39;attività del canale in doppi strati lipidici planari 22,23. Il corretto orientamento dei monomeri TM nel doppio strato lipidico è stato determinato in primo luogo con specifico sito dicroismo infrarossi 23, che ha mostrato la sua-22 per essere in un lumenal, vicino a inter-elica, orientamento. Lo stesso orientamento dominio TM è stato confermato da studi NMR che ricostruibili la pentamerica a-elica fascio della proteina intera lunghezza in dodecylphosphocholine (DPC) micelle 22. In questo modello di &#39;micelle&#39;, un singolo a- dominio TM elicoidale era affiancato N-terminale da un a-elica, e C-terminale da un esteso b-tornante. I due residui protonatable di proteine ​​SH, His-22 e His-51, si trovano nel dominio TM (lumenally orientato), e sulla punta del extramembrane C-terminale β forcella (lontano dal poro canale), rispettivamente. In un enviro bicellarnment, tuttavia, il TM α-elica si estende fino a His-51, ed entrambi i suoi residui sono accessibili al lume del canale 24. La struttura del canale adotta un imbuto architettura 22, dove la strozzatura (Ser-Cys-29 a 45) 22 è allineato con catene laterali idrofobiche (Ile-32, Ile-36, Ile-Leu-40 e 44), e Ile-36 definisce il punto più stretto nel lume del canale. His-22 si trova presso la più grande apertura di questo imbuto, che His-51 è sulla punta della piccola apertura. Nel presente documento, centrifugazione analitica in una modalità sedimentazione equilibrio è stato usato per determinare se la sua protonazione influisce sulla stabilità della proteina pentamero SH. In questo caso, la proteina SH è stato solubilizzato in detersivo C14-betaina, che è stato utilizzato in precedenza per dimostrare che le forme della proteina SH oligomeri pentamerica 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1345">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:448px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Deuterium oxide 99.8%</td>
			<td style="width:147px;">Cambridge Isotope</td>
			<td style="width:119px;">DLM-4-99.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell housing</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">334784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window holder</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window gasket</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">327021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window liner</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Sapphire window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">307177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Quartz window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw-ring washer</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw ring</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Spinkote</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">306812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Torque stand assembly</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Counterbalance</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">360219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell alignment tool</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDNTERP</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HeteroAnalysis&#160;</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDFIT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedfit.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDPHAT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedphat/default.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sedimentation equilibrium of a small oligomer-forming membrane protein: effect of histidine protonation on pentameric stability

Ultracentrifugazione analitica (AUC) può essere usato per studiare le interazioni reversibili tra macromolecole su una vasta gamma di forze di interazione e in condizioni fisiologiche. Questo rende AUC un metodo di scelta per valutare quantitativamente stechiometria e termodinamica di omo- ed etero-associazione che sono transitori e reversibili in processi biochimici. Nella modalità di sedimentazione equilibrio (SE), un equilibrio tra diffusione e sedimentazione fornisce un profilo in funzione della distanza radiale che dipende da un modello di associazione specifico. Qui, un protocollo dettagliato SE è descritto per determinare le dimensioni e monomero-monomero associazione energia di una piccola proteina di membrana oligomero utilizzando un&#39;ultracentrifuga analitica. AUC-ES è privo di etichetta, basata solo su principi fisici, e può essere utilizzato su entrambe le proteine ​​solubili e di membrana acqua. Un esempio è mostrato di quest&#39;ultimo, la piccola idrofoba (SH) proteina del virus sinciziale respiratorio umano (HRSV), Un polipeptide di 65 aminoacidi con un singolo transmembrana (TM) dominio α-elica che forma canali ionici pentamerica. Dati strutturali a base di NMR mostra che la proteina SH ha due protonatable suoi residui nel suo dominio transmembrana che sono orientate ad affrontare il lume del canale. Esperimenti SE sono stati progettati per determinare come pH influenza costante di associazione e la dimensione oligomerica di proteine ​​SH. Mentre la forma pentamerica stata conservata in tutti i casi, la costante associazione è stata ridotta a pH basso. Questi dati sono in accordo con una simile dipendenza pH osservato per l&#39;attività del canale SH, in linea con un orientamento lumenal dei due suoi residui in proteine ​​SH. Quest&#39;ultima può verificare la repulsione elettrostatica e ridotto la stabilità oligomeri a basso pH. In sintesi, questo metodo è applicabile quando informazioni quantitative sottili proteina-proteina associazione cambiamenti nelle condizioni fisiologiche devono essere misurate.

Il profilo radiale distribuzione di C14SB micelle detergenti in Tris 50 mM, NaCl 100 mM pH 7.3 forma un esponenziali molto superficiale che può essere montato su un modello lineare (Figura 7A). La pendenza di questa distribuzione è inversamente correlato alla concentrazione di D 2 O (Figura 7B). Il punto in cui la pendenza è zero, vale a dire, l&#39;abbinamento D 2 O concentrazione, è risultato essere 32,3%. Vedi Fi...

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Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

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10.5K Views.  Nanyang Technological University. Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Video: Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived phosphorescent signal when coordinated to a histidine-containing protein immobilized on the surface of a magnetic particle. Synthesis of Ir1, in high yields,is complete O/N&#160;and involves splitting of the parent cyclometalated Ir(III) chloro-bridged dimer into two equivalents of the solvated complex. To confirm specificity, several amino acids were probed for coordination activity when added to the synthesized probe, and only histidine elicited a signal response. Using BNT-II, a branched peptide mimic of the malarial biomarker Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), the iridium probe was validated as a tool for HRP-II detection. Quenching effects were noted in the BNT-II/Ir1 titration when compared to L-Histidine/Ir1, but these were attributed to steric hindrance and triplet state quenching. Biolayer interferometry was used to determine real-time kinetics of interaction of Ir1 with BNT-II. Once the system was optimized, the limit of detection of rcHRP-II using the probe was found to be 12.8 nM in solution. When this protein was immobilized on the surface of a 50 &#181;m magnetic agarose particle, the limit of detection was 14.5 nM. The robust signal response of this inorganic probe, as well as its flexibility of use in solution or immobilized on a surface, can lend itself toward a variety of applications, from diagnostic use to imaging.

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Iridium (III) luminescente sonda per il rilevamento della proteina malarica Biomarker istidina Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

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Chimica

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver chloride electrode is used extensively for potentiometric measurement of chloride ions concentration in electrolyte. In this measurement, long-term and continuous monitoring is limited due to the inherent drift and the requirement of a stable reference electrode. We utilized the chronopotentiometric approach to minimize drift and avoid the use of a conventional reference electrode. A galvanostatic pulse is applied to an Ag/AgCl electrode which initiates a faradic reaction depleting the Cl&#713; ions near the electrode surface. The transition time, which is the time to completely deplete the ions near the electrode surface, is a function of the ion concentration, given by the Nernst equation. The square root of the transition time is in linear relation to the chloride ion concentration. Drift of the response over two weeks is negligible (59 &#181;M/day) when measuring 1 mM [Cl&#713;]using a current pulse of 10 Am-2. This is a dynamic measurement where the moment of transition time determines the response and thus is independent of the absolute potential. Any metal wire can be used as a pseudo-reference electrode, making this approach feasible for long-term measurement inside concrete structures.

Dynamic measurement of chloride ions is presented. Transition time of an Ag/AgCl electrode, during a chronopotentiometric technique, can give the concentration of chloride ions in electrolyte. This method does not require a stable conventional reference electrode.

Dinamica elettrochimica Misura di cloruro di ioni

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Original Experimental Approach for Assessing Transport Fuel Stability

The study of fuel oxidation stability is an important issue for the development of future fuels. Diesel and kerosene fuel systems have undergone several technological changes to fulfill environmental and economic requirements. These developments have resulted in increasingly severe operating conditions whose suitability for conventional and alternative fuels needs to be addressed. For example, fatty acid methyl esters (FAMEs) introduced as biodiesel are more prone to oxidation and may lead to deposit formation. Although several methods exist to evaluate fuel stability (induction period, peroxides, acids, and insolubles), no technique allows one to monitor the real-time oxidation mechanism and to measure the formation of oxidation intermediates that may lead to deposit formation. In this article, we developed an advanced oxidation procedure (AOP) based on two existing reactors. This procedure allows the simulation of different oxidation conditions and the monitoring of the oxidation progress by the means of macroscopic parameters, such as total acid number (TAN) and advanced analytical methods like gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and Fourier Transform Infrared - Attenuated Total Reflection (FTIR-ATR). We successfully applied AOP to gain an in-depth understanding of the oxidation kinetics of a model molecule (methyl oleate) and commercial diesel and biodiesel fuels. These developments represent a key strategy for fuel quality monitoring during logistics and on-board utilization.

Oxidation stability of transport fuels has become a concern for future fuel development. This work presents an original methodology developed by IFP Energies Nouvelles for assessing fuel stability using two different reactors. This methodology was successfully applied to gain an in-depth understanding of the oxidation kinetics and pathways of model molecules and commercial fuels.

Approccio sperimentale originale per la valutazione Transport Fuel Stabilità

The study of fuel oxidation stability is an important issue for the development of future fuels. Diesel and kerosene fuel systems have undergone several ...

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the average content of fluorinated drugs in their formulated drug product forms: tablets or capsules. This method is specific to fluorinated drugs because it detects only the content of fluorine, avoiding interference from the excipients that lack fluorine. The advantages of measuring the active content of fluorinated drugs using low-field 19F TD-NMR versus high-field 19F solid-state (SS) NMR are the simplicity of the method; the low cost; and the non-destructive nature of the technique, with all samples recoverable in intact forms (e.g., powders, tablets, and capsules), making this technique affordable for any laboratory.
We have tested the method with three fluorinated drug products available on the market - cinacalcet, lansoprazole, and ciprofloxacin - with doses ranging from 15 to 500 mg. The results of the analyses, measured by low-field 19F TD-NMR, supported the reported label claims for the average drug content.
Based on the simplicity and reproducibility of the analysis, we envision this methodology being implemented in any laboratory, including manufacturing plants, as a process analytical technology (PAT) tool in the pharmaceutical industry.

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

A simple and non-destructive technique that measures the average content of drug substances in formulated drug products containing fluorine using low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) is presented here. The technique can be applied to the development and manufacturing of drugs in the pharmaceutical industry.

Applicazione e metodologia della tecnica NMR Non distruttivo 19F dominio del tempo per misurare il contenuto in prodotti contenenti fluoro di droga

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical photocatalytic structures. However, the influence of such chemical bonding on the optical and surface properties of the photocatalyst and thus its photocatalytic activity/reaction selectivity behavior has not been systematically studied. In this investigation, TiO2 has been supported on the surface of SiO2 by means of two different methods: (i) by the in situ formation of TiO2 in the presence of sand quartz via a sol-gel method employing tetrabutyl orthotitanium (TBOT); and (ii) by binding the commercial TiO2 powder to quartz on a surface silica gel layer formed from the reaction of quartz with tetraethylorthosilicate (TEOS). For comparison, TiO2 nanoparticles were also deposited on the surfaces of a more reactive SiO2 prepared by a hydrolysis-controlled sol-gel technique as well as through a sol-gel route from TiO2 and SiO2 precursors. The combination of TiO2 and SiO2, through interfacial Ti-O-Si bonds, was confirmed by FTIR spectroscopy and the photocatalytic activities of the obtained composites were tested for photocatalytic degradation of NO according to the ISO standard method (ISO 22197&#8722;1). The electron microscope images of the obtained materials showed that variable photocatalyst coverage of the support surface can successfully be achieved but the photocatalytic activity towards NO removal was found to be affected by the preparation method and the nitrate selectivity is adversely affected by Ti-O-Si bonding.

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The focus of the present work is to establish means to generate and quantify levels of Ti-O-Si linkages and to correlate these with the photocatalytic properties of the supported TiO2.

L&#39;effetto del legame chimico interfacciato in TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Compositi sulle prestazioni fotocatalitiche di riduzione di NOx

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

The Effect of Charging and Discharging Lithium Iron Phosphate-graphite Cells at Different Temperatures on Degradation

The effect of charging and discharging lithium iron phosphate-graphite cells at different temperatures on their degradation is evaluated systematically. The degradation of the cells is assessed by using 10 charging and discharging temperature permutations ranging from -20 &#176;C to 30 &#176;C. This allows an analysis of the effect of charge and discharge temperatures on aging, and their associations. A total of 100 charge/discharge cycles were carried out. Every 25 cycles a reference cycle was performed to assess the reversible and irreversible capacity degradation. A multi-factor analysis of variance was used, and the experimental results were fitted showing: i) a quadratic relationship between the rate of degradation and the temperature of charge, ii) a linear relationship with the temperature of discharge, and iii) a correlation between the temperature of charge and discharge. It was found that the temperature combination for charging at +30 &#176;C and discharging at -5 &#176;C led to the highest rate of degradation. On the other hand, the cycling in a temperature range from -20 &#176;C to 15 &#176;C (with various combinations of temperatures of charge and discharge), led to a much lower degradation. Additionally, when the temperature of charge is 15 &#176;C, it was found that the degradation rate is nondependent on the temperature of discharge.

This article describes the effect of dissimilar charging/discharging temperatures on the degradation of lithium iron phosphate-graphite pouch cells, aiming at simulating close to real case scenarios. In total, 10 temperature combinations are investigated in the range -20 to 30 &#176;C in order to analyze the impact of temperature on degradation.

L'effetto di carica e Scarica di celle di litio ferro fosfato-grafite a diverse temperature sulla degradazione

The effect of charging and discharging lithium iron phosphate-graphite cells at different temperatures on their degradation is evaluated systematically. ...

The Effect of Ultraviolet Radiation on the Chemical Bath Deposition of Bis(thiourea) Cadmium Chloride Crystals and the Subsequent CdS Obtention

In this work, the effects on the preparation of bis(thiourea) cadmium chloride crystals when illuminated with ultraviolet (UV) light at a wavelength of 367 nm using the chemical bath deposition technique are studied comparatively. Two experiments are performed to make a comparison: one without UV light and the other with the aid of UV light. Both experiments are performed under equal conditions, at a temperature of 343 K and with a pH of 3.2. The precursors used are cadmium chloride (CdCl2) and thiourea [CS(NH2)2], which are dissolved in 50 mL of deionized water with an acidic pH. In this experiment, the interaction of electromagnetic radiation is sought at the moment the chemical reaction is carried out. The results demonstrate the existence of an interaction between the crystals and the UV light; the UV light assistance causes crystal growths in an acicular shape. Also, the final product obtained is cadmium sulfide and shows no evident difference when synthesized with or without the use of UV light.

The Effect of Ultraviolet Radiation on the Chemical Bath Deposition of Bisthiourea Cadmium Chloride Crystals and the Subsequent CdS Obtention

This article presents a protocol for the synthesis of bis(thiourea) cadmium chloride crystals by chemical bath deposition. Two experiments are described: one aided by ultraviolet light compared to one without ultraviolet light.

L'effetto delle radiazioni ultraviolette sulla bagno chimico deposizione di cristalli di cloruro di cadmio Bis(thiourea) e il conseguente ottenimento di CdS

In this work, the effects on the preparation of bis(thiourea) cadmium chloride crystals when illuminated with ultraviolet (UV) light at a wavelength of ...

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Extraction of Lignin with High &amp;#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

Estrazione della lignina con alto contenuto di β-O-4 da etanolo lieve estrazione ed il relativo effetto sul rendimento depolimerizzazione

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition parameters such as gas flow rate that results in changes on composition and thus in the film required properties. In this report, reactive sputtering is used to deposit niobium oxide films. A niobium target is used as metal source and different oxygen flow rates to deposit niobium oxide films. The oxygen flow rate was changed from 3 to 10 sccm. The films deposited under low oxygen flow rates show higher electrical conductivity and provide better perovskite solar cells when used as electron transport layer.

Here, we present a protocol for niobium oxide films deposition by reactive sputtering with different oxygen flow rates for use as an electron transport layer in perovskite solar cells.

Pellicole dell'ossido di Niobium depositate da Sputtering reattivo: Effetto del flusso di ossigeno

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...