We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah&#8217;s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex&#8217;s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick&#8217;s Foundation Fellowship to CK.

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The authors have nothing to disclose.

In questo articolo, abbiamo dettaglio un metodo versatile e riproducibile per la generazione di nuovi modelli di GBM utilizzando integrazione SB transposase- mediata oncogeno DNA plasmide nelle cellule che circondano la zona subventricolare di topi neonati. Vi presentiamo un protocollo per generare plasmidi trasposoni nuovi geni di interesse, illustreremo come monitorare la progressione dei tumori negli animali vivi, e come caratterizzare caratteristiche isto-patologico e immunoistochimiche di questi tumori. Come il nostro laboratorio (Figura 3) e altri 13 hanno dimostrato, questo modello crea affidabile tumori con le caratteristiche salienti del GBM umano compreso (1) di necrosi pseudo-palizzata, (2) la proliferazione vascolare, (3) atipie nucleari, (4) mitosi anomale e ( 5) perivascular e invasione diffusa. L&#39;uso di topi neonati è ottimale dal punto di vista logistico, fornendo una procedura tecnica relativamente facile con attrezzatura minima e sedazione tempo / recupero, consentendo una rapida generazione di grandi dimensioni del campione di tumori con specifiche alterazioni genetiche. Questi tumori causano animali soccombere alla massa tumorale con una sopravvivenza mediana prevedibile dipendente dalle alterazioni genetiche indotte. Infine, il modello SB è stato utilizzato come schermo intervento terapeutico per la risposta al trattamento 24. Ci sono diversi fattori importanti da considerare quando si prepara le soluzioni utilizzate per le iniezioni neonatali. Soluzioni di DNA devono essere sterili, endotossina libero e concentrato (2-7 mg / ml) per consentire volume minimo di iniezioni. Il rapporto ottimale di residui di azoto nel polietilenimmina (PEI) ai residui di fosfato nel DNA (rapporto N / P) è 7. Questo assicura la formazione di complessi di particelle cariche positivamente che legano porzioni anioniche sulla superficie cellulare e saranno endocitosi. Una volta nel citoplasma, afflusso osmotica farà le particelle di scoppiare e rilasciare il Encapsulated DNA plasmide. La soluzione jet-PEI in vivo ha una concentrazione di 150 mM espresso come residui di azoto. Dato che un DNA mcg ha 3 nmol di fosfato anionico, la quantità di reagente di trasfezione necessario può essere calcolato con la formula: microlitri in vivo jet-PEI = [(ug DNA x 3) x rapporto N / P] / 150. Ad esempio, per preparare 40 ml di 0,5 mg / ml soluzione di DNA con un rapporto N / P di 7, 20 mg di DNA sono necessari. Il volume di PEI richiesto sarà di 20 * 3 * 7/150 = 2.8 ml. Fino a cinque plasmidi diversi possono essere iniettati contemporaneamente. Gli esperimenti qui presentati forniscono la Bella Addormentata trasposasi in trans su un plasmide che codifica anche luciferasi (SBLuc). Come accennato nell&#39;introduzione, il rapporto di molecole di trasposasi trasposoni è importante garantire trasposizione ottimale. Il rapporto ottimale (empiricamente fondata) del plasmide SB100x al traspOson DNA plasmidico è 1: 4. Quindi, se si utilizza due differenti plasmidi trasposoni, T1 e T2 per esempio, il rapporto di SBLuc: T1: T2 sarà 1: 2: 2; o per un totale di 20 mg di DNA in una soluzione di 40 mg di 4 ml SBLuc sarà miscelata con 8 mg di T1 e 8 mg di T2. Per tre diversi plasmidi trasposone il rapporto sarà SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1,33: 1,33: 1,33 e per quattro trasposoni: 1: 1: 1: 1: 1. È utile per verificare l&#39;assorbimento di DNA plasmidico da bioluminescenza 24-72 ore dopo l&#39;iniezione. Come gli animali crescono, la maggiore densità ottica della pelliccia, pelle, cranio e cervello, impedisce monitoraggio della progressione tumorale finché il tumore ha raggiunto una dimensione di soglia, circa 1-2 mm 3 per topi C57BL6 scuro pigmentate. Migliore trasmissione della luce è possibile in questi topi se la loro pelliccia è rasato, o quando si utilizzano topi con il bianco o senza pelliccia. Diversi limiti devono essere considerati quando si utilizza questo modello. Innanzitutto, il genemateriale tic introdotta con i plasmidi iniettato può essere integrato in modo casuale nel genoma ospite in diverse posizioni e il numero di copie. Questo può portare alla variabilità tra le cellule tumorali e tra tumori. In secondo luogo, il DNA introdotto è inserito prevalentemente in sequenze introniche TA ripetute DNA 25, invece, la possibilità di interferenza con codifica ospitante DNA genomico rimane. In terzo luogo, le iniezioni intraventricolare può causare un piccolo ma persistente tasso di idrocefalo in topi giovani, che diventa clinicamente visibile e sintomatica nel corso della settimana 3 ° -4 ° di vita. Alcuni ceppi di topi sono più inclini a idrocefalo di altri (ad esempio, C57 / BL6 più FVB). Per minimizzare il rischio di indurre idrocefalo, si raccomanda di iniettare un volume più piccolo possibile (meno di 1 ml in C57 / BL6 topi), per garantire che gli aghi sono taglienti, le soluzioni hanno una bassa salinità e fornire crescenti con cuccioli alimentare arricchito, in modo da consentire la tempestiva ossificazione del cranio bones. Infine, i tumori in fase avanzata, spesso sviluppano la necrosi, che deve essere considerato quando il monitoraggio topi bioluminescenza. Una lettura inferiore può indicare un tumore avanzato con ampie aree di necrosi e non necessariamente risoluzione del tumore come conseguenza del trattamento. In definitiva, l&#39;analisi istologica resta il gold standard per valutare la progressione del tumore. L&#39;avvento di tumore sequenziamento dell&#39;intero genoma negli ultimi anni ha aperto la porta alla esplorazione del ruolo dei geni mutati ricorrentemente in GBM. The Sleeping Beauty è il modello ottimale per la convalida dei potenziali oncogeni o soppressori tumorali. Come nell&#39;esempio proposta nel presente documento con PDGFβ ligando, clonando la sequenza cDNA murino di un oncogene candidato in un plasmide di backbone SB stabilito porterà espressione costitutiva all&#39;interno delle cellule trasfettate. Valutazione del ruolo di soppressori tumorali può essere efficacemente eseguita clonando nella spina dorsale del plasmide SB con sequenze candidati, (available per esempio nel database Codex RNAi 26), per creare robusta espressione di seconda generazione miR corto forcine. Un dibattito in corso nel campo della ricerca GBM è legata alla identità di origine cellulare-of. E &#39;stato recentemente dimostrato che nei topi, i tumori indotti da down-regolazione p53 e Nf1 in cellule staminali neurali, provengono da cellule precursori degli oligodendrociti 27. Utilizzando il modello di trasposoni Sleeping Beauty, studi simili possono essere progettati per verificare se altre alterazioni genetiche preferenzialmente bersaglio altre popolazioni di cellule staminali / cellule precursori a generare GBM. La conoscenza di tali studi permetterà di migliorare notevolmente la nostra comprensione di GBM eziologia e fornire strade per nuovi approcci terapeutici.

Glioblastoma multiforme (GBM) è il (60%) tumore cerebrale primario più comune negli adulti, con una sopravvivenza mediana di 15-21 mesi, quando trattati con la chirurgia, la radioterapia e la chemioterapia 1. Nuove terapie per GBM sono indispensabili. Terapie sperimentali richiedono test su modelli animali che riproducono in maniera adeguata le caratteristiche salienti della malattia umana. Strategie per indurre GBM nei roditori sono mutagenesi chimica con agenti alchilanti, linea germinale o alterazioni genetiche somatiche, o il trapianto utilizzando linee cellulari di glioma 2. I modelli più utilizzati impiegano l&#39;impianto di linee cellulari di glioma, sia ortotopicamente, nel cervello o sottocutanea utilizzando cellule singeniche negli animali con genotipo identico; o xenogeniche, linee più comunemente umani cellule GBM, impiantati in topi immunocompromessi 3. Xenotrapianti offrono molti vantaggi per lo studio dei tumori intracranici: comodità di riproducibilità, standatassi di crescita rdized, tempo di morte e di tumore localizzazione. Tuttavia, questi modelli hanno dei limiti a causa l&#39;approccio chirurgico artificiale, invasivo utilizzato per implantologia e limitata capacità di riprodurre accuratamente istologica tratti caratteristici di GBM umano (grado IV): pseudo-pallisading necrosi, atipie nucleari, invasione diffusa, la proliferazione di micro-vascolare e la formazione di anomalie vascolari glomeruloid 4-7. Induzione di GBM alterando il genoma delle cellule somatiche con il DNA oncogeno, sia con vettori virali 8-12, o con transposon mediata integrazione 13, riproduce più da vicino l&#39;eziologia delle malattie umane e ricapitola le caratteristiche isto-patologici di GBM umana. Storicamente, i tumori del SNC sono stati classificati in base alla cella percepita di origine, che è stato osservato, sarebbe un fattore predittivo per la sopravvivenza 14. GBM sono classificati in primaria e secondaria. Emergenti prove today punti per la natura altamente eterogenea di glioblastoma primario 15. GBM secondaria (15%), il risultato della trasformazione maligna di astrocitoma di grado basso (grado I) e astrocitoma anaplasic (grado II), sono associati con insorgenza più precoce della malattia, una migliore prognosi e un modello &quot;proneurale&quot; di espressione genica , considerando primaria GBM (85%) mostrano un esordio tardivo, cattiva prognosi e gliali (classica), neurale o pattern di espressione mesenchimali. Se questi pattern di espressione genica in correlazione con la cella effettiva di origine del tumore è ancora indagato attivamente. Accumulare dati mostrano che la combinazione di mutazioni genetiche associate con GBM è predittivo per la sopravvivenza. Ad esempio, la perdita di eterozigoticità (LOH) di cromosomi 1p / 19q, mutazioni IDH1, PDGFRα amplificazioni, sono associati con GBM secondarie, proneurale modello di espressione e una migliore prognosi, mentre EGFR sovraespressione, Notch e Sonic hedgehog attivazione via, Nf1 e PTEN perdita e le mutazioni di p53 sono correlati con neurale, classica, o mesenchimali GBM primario e prognosi peggiore 16,17. L&#39;avvento di progetti di sequenziamento su larga scala e l&#39;accumulo di numerosi campioni dei pazienti disponibili per il test porta una ricchezza di nuove informazioni per quanto riguarda le mutazioni genetiche e percorsi implicati in GBM patogenesi e nella progressione e la possibilità della medicina individualizzata, dove le terapie possono essere specificamente adattati alle le anomalie genetiche del paziente. In ultima analisi, per valutare il valore predittivo di tali mutazioni e percorsi in modo sistematico, e per testare possibili trattamenti in ogni caso, richiede modelli animali di GBM con alterazioni genetiche pre-determinati. Transposon mediata integrazione di DNA genomico offre un approccio praticabile. The Sleeping Beauty sistema trasposoni, membro del / classe di mariner Tc1 di trasposoni, è stato &quot;svegliato&quot; (costruzione) in un proce multi-stepss di mutagenesi sito specifica di un gene trasposasi salmonidi, che divenne in sospeso più di 10 milioni di anni fa 18,19. In sostanza, i trasposoni DNA fiancheggiate da sequenze specifiche (ripetizioni invertite / ripetizioni diretti: IR / DR) possono essere integrate nel genoma in maniera &quot;taglia e incolla&quot;, mediante l&#39;attività della Bella Addormentata trasposasi. Il trasposasi riconosce le estremità dei siti IR, accise il trasposone e integra in modo casuale in un altro sito DNA tra le basi T e A, basi che vengono duplicati ad ogni estremità del trasposone durante trasposizione (Figura 1a). La Bella Addormentata trasposasi è composto da tre domini, un dominio di legame trasposone, una sequenza di localizzazione nucleare e un dominio catalitico. Quattro molecole trasposasi sono tenuti a portare le due estremità del trasposone insieme e consentire trasposizione, tuttavia, se sono presenti troppe molecole di trasposasi, possono dimerize e tetramerize di inibirela reazione di recepimento 20. Una reazione trasposizione efficiente richiede un rapporto ottimale di trasposasi di trasposoni. Il DNA codificante la trasposasi può essere spedito sullo stesso plasmide con il trasposone (in cis) o su un plasmide diverso (in trans). Per assicurare il rapporto ottimale tra la trasposasi e trasposoni, un promotore di attività adeguata può essere scelta per l&#39;espressione della trasposasi (per il modello &quot;cis&quot;) o il rapporto dei plasmidi nella soluzione iniettabile possono essere ottimizzati (per la modello di &quot;trans&quot;). The Sleeping Beauty transposon sistema può essere utilizzato con successo per la genomica funzionale, mutagenesi inserzionale, transgenesi e la terapia genica somatica 21. Essendo un costrutto sintetico riprogettato per una molecola funzionale da una variante salmonide dormiente, la Bella Addormentata trasposasi non si lega ad altri trasposoni in esseri umani o di altri mammiferi 20. Fin dalla sua scoperta, l&#39;ingegneria molecolare ha Enhanced l&#39;efficacia trasposizione del sistema di trasposoni SB attraverso variazioni nelle sequenze IR e l&#39;aggiunta di dinucleotidi TATA fiancheggia la trasposone, causando i trasposoni pT2. Questi trasposoni hanno ottimizzato vincolante della SB al sito IR e una maggiore efficacia di escissione. Il trasposasi SB anche subito un significativo miglioramento; la trasposasi utilizzato negli esperimenti qui presentati è la SB100X, una trasposasi iperattivo generato da una strategia di rimescolamento DNA seguito da uno screening genetico su larga scala in cellule di mammifero 22. In questo rapporto presentiamo un metodo rapido, versatile e riproducibile per indurre intrinseca GBM in topi con non-virale, l&#39;integrazione transposon mediata di plasmide DNA nelle cellule della zona sub-ventricolare di topi neonati 23. Vi presentiamo un modo semplice per creare trasposoni con nuovi geni suscettibili di integrazione genomica utilizzando la Bella Addormentata trasposasi e dimostrare come monitorare plasmide assorbimento eprogressione della malattia con bioluminescenza. Si caratterizzano anche caratteristiche istologiche e immunoistochimiche del GBM riprodotto con questo modello. Inoltre, vi presentiamo un metodo rapido per generare linee di cellule GBM primari di questi tumori. Il Modello di bellezza di sonno, in cui i tumori sono indotti da cellule originali dell&#39;animale, permette la valutazione funzionale del ruolo dei geni candidati GBM nell&#39;induzione e progressione dei tumori. Questo sistema è anche adatto per la sperimentazione di trattamenti GBM nuove, tra cui terapie immunitarie in topi immuno-competente, senza la necessità di interventi chirurgici infiammatorie invasive, che possono alterare il microambiente locale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="952">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:367px;">Stoelting&#39;s Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors</td>
			<td style="width:199px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51670</td>
			<td style="width:267px;">Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:367px;">Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
			<td style="width:199px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">53311</td>
			<td style="width:267px;">Injections can be made without it, ,but&#160;&#160;&#160; the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:367px;">10 &#956;L 700 series hand fitted MICROLITER syringe</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">Model 701</td>
			<td style="width:267px;">This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:367px;">30 gauge gauge hypodermic needle 
			(1.25&#34;, 15o bevel)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">S/O# 197462</td>
			<td style="width:267px;">This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn&#39;t easily enter the skin), it needs to be replaced.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">in vivo-jetPEI</td>
			<td style="width:199px;">Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">201-10G</td>
			<td style="width:267px;">Aliquot in small volumes and keep at -20oC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td style="width:199px;">Goldbio.com</td>
			<td style="width:119px;">LuckK-1g</td>
			<td style="width:267px;">Other sources of firefly lucifierase are just as adequate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">HHS128-4L</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:367px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">62550-01</td>
			<td style="width:267px;">for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Advanced DMEM/F-12, no glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12634-010</td>
			<td style="width:267px;">for the culture of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">B-27&#168; Supplement (50X), serum free&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td style="width:267px;">serum free supplement for the culture of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td style="width:267px;">serum free supplement for the culture of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Normocyn</td>
			<td style="width:199px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-nr-1</td>
			<td style="width:267px;">anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:199px;">PEPROTECH</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td style="width:267px;">growth factor supplement for the culture of&#160; neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:199px;">PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td style="width:267px;">growth factor supplement for the culture of&#160; neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">HyClone HyQTase&#160; Cell Detachment Reagent&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SV3003001</td>
			<td style="width:267px;">for the dissociation of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>K749510-0590</td>
			<td style="width:267px;">for the dissociation of freshly dissected tumors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Falcon Cell Strainers mesh size 70um</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:267px;">for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Xylenes Histological grade</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C8H10</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">245-678</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Protocol Eosyn Y Solution ( intensified)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">314-631</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon mediated integration of plasmid dna into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

Per caratterizzare caratteristiche isto-patologici di glioblastomi SB-indotte, C57 / BL6 topi neonati sono stati iniettati in P1 con luciferasi plasmide codificante (pT2 / SB100x-Luc) in combinazione con plasmidi codifica trasposoni con DNA oncogeno, cioè, NRAS (Pt / CAGGS -NRASV12) e SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Figura 3c) o un plasmide codificante una breve p53 tornante con PDGFβ e un reporter GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) in combinazione con NRAS (Figura 3d). Gli animali sono stati monitorati per bioluminescenza il giorno dopo l&#39;iniezione (Figura 2a) e periodicamente fino alla fase moribonda quando sono stati sacrificati. Fase Moribund è definita come la fase clinica quando l&#39;animale diventa di mobilità mostra sintomatica ridotta, la postura ingobbita, pelliccia trasandato e perdita di peso. A volte, gli animali sviluppano convulsioni o modelli anomali di movimento, come camminare in cerchio e improvviso salto. Alla fine dell&#39;esperimento animalis sono stati anestetizzati. I cervelli sono stati perfusi, inclusi in paraffina, e trattati per ematossilina e eosina. Visualizza dati tumori che mostrano le caratteristiche di GBM umano (grado IV) con emorragie (Figura 3c),-pseudo pallisading necrosi (Figura 3e) e invasione perivascolare e diffusa nel parenchima cerebrale (Figura 3g, f). La formazione di pseudopallisades è preceduta dalla rottura di grandi navi glomeruloid con endoteli leaky (Figura 3i) che risultano nelle regioni di emorragia massiva con infiltrazione di cellule mononucleari (Figura 3h). Mitosi atipiche (Figura 3 undecies) e gigantesche cellule tumorali multinucleate (Figura 3k) sono anche patognomonico di GBM umana. Glioblastomi generata utilizzando il sistema di Sleeping Beauty trasposasi possono essere monitorati per tutta la progressione della crescita tumorale con bioluminescenza, se i plasmidi iniettatocodifica luciferasi. Un esperimento esempio è mostrato in figura 4a. Animali solitamente soccombono di carico tumorale quando luminescenza raggiunge un&#39;intensità di 10 7 -10 9 fotoni / s / cm 2 / sr. La sopravvivenza media di animali è prevedibilmente dipende dalle combinazioni di trasposoni oncogenici iniettati nel cervello neonatale, come illustrato nelle curve di sopravvivenza presentate in Figura 4b. Si noti che i tumori più aggressivi sono indotti con le ANR e SV40 LGT antigene (sopravvivenza media di 30 giorni), mentre la sopravvivenza media di animali con GBM indotte con shp53 ANR e PDGF è di 62,5 giorni, e di animali iniettati con shp53 e NRAS 83 giorni. De novo tumori formate possono essere caratterizzati immuno-istochimicamente dalla loro espressione di molecole caratteristici di tumori gliali. La Figura 5 mostra un tumore nascente (22 dpi, bioluminescenza 2x10 5 fotoni / s / cm 2 / sr), indotto con shp53e le ANR. Il plasmide shp53 iniettato codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) per consentire l&#39;identificazione delle cellule transfettate e la loro progenie (pT2 / shp53 / GFP). Cellule GFP + tumorali esprimono neurale delle cellule staminali marcatore nestina e alcune GFP + cellule esprimono anche proteina acidica fibrillare gliale (GFAP). Figura 6 illustra un tumore da un animale moribondo a 56 dpi, tumore che è stata anche indotta con shp53 / GFP e NRAS. Numerosi GFAP + astrociti circondano il tumore. Cellule GFP + tumorali esprimono nestina, ma non GFAP. Un grande vantaggio quando si utilizza questa tecnica per indurre GBM è la capacità di generare nuovi linee cellulari GBM con alterazioni genetiche uniche per mezzo dei trasposoni iniettati. Inoltre, le linee cellulari personalizzati possono essere generati utilizzando animali transgenici con il trucco genetico specifico. Queste linee cellulari sono strumentali a chiedere molte domande meccanicistici con saggi biochimici. Sono ideali per gli studi di citotossicità con romanzo chemotherapeutic agenti. figura 7 illustra una neurosfere da un tumore Beauty sonno indotto con shp53, PDGF e NRAS, mostrando espressione di GFP, che è codificata su uno dei plasmidi iniettati. Si noti che l&#39;espressione non sia altrettanto intenso in tutte le cellule, che indica la natura eterogenea di queste cellule GBM primarie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52443/52443fig1highres.jpg" /> Figura 1: (a) Rappresentazione schematica che illustra il meccanismo di &quot;taglia e incolla&quot; utilizzato dal Addormentata trasposasi integrare trasposoni nel DNA cromosomico host A plasmide trasposone donatore viene raffigurato con il gene di interesse fiancheggiata dalle ripetizioni invertite / ripetizioni dirette. (IR / DR; scatole freccia rossa) sequenze. Il trasposasi SB (verde) si lega al IR / DR, accise il trasposone e reintegra nella tra casuali TA coppie di basi dinucleotide sul DNA cromosomico host. (B) Esempio di clonazioneun gene di interesse (mPDGFβ) nella spina dorsale di un vettore SB (pKT-IRES-Katushka). Il vettore SB contiene due IR / DR sequenze ripetute (rosso) e una cassetta di espressione genica che comprende promotore ed enhancer sequenze, un sito di clonazione multipla (MCS; blu), i siti di entrata ribosomiale interne (IRES), un marcatore reporter fluorescente (Katushka: giallo), e un sito di poliadenilazione (polyA). L&#39;oncogene di interesse (mPDGFβ; arancione) è contenuta in un vettore di clonaggio pGEMT. L&#39;oncogene, affiancato da specifici siti di restrizione (NcoI / SacI) viene rilasciato dalla digestione enzimatica, e attenuato dall&#39;enzima ottundimento. Il vettore è linearizzato e smussato pure. Infine, l&#39;oncogene mPDGFβ viene inserito nel vettore di donatori per mezzo di una reazione smussato-end legatura per generare il nuovo vettore plasmide transposon:. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52443/52443fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande o</a>f questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52443/52443fig2highres.jpg" /> Figura 2: Setup sperimentale e le guide per le iniezioni intra ventricolari nei topi neonati (a) Un frame stereotassico (2) con comparatori è dotato di un iniettore automatico in possesso di una siringa da 10 ml (4). All&#39;interno della struttura U, un telaio adattatore neonatale è fissato saldamente (3). Il pannello di controllo dell&#39;iniettore automatica (1) consente la selezione precisa della siringa, il volume e la velocità del flusso (b) fotografia di un mouse neonatale (P1) con un ago inserito in corrispondenza delle coordinate necessarie per preparazioni iniettabili nel ventricolo laterale. 1.5 mm ventrale e 0,8 mm lateralmente al lambda. (c) Illustrazione di una sezione coronale attraverso il cervello di un topo neonatale (P1) evidenziando le relative dimensioni e la posizione dei ventricoli. Figura 3: tumori indotti con il sistema Sleeping Beauty trasposoni mostrano le caratteristiche istologiche GBM (a) bioluminescenza immagine umana di un neonatale pup 24 ore dopo l&#39;iniezione di intraventricolare con plasmidi codificanti NRAS, SV40 LGT (b) immagine bioluminescenza di un animale adulto (. 50 dpi) con un grande tumore indotta con shp53 ANR e PDGF. (c) ematossilina e eosina di una sezione coronale da un cervello di un topo moribondo con un tumore indotto con ANR e LGT (28 dpi). (d) Sezione coronale da un cervello di un topo moribondo con un tumore induce con shp53 ANR e PDGF. (e) necrosi Pseudopalisading, caratteristica istologica di GBM umana si osserva nei tumori de novo generati. La freccia indica celle disposte in palizzate migrano lontano dalla zona centrale di necrosi (N) (f) e (g) de novo generato tumori sono altamente invasiva, che mostra l&#39;invasione lungo i vasi sanguigni (g) e diffuso (f) nel normale parenchima cerebrale. All&#39;origine di emorragia diffondere all&#39;interno un tumore indotto con NRAS (h) Regione di emorragia massiva invasione delle cellule mononucleate (freccia), la fase iniziale di una superficie di pseudopalisading necrosi. (I) Grande nave glomeruloid con endotelio perde (freccia) e SV40 -LgT. (j) mitosi atipiche in cellule tumorali (freccia). (k) delle cellule tumorali Gigantic con più grandi nuclei (freccia). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52443/52443fig4highres.jpg" /> Figura 4: tumore animali possono essere monitorati con bioluminescenza per tutta la durata della progressione della malattia. La sopravvivenza media di animali è previsto dalla combinazione diDNA oncogeno iniettato. (A) Esempio di tracce bioluminescenti da una coorte di 7 C57 / BL6 topi. Si noti che i topi soccombono circa una settimana dopo la bioluminescenza raggiunge i 10 8 fotoni / s / cm2 / sr. (B) le curve di sopravvivenza del campione confrontando sopravvivenza mediana di animali con tumori Sleeping Beauty generati con diverse combinazioni plasmidi. La sopravvivenza media dei tumori indotti con ANR e SV40 LGT è di 30 dpi, mentre di animali con tumori indotti con shp53 ANR e PDGF o shp53 e NRAS è rispettivamente 62,5 dpi o 83 dpi. dpi: giorni dopo l&#39;iniezione. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52443/52443fig5highres.jpg" /> Figura 5: Nascente macroscopico GBM (22 dpi) indotta con shp53 e NRAS mostrano l&#39;espressione di nestina e GFAP in GFP + cellule tumorali (microscopio confocale) Panel (a) mostra un tumore nascente che esprime GFP.. Panel (b) rappresenta lo stesso campo che mostra espressione nestina. Pannello <strong&gt; (c) è una sovrapposizione di (a) e (b) illustrare co-localizzazione di nestina e GFP. (D) l&#39;espressione GFP nelle cellule tumorali. (E) espressione GFAP in alcune cellule tumorali e cellule circostanti il tumore nascente. (F) di proiezione Overlay (d) e (e) illustrano alcune cellule tumorali (bianco) co-esprimono GFAP e GFP. Barre di scala in (a) e (d) rappresentano 75 micron. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52443/52443fig6highres.jpg" /> Figura 6: GBM indotta con shp53, NRAS e PDGF da un animale moribondo (56 dpi) mostrando GFP e l&#39;espressione di nestina nelle cellule tumorali e abbondante colorazione per il maturo GFAP marcatore gliali che circonda il tumore Panel (a) rappresenta Nissl macchia di sezione acoronal. attraverso il cervello di un animale moribondo con un tumore (blu intenso colorazione from maggiore cellularità) indotta con la Sleeping Beauty sistema trasposoni usando shp53, PDGFΒ e NRAS. Pannello (b), una sezione adiacente coronale a quello illustrato nel grafico (a) trattata con la colorazione nucleare DAPI, mostrando espressione di GFP nelle cellule tumorali. Panel (c) rappresenta un microscopio confocale del confine tumore mostrando espressione GFP nel tumore, identificato dalla alta densità nucleare con DAPI. Pannello (d) illustra lo stesso campo di vista come in (a), che mostra espressione GFAP intensa in celle adiacenti al tumore. Pannello (e) rappresenta la sovrapposizione dei pannelli (c) e (d). Panel (f) è una microfotografia confocale del confine tumore, mostrando espressione GFP in cellule tumorali. Pannello (g) rappresenta lo stesso campo di vista come in (f), che mostra l&#39;espressione di nestina nelle cellule tumorali. Pannello (h) è la proiezione sovrapposizione dei pannelli (f) e (g) <strong&gt;. bar Scala in (c) rappresenta 150 micron e (f) rappresenta 75 micron. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52443/52443fig7highres.jpg" /> Figura 7:. Neurosfere da Sleeping Beauty tumore indotta con shp53, PDGF e NRAS dopo 5 giorni di cultura, di passaggio 2. Le cellule esprimono GFP codificate sul shp53 PDGF plasmide (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) Panel (a) è un microscopio campo chiaro di una neurosfere. Pannello (b) rappresenta una micrografia epi-fluorescenza della stessa vista come in (a) mostra l&#39;espressione della GFP nelle cellule neurosfere. Pannello (c) rappresenta la sovrapposizione dei pannelli (a) e (b).

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Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

12.8K Views.  University of Michigan School of Medicine. Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

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Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to cause/exacerbate well documented neonatal disorders including neurological impairment 1-3. Decreased adenosine triphosphate production occurs due to a lack of oxidative phosphorylation. To compensate for this energy deprived state molecules containing high energy phosphate bonds are degraded 2. This leads to increased levels of adenosine which is subsequently degraded to inosine, hypoxanthine, xanthine, and finally to uric acid. The final two steps in this degradation process are performed by xanthine oxidoreductase. This enzyme exists in the form of xanthine dehydrogenase under normoxic conditions but is converted to xanthine oxidase (XO) under hypoxia-reperfusion circumstances 4, 5. Unlike xanthine dehydrogenase, XO generates hydrogen peroxide as a byproduct of purine degradation 4, 6. This hydrogen peroxide in combination with other reactive oxygen species (ROS) produced during hypoxia, oxidizes uric acid to form allantoin and reacts with lipid membranes to generate malondialdehyde (MDA) 7-9. Most mammals, humans exempted, possess the enzyme uricase, which converts uric acid to allantoin. In humans, however, allantoin can only be formed by ROS-mediated oxidation of uric acid. Because of this, allantoin is considered to be a marker of oxidative stress in humans, but not in the mammals that have uricase.
We describe methods employing high pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography mass spectrometry (GCMS) to measure biochemical markers of neonatal hypoxia ischemia. Human blood is used for most tests. Animal blood may also be used while recognizing the potential for uricase-generated allantoin. Purine metabolites were linked to hypoxia as early as 1963 and the reliability of hypoxanthine, xanthine, and uric acid as biochemical indicators of neonatal hypoxia was validated by several investigators 10-13. The HPLC method used for the quantification of purine compounds is fast, reliable, and reproducible. The GC/MS method used for the quantification of allantoin, a relatively new marker of oxidative stress, was adapted from Gruber et al 7. This method avoids certain artifacts and requires low volumes of sample. Methods used for synthesis of MMDA were described elsewhere 14, 15. GC/MS based quantification of MDA was adapted from Paroni et al. and Cighetti et al. 16, 17. Xanthine oxidase activity was measured by HPLC by quantifying the conversion of pterin to isoxanthopterin 18. This approach proved to be sufficiently sensitive and reproducible.

A method is described to measure biochemical markers of neonatal hypoxia-ischemia. The approach utilizes high pressure liquid chromatography (HPLC) and Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS).

Misure biochimiche di ipossia neonatale

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to ...

Ricerca

Medicina

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

Uso di un modello animale di sepsi per valutare nuove terapie a base di erbe

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

La misurazione e trattamento di soppressione in Ambliopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Identificazione dei<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Inserimenti trasposone nei tumori solidi utilizzando Linker-mediata PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Image-guided Convection-enhanced Delivery into Agarose Gel Models of the Brain

Convection-enhanced delivery (CED) has been proposed as a treatment option for a wide range of neurological diseases. Neuroinfusion catheter CED allows for positive pressure bulk flow to deliver greater quantities of therapeutics to an intracranial target than traditional drug delivery methods. The clinical utility of real time MRI guided CED (rCED) lies in the ability to accurately target, monitor therapy, and identify complications. With training, rCED is efficient and complications may be minimized. The agarose gel model of the brain provides an accessible tool for CED testing, research, and training. Simulated brain rCED allows practice of the mock surgery while also providing visual feedback of the infusion. Analysis of infusion allows for calculation of the distribution fraction (Vd/Vi) allowing the trainee to verify the similarity of the model as compared to human brain tissue. This article describes our agarose gel brain phantom and outlines important metrics during a CED infusion and analysis protocols while addressing common pitfalls faced during CED infusion for the treatment of neurological disease.

Convection-enhanced delivery (CED) has been proposed as a treatment option for a wide range of neurological diseases. In order to prepare health care professionals for adoption of CED, accessible training models are needed. We describe the use of agarose gel as such a model of the human brain for testing, research, and training.

Immagine-guida di consegna convezione-enhanced in gel di agarosio Modelli del cervello

Convection-enhanced delivery (CED) has been proposed as a treatment option for a wide range of neurological diseases. Neuroinfusion catheter CED allows ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Un modello di Piglet neonatale Hypoxic-ischemica Encefalopatia

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

I modelli chirurgici di reflusso gastroesofageo con Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Infarto del miocardio in topi neonati, un modello di rigenerazione cardiaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...