This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer&#8217;s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).

Eseguire tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. Le procedure qui descritte sono stati esaminati e approvati dal Baylor College of Medicine Istituzionale Animal Care and Use Committee. Virus adeno-associato (AAV) vettori replica-incompetente per la consegna del transgene nel cervello di roditori sono approvati per la sicurezza biologica di livello 1 uso. Consultare il sito web di CDC per la pubblicazione governo degli Stati Uniti &quot;Biosafety in Microbiologia e laboratori biomedici (BMBL)&quot; che elenca in dettaglio i requisiti specifici in materia di procedure di protezione e di gestione virus corretto. Verificare con il personale veterinario e ambientale della sicurezza locale per imparare requisiti specifici per le procedure istituzionali che utilizzano virus. Regolamento in materia di camere di procedura, la quarantena, e l&#39;identificazione di gabbie a rischio biologico variano a seconda delle istituzioni. 1 Prepare P0 Pups e Foster Madri <ol><li> Fornire alta chow grasso per tutte le donne incinte e che allattano per sostenere le richieste energetiche di allevamento e l&#39;allattamento. </li><li> In serata, impostare una gabbia di allevamento con l&#39;aggiunta di uno o due femmine sane alla gabbia di un singolo maschio residente. La mattina seguente, verificare le femmine per una spina di accoppiamento e separare le femmine dai maschi se una spina è presente. <ol><li> Utilizzare madri adottive per sollevare cuccioli da un background genetico con scarse caratteristiche materne (per esempio, C57BL / 6 o C3HeJ). Madri adottive accettano cuccioli di un&#39;altra cucciolata, se i cuccioli ceduti sono nati entro quattro giorni dalla propria cucciolata della madre adottiva. </li><li> Impostare una gabbia di accoppiamento separato con ICR o femmine FVB accanto gli allevatori sperimentali in modo che i due gruppi di donne forniscono approssimativamente nello stesso tempo. </li></ol></li><li> Le femmine consegnerà in 19 ± 1 giorni dalla data di presa, a seconda del ceppo sfondo. Tre giorni prima della delivery (16 giorni dopo la data di spina), posizionare la femmina incinta in una gabbia pulita con materiale di nidificazione fresco e un riparo coperto. </li><li> Verificare la presenza di cuccioli appena nati due volte al giorno a partire 2 giorni prima della data di consegna prevista (17 giorni dopo la data di presa). Esaminate la gabbia con minimo stress per le madri sbirciando attraverso il fondo per la presenza di neonati rosa. I topi di solito offrono cuccioli di mattina, ma in rare occasioni consegnerà in pomeriggio. </li><li> Pianificare di eseguire iniezioni non appena i cuccioli in allattamento (che sarà evidente dalle macchie di latte visibili), o entro 6 ore di nascita, a seconda di quale viene prima. </li></ol> 2 Preparare Attrezzature per iniezione <ol><li> Preparare una siringa 10 ml con un ago da 32 G per neonati generali P0. Se si esegue l&#39;iniezione stereotassica, montare la siringa sul braccio manipolatore. </li><li> Se si utilizza un telaio stereotassico per preparazioni iniettabili, raffreddare la fase neonatale a 4-8 ° C con l&#39;aggiunta di 100% ethanolo e ghiaccio secco al serbatoio all&#39;estremità anteriore del blocco. Mantenere la temperatura superiore a 1 ° C per evitare il congelamento dei cuccioli. </li></ol> 3 Preparare diluizioni virali per iniezione <ol><li> Preparare una soluzione trypan colorante blu 1% (20x magazzino). </li><li> Preparare aliquote 5-25 microlitri di virus adeno-associato (AAV) stock all&#39;interno di un armadio biosicurezza di classe 2. Posizionare questi aliquote a -80 ° C per un uso futuro. Evitare ulteriori cicli di gelo-disgelo in quanto questo provoca il virus a perdere efficacia trasduzione. </li><li> Rimuovere un&#39;aliquota di AAV da -80 ° C freezer e posto sul ghiaccio a sciogliersi. </li><li> Preparare la soluzione virale iniettabile diluendo il virus in soluzione salina ghiacciata 1x tampone fosfato (PBS). Inizia con una diluizione seriale di dieci volte (10 ottobre - 10 AGOSTO particelle virali / emisfero) per l&#39;ottimizzazione iniziale del modello di trasduzione. </li><li> Aggiungere 20x trypan blu alla soluzione AAV ad una concentrazione finale di 0,05%. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Messa in scena il Newborn Pups per iniezione <ol><li> Posizionare una piastra di alluminio piccolo sul ghiaccio per raffreddare. Inserite un compito asciutto pulire sulla parte superiore della piastra per proteggere la pelle del cucciolo dal metallo freddo. Questo serve come superficie fredda piana per anestetizzare e l&#39;iniezione i cuccioli. </li><li> Preparare un tampone di riscaldamento adatto per tenere i topi neonatale caldo prima e dopo l&#39;iniezione. </li><li> Una volta che i cuccioli appena nati hanno cominciato a infermiera, eliminare circa la metà di loro dalla gabbia e lasciare l&#39;altra metà con la loro madre. Posizionare i cuccioli raccolti sul pad di riscaldamento in attesa di iniezione. NOTA: Se la madre biologica non si preoccupa per i cuccioli, rimuovere l&#39;intera cucciolata dalla gabbia immediatamente e posizionare i cuccioli su un pad di riscaldamento in attesa di iniezione. Tale situazione può presentarsi con la prima cucciolata nata a C57BL / 6 femmine o con altri ceppi inbred che presentano scarse caratteristiche di allevamento. In questa situazione, macchie di latte non saranno visibili su cuccioli appena nati. </li><li>Trasferire un pup dal pad riscaldamento sulla piastra di metallo freddo per indurre l&#39;anestesia ipotermia. Attendere 2-3 minuti per il cucciolo a diventare completamente anestetizzato. Confermare anestesia comprimendo molto delicatamente una zampa e monitor per mancanza di movimento o la respirazione. </li></ol> 5 Iniezione di AAV in topi neonati <ol><li> A mano libera iniezione intracranica di AAV in topi neonatale: <ol><li> Carico 5 ml di AAV diluito con il 0,05% trypan blu nella siringa di iniezione. </li><li> Pulire delicatamente la testa del cucciolo anestetizzato con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%. </li><li> Identificare i siti di iniezione a due quinti della distanza dalla sutura lambda per ogni occhio. Un sito di iniezione alternativo si trova a circa 0,8-1 mm lateralmente dalla sutura sagittale, a metà strada tra lambda e bregma. Questi punti di riferimento sono visibili attraverso la pelle a P0. </li><li> Segnare il sito di iniezione con una penna laboratorio non tossico. </li><li> Tenere la siringa con la scala visibili monitrollo del volume di soluzione erogata. </li><li> Assicurarsi che il pollice può raggiungere la parte superiore del pistone. Quindi rimuovere il pollice dal pistone durante il posizionamento dell&#39;ago per evitare accidentalmente erogazione virus. </li><li> Trovare una posizione comoda per bloccare il braccio per l&#39;iniezione mettendo il gomito sul banco e appoggiato il braccio sul secchiello del ghiaccio. </li><li> Posare il cucciolo su un fianco con la testa direttamente sotto la siringa. Girare la testa del cucciolo in modo che il sito di iniezione marcato rivolto verso l&#39;alto, e delicatamente ma con fermezza tenere questa posizione con la mano aperta. </li><li> Tenere la siringa perpendicolare alla superficie del cranio e inserire l&#39;ago al sito di iniezione marcata ad una profondità di circa 3 mm. Iniettare l&#39;ago fino a quando la resistenza diminuisce leggermente, che indica che l&#39;ago è penetrato nel ventricolo laterale. Se è necessario un riferimento, segnare tre millimetri dalla punta dell&#39;ago con il creatore non tossico. Regolare la profondità di iniezione per le dimensioni dei cuccioli e la tensione sulla base dye targeting dei ventricoli. </li><li> Tenere la siringa rigidamente in modo che il pistone può essere premuto senza spostare l&#39;ago più lontano nel cervello. Se l&#39;iniezione viene spostato nel talamo, diffusione virale sarà fortemente limitata. </li><li> Iniziare lentamente iniettando virus, mentre il monitoraggio del volume erogato dalla siringa. Somministrare un volume massimo di 2 microlitri in ciascun ventricolo. Se l&#39;ago è in posizione corretta, il colorante si diffonderà per riempire il ventricolo. </li><li> Estrarre lentamente l&#39;ago. </li><li> Lasciare che il primo sito di iniezione per chiudere prima di iniettare l&#39;altro emisfero. NOTA: Non iniettare lo stesso sito più di una volta. Reinserire il virus forze ago che è già stato iniettato a trapelare e provoca lesioni o morte del cucciolo. </li><li> Iniettare il ventricolo controlaterale utilizzando la stessa procedura. </li></ol></li><li> Iniezione stereotassica di AAV in topi neonatale: <ol><li> Carico 5 ml di AAV diluito con 0.05% trypan int bluo la siringa di iniezione detenuta dal manipolatore stereotassica. </li><li> Inserire delicatamente la testa del cucciolo tra le sbarre orecchio del telaio neonatale. Assicurarsi che la testa sia livello dell&#39;asse Y (anteriore a quella posteriore), controllando che la linea tra lambda e bregma è parallelo al palco. Assicurarsi che la testa sia livello dell&#39;asse X (lato a lato), controllando che una linea immaginaria tra le orecchie, o una linea tra gli occhi, è parallela allo stadio. </li><li> Pulire delicatamente la testa del cucciolo anestetizzato con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%. </li><li> Utilizzare il manipolatore stereotassico per posizionare la siringa sopra lambda e quindi azzerare le coordinate X e Y. Spostare le braccia stereotassica a (X, Y) = (0,8, 1,5) mm per cuccioli P0 standard. NOTA: le dimensioni Pup e coordinate stereotassica possono variare a seconda del ceppo ed età. Regolare coordinate basate su iniezioni di tintura come necessario per indirizzare i ventricoli laterali. </li><li> Abbassare lentamente l&#39;ago nel sito di iniezione. La superficie del cranio indent e quindi rilasciare una volta che l&#39;ago è penetrato la pelle. Ritrarre l&#39;ago fino a che il cranio recupera la sua normale forma concava, ma mantenere la smussatura dell&#39;ago sotto la pelle. ZERO coordinata Z, a questo punto. </li><li> Inserire l&#39;ago fino a Z = -1.7 mm e poi rientrare a -1.5 mm. </li><li> Iniettare lentamente il virus. Ogni emisfero può accogliere fino a 2 ml di soluzione. </li><li> Tenere la siringa in posizione per 30-60 secondi dopo aver completato l&#39;iniezione e poi lentamente retrarre l&#39;ago sopra 1-2 min. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per l&#39;emisfero controlaterale, utilizzando le coordinate negative in asse X per il sito di iniezione. NOTA: le coordinate alternativi per l&#39;iniezione sono (X, Y, Z) = (0.8, 2.0, -1.5) mm e (1.2, 1.0, -1.5) mm. Eseguire la prima iniezione a (0.8, 2.0), per poi passare a (0.8, -2.0), (1.2, 1.0) e infine (1.2, -1.0). Iniettare 1 ml di soluzione in ogni sito, per un totale di 2 ml per ogni emisfero. Muoversi rapidamente tra le iniezioni per completare la procedura in less di 10 min. </li></ol></li></ol> 6. post-iniezione di cura <ol><li> Dopo aver completato le iniezioni in entrambi gli emisferi, posizionare il cucciolo di nuovo sulla rampa di riscaldamento fino alla sua temperatura corporea e la pelle color ritorno alla normalità e il cucciolo comincia a muoversi. </li><li> Se si utilizza la madre biologica di allattare i neonati iniettati, restituire i cuccioli iniettato alla madre biologica dopo che il recupero normale movimento. Posizionare i restanti cuccioli uninjected sul pad riscaldamento. Ripetere la procedura fino a quando sono state iniettate tutti i mouse. </li><li> Se si utilizza una mamma adottiva per allattare i neonati iniettati, trasferire tutti i cuccioli iniettati alla madre adottiva per la cura dopo il loro recupero movimento normale. <ol><li> Rimuovere la maggior parte o tutti i cuccioli appartenenti alla madre adottiva dalla gabbia per assicurare il successo degli animali iniettati. </li><li> Se i cuccioli della madre adottiva e iniettati cuccioli hanno lo stesso colore degli occhi e della pelle, contrassegnare i cuccioli dalla madre adottiva con una penna laboratorio in modo che possano esseredistinto più tardi. </li><li> Posizionare cuccioli della madre adottiva e alcuni di loro biancheria da letto insieme con i cuccioli iniettati. Assicurarsi che i cuccioli iniettate acquisiscono il profumo della sua prole biologica per migliorare l&#39;accettazione dei nuovi cuccioli. </li><li> Mettere solo i cuccioli iniettate nuovamente dentro la gabbia della madre adottiva. Abbattere ogni residuo cuccioli dalla madre adottiva. </li></ol></li><li> Assicurarsi che la madre sta partecipando ad allattare i cuccioli e iniettati entro 10 minuti della loro immissione nella gabbia. Se la madre non raccoglie i cuccioli entro questo tempo, trasferire i cuccioli di un&#39;altra madre adottiva. </li><li> Etichettare la gabbia con una carta di rischio biologico per mostrare che esso contiene animali viralmente-iniettati. Casa la gabbia in una zona approvato per 72 ore. </li><li> Dopo il periodo di quarantena 72 ore, trasferire la madre e cuccioli (ma non di biancheria da letto o altri oggetti gabbia) per una gabbia pulita. Eseguire questo trasferimento all&#39;interno di un cabinet di livello 2 di biosicurezza per evitare l&#39;esposizione a qualsiasi assestamento viralmente contaminati. Return la gabbia pulita con gli animali iniettati alla struttura normale mouse. </li><li> Posizionare la gabbia sporca in un sacchetto di rischio biologico, sterilizzare in autoclave, e poi tornare la gabbia al vivaio. </li></ol> 7 Cleanup <ol><li> Posizionare la soluzione virus restante a 4 ° C per un uso futuro. Il virus mantiene efficienza di trasduzione per almeno 2 mesi se conservato a 4 ° C 8. </li><li> Disinfettare l&#39;ago per l&#39;iniezione e la siringa con il 2% di candeggina seguita da risciacqui ripetuti in acqua deionizzata. </li><li> Pulire l&#39;area di lavoro con il 2% di candeggina seguito dal 70% di etanolo. </li><li> Raccogliere tutti gli elementi usa e getta compresi puntali per pipette, tubi, mascherina e guanti in un sacchetto di plastica a rischio biologico. Smaltire i materiali di scarto, come richiesto dalla legge locale e politiche istituzionali (cioè autoclave o incenerire). </li></ol> 8 Preparare Brains mouse per Imaging <ol><li> Inserire un topo iniettato in una camera di anidride carbonica eutanasia a 34 settimane dopo l&#39;iniezione. Seguire le linee guida istituzionali per le procedure di eutanasia corrette. Non profumato animali con paraformaldeide come questo placare l&#39;etichetta fluorescenza. </li><li> Rimuovere tutto il cervello dal cranio e fissare per 3-12 ore in 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° C. </li><li> Trasferire il cervello fissata al 30% di saccarosio per crioprotezione. Incubare a 4 ° C fino al cervello scende sul fondo. </li><li> Raccogliere un secchio di ghiaccio secco finemente tritato. Tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana. Bury le due metà del cervello nel ghiaccio secco a congelare. </li><li> Raffreddare la fase microtomo con l&#39;aggiunta di ghiaccio secco e il 100% di etanolo. </li><li> Fissare il cervello al palco con la linea mediana verso il basso con PBS, e permettere di congelare. </li><li> Sezione attraverso il cervello a 30-45 micron di spessore utilizzando un microtomo congelamento scorrevole. </li><li> Inserire sezioni in piastre da 24 pozzetti contenenti soluzione antigelo (250 ml glicerolo, 300 ml di glicole etilenico, tampone fosfato 500 ml di 0,1 M, pH 7,4). Piastre di copertura with stagnola e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li><li> Raccogliere sezioni 1-4 pozzetti e lavare 3 volte in PBS. </li><li> Mount sezioni su vetrini da microscopio e coprioggetto. Lasciare i vetrini ad asciugare in un luogo buio. </li><li> Diapositive immagine utilizzando filtri appropriati per nativo YFP o tdTomato per controllare il modello trasduzione virus. </li></ol>

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	<li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).</li><li>Sun, B., Gan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+expression+in+the+central+nervous+system+with+lentiviral+vectors.">Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors.</a> Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).</li><li>Passini, M. A., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+gene+delivery+and+structure-specific+patterns+of+expression+in+the+brain+after+intraventricular+injections+of+neonatal+mice+with+an+adeno-associated+virus+vector.">Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector.</a> J Virol. 75, 12382-12392 (2001).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+(AAV1)+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice.">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77, 7034-7040 (2003).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).</li><li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain.">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+formulations+that+enhance+physical+stability+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy.</a> Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).</li><li>Bauer, H. C., Bauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+of+the+blood-brain+barrier:+still+an+enigma.">Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma.</a> Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).</li><li>Cearley, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+repertoire+of+AAV+vector+serotypes+mediate+unique+patterns+of+transduction+in+mouse+brain.">Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses.">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo descritto un procedimento versatile per la manipolazione genica neuronale utilizzando AAV come veicolo di distribuzione capillare nel cervello neonatale topo. Rispetto ad altri metodi di transgenesi neuronale, come in utero elettroporazione 1 o iniezione stereotassica intracranica 2,3, iniezione virale neonatale è relativamente facile e semplice. La procedura di base può essere eseguita in pochi minuti con solo un cestello di ghiaccio e una siringa microlitro. Sopravvivenza ottimale e di ...

I metodi tradizionali per modificare l&#39;espressione genica neuronale richiedono tempo e costosa manipolazioni linea germinale. Alternativa de novo approcci come in utero elettroporazione o iniezione stereotassica lentivirali dare risultati più rapidi e sono meno costosi, ma hanno lo svantaggio di richiedere un intervento chirurgico complesso di 1-3. Inoltre, l&#39;espressione del transgene ha una gamma limitata spaziale con questi metodi. Qui, descriviamo un metodo veloce, facile ed economico per la manipolazione neuronale diffusa tramite iniezione intraventricolare di virus adeno-associato (AAV) nel cervello neonatale mouse. Il metodo è stato descritto da John Wolfe e Marco Passini, nel 2001, dove hanno suggerito piccola dimensione delle particelle di AAV ha permesso di diffondere all&#39;interno del fluido cerebro-spinale che passa dai ventricoli laterali attraverso la barriera ependimale immaturo e nel parenchima cerebrale 4, 5. Iniezione intraventricolare di AAV all&#39;interno del first 24 ore dopo che i rendimenti nascita diffusa di trasduzione virale di sottoinsiemi neurali che abbracciano tutte le regioni del cervello, dai bulbi olfattivi per il tronco cerebrale 6,7. Transgeni viralmente-consegnati sono espressi e attiva entro giorni di iniezione e persistere fino a un anno dopo la trasduzione. Così, questa manipolazione versatile consente studi che spaziano dallo sviluppo del cervello postnatale precoce invecchiamento e la degenerazione nell&#39;adulto. In adattando la tecnica alle nostre esigenze sperimentali specifiche, ci siamo concentrati principalmente sulla AAV8 sierotipo perché è il più efficiente a trasduzione neuroni 6. Mostriamo che il titolo virale può essere diluito per controllare la densità di neuroni trasdotte per test esperimenti conseguenze cellule intrinseca di manipolazione genetica. Inoltre, abbiamo dimostrato che due virus potrebbero essere co-iniettati per la produzione di modelli di espressione che sono diretta a gruppi distinti o sovrapposti di neuroni, a seconda dei sierotipi scelti perimballaggio virale. Il nostro lavoro espande la versatilità di questa tecnica per l&#39;uso in una vasta gamma di impostazioni neuroscienze sperimentali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="564">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">ICR outbred mice</td>
			<td style="width:89px;">Harlan</td>
			<td style="width:119px;">Hsd:ICR (CD-1)</td>
			<td style="width:167px;">This strain is also known as CD-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">FVB inbred mice</td>
			<td style="width:89px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">1800</td>
			<td style="width:167px;">5-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Nestlets</td>
			<td style="width:89px;">Lab Supply</td>
			<td style="width:119px;">NESTLETS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Shepherd shacks</td>
			<td style="width:89px;">Lab Supply</td>
			<td style="width:119px;">SS-mouse</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">High fat rodent chow</td>
			<td style="width:89px;">Purina Mills</td>
			<td style="width:119px;">PicoLab Mouse diet 20, #5058</td>
			<td style="width:167px;">This is our standard breeder chow</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:189px;">High fat rodent chow (alternative)</td>
			<td style="width:89px;">Harlan Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S</td>
			<td style="width:167px;">If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Injection syringe</td>
			<td style="width:89px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7653-01</td>
			<td style="width:167px;">10 ml syringe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Injection needles</td>
			<td style="width:89px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7803-04, RN 6PK PT4</td>
			<td style="width:167px;">32 gauge, for standard P0 injections</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:189px;">Metal plate for cryoanesthesia</td>
			<td style="width:89px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">8975K439</td>
			<td style="width:167px;">Raw aluminum plate, 6&#8221; x 12&#8221;, 0.25&#8221; thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Small animal stereotaxic device with digital readout</td>
			<td style="width:89px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 940</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Universal syringe holder with needle support foot</td>
			<td style="width:89px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 1772-F1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Neonatal frame</td>
			<td style="width:89px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51625</td>
			<td style="width:167px;">Officially called a mouse and neonatal rat adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:189px;">Biohazard disposal bags with sterile indicator</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14220-030</td>
			<td style="width:167px;">Important! &#8211; Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute&#8217;s protocol for biohazard waste disposal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction

Con il ritmo del progresso scientifico accelerare rapidamente, sono necessari nuovi metodi per la neuroscienza sperimentale per manipolare rapidamente e facilmente l&#39;espressione genica nel cervello di topo. Qui si descrive una tecnica introdotta da Passini e Wolfe per la consegna intracranica diretta di transgeni viralmente-codificati nel cervello neonatale mouse. Nella sua forma più elementare, la procedura richiede solo un secchio di ghiaccio e una siringa microlitro. Tuttavia, il protocollo può anche essere adattato per l&#39;uso con cornici stereotassica per migliorare la coerenza dei ricercatori nuovi alla tecnica. Il metodo si basa sulla capacità del virus adeno-associato (AAV) di spostarsi liberamente dai ventricoli cerebrali nel parenchima cerebrale, mentre il rivestimento ependimale è ancora immaturo durante la prima 12-24 ore dopo la nascita. Iniezione intraventricolare di AAV a questa età i risultati in diffusa trasduzione di neuroni in tutto il cervello. Espressione inizia entro giorni di iniezione e persiste per la lifetime dell&#39;animale. Titolo virale può essere regolato per controllare la densità di neuroni trasdotte, mentre la co-espressione di una proteina fluorescente fornisce un&#39;etichetta vitale di cellule trasdotte. Con la crescente disponibilità di servizi di base virali per fornire i reagenti sia off-the-shelf, pre-confezionati e preparazione virale personalizzato, questo approccio offre un metodo opportuno per manipolare l&#39;espressione genica nel cervello di topo che è veloce, facile e molto meno costoso di ingegneria germinale tradizionale.

I rendimenti intraventricolare successo iniezione virale diffusa e robusta espressione neuronale. Qui abbiamo valutato trasduzione virale utilizzando YFP o tdTomato geni fluorescenti sotto il controllo del promotore di pollo beta actina (CBA promotore). Questi costrutti sono stati confezionati in AAV8 e iniettate nei ventricoli laterali di neonatali topi (P0) ICR. Titoli virali alti (10 10 particelle per emisfero) hanno determinato l&#39;etichettatura densa del bulbo olfattivo, striato, corteccia cerebrale, i...

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Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

57.8K Views.  Baylor College of Medicine. Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Ricerca

Neuroscienze

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Intracerebroventricular e intravascolare Iniezione di Viral particelle e fluorescenti microperle nel cervello neonatale

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Valutazioni di neurobehavioral in un modello murino di ferita di cervello Hypoxic-ischemica neonatale

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric spinal cord injuries (SCIs) compared to adult SCIs. In addition, reliably introducing therapies into the target cells of the central nervous system (CNS) can be challenging, and inaccuracies can compromise the efficacy of the study or therapy. This protocol combines viral vector technology with a novel surgical technique&#160;to accurately introduce gene therapies into neonatal rats at postnatal day 5. Here, a virus engineered for retrograde transport (retroAAV2) of Cre is introduced at the axon terminals of corticospinal neurons in the spinal cord, where it is subsequently transported to the cell bodies. A double-floxed&#160;inverted orientation (DIO) designer receptor exclusively activated by designer drug(s) (DREADD) virus is then injected into the somatomotor cortex of the brain. This double-infection technique promotes the expression of the DREADDs only in the co-infected corticospinal tract (CST) neurons.&#160;Thus, the simultaneous co-injection of the somatomotor cortex and cervical CST terminals is a valid method for studying the chemogenetic modulation of recovery following cervical SCI models in neonatal rats.

This protocol demonstrates a novel method for applying gene therapies to subpopulations of cells in neonatal rats at postnatal ages 5-10 days by injecting an anterograde chemogenetic modifier into the somatomotor cortex and a retrogradely transportable Cre recombinase into the cervical spinal cord.

Targeting del tratto corticospinale nei ratti neonatali con un vettore doppio virale utilizzando la chirurgia combinata del cervello e della colonna vertebrale

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and large-scale genomic and drug screening. Due to the self-organizing nature of cells in brain organoids and the growing range of available protocols for their generation, issues with heterogeneity and variability between organoids have been identified. In this protocol paper, we describe a robust and replicable protocol that largely overcomes these issues and generates cortical organoids from neuroectodermal progenitors within 1 month, and that can be maintained for more than 1 year. This highly reproducible protocol can be easily carried out in a standard tissue culture room and results in organoids with a rich diversity of cell types typically found in the developing human cortex. Despite their early developmental make-up, neurons and other human brain cell types will start to exhibit the typical signs of senescence in neuronal cells after prolonged in vitro culture, making them a valuable and useful platform for studying aging-related neuronal processes. This protocol also outlines a method for detecting such senescent cells in cortical brain organoids using senescence-associated beta-galactosidase staining.

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

In this study, we provide a detailed technique for a simple yet robust cortical organoid culture system using standard feeder-free hPSC cultures. This is a rapid, efficient, and reproducible protocol for generating organoids that model aspects of brain senescence in vitro.

Generazione robusta e altamente riproducibile di organoidi cerebrali corticali per la modellazione della senescenza neuronale cerebrale in vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...