This work was supported by the European Research Council (ERC Starting Grant n&#956;LIPIDS, No. 203428) and ETH Zurich (project number: ETH-49 12-2). The authors of this manuscript would like to thank Bodo Hattendorf for help with the ICP-MS and F. Kurth for cell counting. The authors also would like to thank Christoph B&#228;rtschi and Roland M&#228;der for their support with building the mechanical setup. The clean room facility FIRST at ETH Zurich is acknowledged for support in microfabrication.

1. SU-8 master Fabrication (Figura 2) NOTA: Eseguire la fabbricazione dei SU-8 maestri stampi in una camera pulita per prevenire i difetti causati da particelle di polvere. Due cialde sono necessari per la fabbricazione, una schiacciata con le caratteristiche microfluidica e uno senza. <ol><li> Preparare gli stampi padrone per il chip microfluidica. Prima applicare uno strato di adesione al wafer di silicio. <ol><li> Disidratare un wafer di silicio per 10 minuti a 200 ° C. Raffreddare il wafer fino a RT e caricarlo su di un giro verniciatura e di spin cappotto con SU-8 2002 con il seguente protocollo. </li><li> Dispensare circa 3 ml resistono sul wafer. </li><li> Spin il wafer a 500 rpm per 10 sec per diffondere il resist su tutta wafer. </li><li> Spin il wafer a 2.000 rpm per 30 sec per raggiungere un&#39;altezza resistere di circa 2 micron. </li></ol></li><li> Rimuovere l&#39;eccesso resistere dal bordo del wafer con un tampone imbevuto di acetone, per evitareattaccare del wafer alla piastra calda nel passaggio successivo. Cuocere il wafer per 60 sec a 95 ° C su una piastra calda. </li><li> Esporre l&#39;intero wafer con luce ultravioletta (80 mJ / cm 2 a 365 nm). Post-cuocere il wafer per 120 secondi a 95 ° C. </li><li> Raffreddare il wafer giù e girare immediatamente cappotto wafer nuovamente utilizzando il seguente protocollo per SU-8 2050: <ol><li> Spin il wafer a 100 rpm per 20 sec (dispensare circa 3 ml SU-8 resistere durante questa fase). </li><li> Spin il wafer a 500 rpm per 10 sec per diffondere il resist su tutta wafer. </li><li> Spin il wafer a 3.250 rpm per 30 sec conseguente spessore resistere di circa 40 micron. </li></ol></li><li> Ancora una volta, rimuovere l&#39;eccesso resistono dal bordo del wafer con un tampone imbevuto di acetone e cuocere morbido wafer su una piastra calda per 180 sec a 65 ° C e 360 ​​sec a 95 ° C. </li><li> Preparare la fotomaschera da sticking ad un vetro soda-calce. Vedi Figura 3 per la progettazione maschera. Utilizzare una maschera allineatore per esporre il resist con luce ultravioletta (160 mJ / cm 2, misurata a 365 nm) attraverso la maschera preparata. Cuocere il wafer esposto nuovamente su una piastra calda per 60 sec a 65 ° C e 360 ​​sec a 95 ° C. </li><li> Dopo il raffreddamento il wafer a RT, immergerlo in una piastra di Petri di vetro riempito di sviluppatore per 5 minuti per sviluppare il resist. Agitare delicatamente la capsula di Petri per rimuovere impressionate SU-8. Sciacquare il wafer con isopropanolo e asciugarlo con una pistola di azoto. </li><li> Controllare il wafer al microscopio. Nel caso in cui non sviluppata resistere resti sulle caratteristiche, sviluppare nuovamente il wafer per pochi minuti, come descritto al punto 1.7. </li><li> Rimuovere qualsiasi solvente residuo da cottura wafer per 2 ore a 200 ° C. Controllare l&#39;altezza delle caratteristiche con un profiler passo. Nel caso l&#39;altezza misurata differisce dal altezza desiderata cominciare questo protoil col nuovo e adattare la velocità di centrifuga al punto 1.1.4. </li><li> Per evitare che si attacchi dei PDMS al wafer silanizzata ponendolo nell&#39;essiccatore insieme con 50 ml di 1 H, 1 H, H 2, H 2 -perfluorodecyltrichlorosilane in una piccola capsula di porcellana. Ridurre la pressione nell&#39;essiccatore a 100 mbar e incubare il wafer per 12 ore. <ol><li> Per le parti vuote PDMS silanizzata altro wafer di silicio con il metodo del punto 1.10. Per risparmiare tempo silanizzata entrambi wafer contemporaneamente in un unico essiccatore. </li></ol></li></ol> 2. LADE Chip Fabrication NOTA: Il chip LADE è fatto di due pezzi PDMS che sono legati insieme da incollaggio 24. La prima parte contiene le caratteristiche microfluidica. L&#39;altra parte è piatta e usato per sigillare i canali. Bonded insieme, formano la forma rotonda necessario interfacciare il chip con il sistema di trasporto gocciolina. Qui, la fabbricazione dile due parti e il loro legame è descritto. Tutte le fasi del processo sono mostrati in Figura 4. <ol><li> Preparare 44 g di PDMS miscelando 40 g di prepolimero con 4 g di PDMS agente di indurimento (questo si tradurrà in un massimo di 6 chip). Degassarla PDMS in un essiccatore fino a quando non è bolla liberamente (questo richiederà circa 20 minuti). </li><li> Replica stampaggio delle metà strutturati. <ol><li> Inserire il modulo colata sopra il wafer e farlo scattare in posizione utilizzando le strutture di guida intorno al disegno (vedi Figura 5). Salta l&#39;aggancio in posizione per il PDMS dimezzare piatta. </li><li> Versare circa 3 a 4 g di PDMS degassificata sotto forma di colata e posizionarlo per 6 minuti su una piastra calda a 150 ° C. Raffreddare i PDMS curati nella forma di fusione e sollevare con cautela il wafer forma di colata con una spatola. </li><li> Per evitare qualsiasi contaminazione dei canali microfluidici coprire il lato del chip che era precedentemente in contatto with il wafer con nastro adesivo. Tagliare con cautela il nastro lungo il bordo della parte PDMS per rimuovere PDMS eccesso. </li></ol></li><li> Per realizzare i piatti PDMS metà ripetere i passaggi di cui sopra da 2.2.1 a 2.2.3 con la cialda silanizzata vuoto. </li><li> Peel del nastro e perforare collegamento fluido nella metà strutturati con un perforatore biopsia. Proteggere le strutture con nastro adesivo durante la conservazione. </li><li> Incollare i pezzi PDMS insieme da incollaggio utilizzando i PDMS agente 24 di polimerizzazione. <ol><li> Prendete un wafer di silicio non trattato e spin cappotto con PDMS agente indurente per 30 sec a 6.000 giri. Prendere la cialda fuori il verniciatore di spin. </li><li> Rimuovere il nastro dalle metà strutturati e metterli con le strutture rivolti verso il basso sul wafer. Spingere delicatamente sopra le PDMS per rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Rimuovere il nastro dalle PDMS vuote metà. Dai dimezzare strutturato dal wafer e allineare manualmente sulla parte superiore del PDMS dimezzare piatta. Premere delicatamente ilsepararsi insieme per eliminare le bolle d&#39;aria e lasciare la cura di chip montato per 24 ore a temperatura ambiente. Non spingere le due parti con la forza come questo può causare i canali al collasso. </li></ol></li><li> Tagliare la punta del chip lungo la linea dell&#39;indicatore ortogonale al canale ugello con un taglierino per aprire l&#39;ugello di uscita. Utilizzare un dispositivo di allineamento per garantire un taglio dritto, che è necessario per una espulsione di liquido diritta. Ispezionare il chip sotto un microscopio per difetti dei canali microfluidica e particelle di polvere. Mettere un nastro sulle prese per proteggere i trucioli durante la conservazione. </li><li> Collegare una bottiglia Woulff con tubo ad una fonte di azoto secco e per tutti gli ingressi del chip LADE. Cassetta 50 ml di 1 H, 1 H, H 2, H 2 -perfluorodecyltrichlorosilane sul fondo della bottiglia Woulff e chiuderla. </li><li> Silanizzare i canali microfluidica svuotando tutti i canali per 20 minuti con il flusso di azoto che trasportano 1 H, 1 H </em&gt;, 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane ad una portata di circa 1 ml / sec. I chip sono pronti per esperimenti e possono essere conservati per almeno alcune settimane a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Preparazione del sistema di misurazione / Droplet Trasporti NOTA: costruire l&#39;intero sistema di trasporto gocciolina sopra un tavolo ottica, dato che è necessario costruire una struttura di supporto stabile per l&#39;installazione. Uno schema dell&#39;intero sistema di trasporto gocciolina è illustrato in Figura 6. <ol><li> Installare un poli ciclonico personalizzato (metilmetacrilato) (PMMA) adattatore con un 50 centimetri allegate tubo in acciaio inossidabile verticalmente. Collegare l&#39;adattatore a una fonte di elio con un controllore di flusso di massa. Collegare un (ad alta velocità), macchina fotografica e una lampada all&#39;adattatore sui siti opposte per la visualizzazione delle gocce. </li><li> Inserire un riscaldatore a cartuccia nel mezzo del tubo di acciaio e utilizzando poli (cloruro di vinile) (PVC) tubo e un tubo Legrisconnettore per collegare l&#39;estremità del tubo di acciaio con l&#39;ingresso del desolvator membrana. </li><li> Collegare l&#39;uscita del desolvator con un altro tubo in PVC a un adattatore di flusso laminare, che è direttamente collegata all&#39;ingresso ICPMS. Collegare l&#39;adattatore flusso laminare ad una sorgente argon con un controllore di flusso di massa e successivamente utilizzarlo per admix Argon per raggiungere una condizione stabile funzionamento. </li><li> Allineare l&#39;adattatore e il tubo verticale in acciaio con una livella. Se l&#39;allineamento non è preciso, si può portare a notevoli perdite di goccioline. Inserire una spina nel adattatore per evitare che i gas fuoriuscita durante il sistema di tempo di riscaldamento. </li><li> Inizia flussi di gas tutto sopra citate e dispositivi che utilizzano le impostazioni da tabella 1. Lasciare che il sistema per riscaldare per 15 min. Il riscaldatore cartuccia deve 2 ore per stabilizzare la temperatura, accenderlo in anticipo. </li><li> Posizionare le pompe siringa su un rack all&#39;altezza di adattatore dell&#39;elio ciclonica. Mantenere la distanza tra lapompe a siringa e l&#39;adattatore più breve possibile. </li></ol> 4. Misure NOTA: Il seguente protocollo è scritta in termini generali a causa della varietà di soluzioni e sospensioni che può essere utilizzato. Tuttavia, sospensioni cellulari devono essere diluite a una concentrazione di &lt;1 x 10 7 cellule / ml, quando viene eseguita l&#39;analisi singola cellula, per assicurare che la maggior parte delle goccioline trasportare una sola cella. Per misure con celle posizionare le pompe a siringa con un angolo in modo che l&#39;uscita delle siringhe punto verso il basso e installare il tubo in modo che puntano verso il basso. <ol><li> Collegare il tubo per le siringhe. Carico due 5 ml siringhe con perfluoroesano e una siringa da 1 ml con una soluzione campione o sospensione. Rimuovere tutte le bolle intrappolate nelle siringhe e tubi. </li><li> Installare le siringhe in una pompa a siringa e collegarli agli ingressi del chip. Avviare le pompe siringa utilizzando le impostazioni iniziali diTabella 1 (o portate maggiori). Dare i flussi da 3 a 5 minuti per stabilizzare. <ol><li> Rimuovere il liquido in eccesso dalla punta del chip con un tessuto. I liquidi dovrebbero ora espellere dal chip in un getto rettilineo. Se una espulsione retta non può essere realizzato strofinando con un tessuto sostituire il chip e ricominciare con questo passo. </li></ol></li><li> Togliere la spina dalla scheda e inserire con attenzione il chip nella scheda. Lubrificare il chip con FC-40, se necessario. Un chip può essere utilizzato per almeno 2 ore di esperimenti. </li><li> Cambiare la portata ad essere entro le impostazioni di misura consigliate dalla Tabella 1. Portata inferiore del PFH non solo salva PFH ma riduce anche il segnale di fondo, causato da interferenze isobariche. </li><li> Dare sistema 2-5 min per stabilizzare (a seconda delle portate scelte). Ottimizzare le ICPMS per l&#39;intensità del segnale più alto degli analiti di interesse. <ol><li> Successivamente regolare i flussi di tutti gli gAses sui regolatori di flusso di massa (vedi i valori consigliati in tabella 1), fino l&#39;intensità massima del segnale degli analiti di interesse si ottiene. Tune il potere plasma e le tensioni lente di focalizzazione (secondo intervalli raccomandate dal produttore) sulle ICPMS nello stesso modo. </li></ol></li><li> Impostare le ICPMS ad un tempo di permanenza di 10 msec (richiesto le ICPMS molto utilizzati, ma può essere regolata con altri strumenti per garantire un&#39;acquisizione risolta nel tempo). Avviare la registrazione del segnale di un particolare m / z usando il protocollo del produttore. </li><li> Dopo la misurazione, trasferire i dati grezzi al programma di analisi dei dati per la valutazione. Bin i dati, riportati nella conta per 10 msec, con un built-in funzione, e la trama risulta valori centrali bin contro conteggi. Montare ogni picco nell&#39;istogramma distribuzione di frequenza tracciata con una funzione di Gauss. La media e sigma del fit rappresentano l&#39;intensità del segnale medio e la sua deviazione standard, rispettivamente. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Calibrazione Concetto <ol><li> Misurare una soluzione unica o standard di multi-elemento che contiene l&#39;elemento o gli elementi di interesse alle stesse portate come il campione. </li><li> Inserire un chip LADE in una capsula di Petri su un microscopio. Per una migliore qualità dell&#39;immagine utilizzare un chip non-round. Realizzare questo chip come descritto al punto 2, ma con una forma semplice fusione rettangolare al posto di quello a forma parzialmente round. </li><li> Seguire i passaggi da 4.1 a 4.2.1 per avviare la generazione goccia. Impostare le portate per le portate utilizzate nella fase 5.1. </li><li> Registrare le immagini di goccioline acquose con una fotocamera ad alta velocità collegato ad un microscopio (obiettivo 20X). Utilizzare un software di analisi di immagine come la morfometria goccia e software velocimetria da Basu 25 per ottenere il diametro medio goccia dalle registrazioni. </li><li> Utilizzare diametro medio delle gocce per calcolare il volume di goccia, assumendo la goccia è un oggetto sferico. <ol><li> Da questo volume e la knpropria concentrazione di un analita nel gocciolina calcolare il numero di atomi corrispondenti. Dividere il numero di ioni misurati per gocciolina per il numero di atomi di ottenere l&#39;efficienza di rivelazione. Utilizzare questa efficienza di rivelazione per calcolare il numero di atomi in un campione sconosciuto. NOTA: Poiché le variazioni tra singoli chip sono piccole 22, non è necessario ripetere la misura della dimensione delle gocce per ogni circuito integrato o soluzione se le portate rimangono le stesse. Un elenco delle dimensioni delle gocce e le frequenze in base alle portate specifiche è pubblicato da Verboket et al. 22. </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+morphometry+and+velocimetry+(DMV):+a+video+processing+software+for+time-resolved,+label-free+tracking+of+droplet+parameters.">Droplet morphometry and velocimetry (DMV): a video processing software for time-resolved, label-free tracking of droplet parameters.</a> Lab Chip. 13 (10), 1892-1901 (2013).</li><li>Dziewatkoski, M. P., Daniels, L. B., Olesik, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+measurements+with+individual,+monodisperse+drop+sample+introduction.">Time-resolved inductively coupled plasma mass spectrometry measurements with individual, monodisperse drop sample introduction.</a> Anal. Chem. 68 (7), 1101-1109 (1996).</li><li>Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+injection+with+microfluidics+using+picoinjectors.">High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (45), 19163-19166 (2010).</li><li>Bremond, N., Thiam, A. R., Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decompressing+emulsion+droplets+favors+coalescence.">Decompressing emulsion droplets favors coalescence.</a> Phys. Rev. Lett. 100 (2), 024501 (2008).</li><li>Niu, X., Gulati, S., Edel, J. B., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillar-induced+droplet+merging+in+microfluidic+circuits.">Pillar-induced droplet merging in microfluidic circuits.</a> Lab Chip. 8 (11), 1837-1841 (2008).</li><li>Song, H., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+kinetics+on+a+microfluidic+chip+using+nanoliters+of+reagents.">Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (47), 14613-14619 (2003).</li><li>Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+in+droplets+in+microflulidic+channels.">Reactions in droplets in microflulidic channels.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).</li><li>Lombardi, D., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+with+magnetic+beads:+a+new+tool+to+investigate+drug-protein+interactions.">Droplet microfluidics with magnetic beads: a new tool to investigate drug-protein interactions.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 347-352 (2011).</li><li>Edgar, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+chemically+separated+components+into+droplets.">Compartmentalization of chemically separated components into droplets.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 48 (15), 2719-2722 (2009).</li><li>Edgar, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+separation+in+the+presence+of+an+immiscible+boundary+for+droplet+analysis.">Capillary electrophoresis separation in the presence of an immiscible boundary for droplet analysis.</a> Anal. Chem. 78 (19), 6948-6954 (2006).</li><li>Baret, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+droplet+sorting+(FADS):+efficient+microfluidic+cell+sorting+based+on+enzymatic+activity.">Fluorescence-activated droplet sorting (FADS): efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity.</a> Lab Chip. 9 (13), 1850-1858 (2009).</li><li>Agresti, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution.">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Sebbene la fabbricazione dei circuiti integrati è molto affidabile ci sono alcuni punti critici durante la fabbricazione che richiedono una particolare attenzione. Innanzitutto, pulizia durante l&#39;assemblaggio è molto importante per evitare la contaminazione del chip dalla polvere. La polvere può bloccare i canali ed evitare una generazione goccia stabile. In secondo luogo, è particolarmente importante che la punta è tagliato ortogonalmente al canale ugello. L&#39;angolo del taglio influenza fortemente l&#39;ang...

Analisi elementare di campioni liquidi da accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma (ICPMS) è comunemente eseguita utilizzando nebulizzatori in combinazione con camere di nebulizzazione come sistema di introduzione 1. In questo sistema di introduzione del campione il campione viene spruzzato da un nebulizzatore per generare un aerosol polidispersa. Una camera di nebulizzazione a valle viene usato per filtrare grandi goccioline. Questo metodo è associato con un elevato consumo campione (&gt; 0,3 ml min -1) 2 e un trasporto del campione incompleta. Così, diventa impraticabile per le applicazioni in cui sono disponibili i volumi del campione soltanto microlitro, come in studi biologici, forensi, tossicologici e clinici 3. Per ridurre il consumo di esempio, con dimensioni di ugelli nebulizzatori piccoli stati sviluppati 3. Tuttavia, la dimensione ridotta ugello aumenta il rischio di intasamento quando campioni di fluidi biologici non digerito o soluzioni saline concentrate devono essere analizzati 3. et al. 4. Gli autori iniettato un liquido in ICPMS sotto forma di microgocce discrete monodisperse, prodotte da una micropompa azionato piezo-elettrico. Anche se questo sistema non ha trovato larga applicazione, ha avviato lo sviluppo del concetto di discreta introduzione goccia in ICPMS. Oggi, azionato elettricamente piezo-sistemi, che possono generare goccioline di dimensione di 30, 50, 70 e 100 micron e con frequenze 100-2,000 Hz erogazione, può essere acquistato. Le goccioline possono essere trasportati in ICPMS con quasi il 100% di efficienza 5. Questi distributori microdroplet sono stati applicati per misurare quantitativamente singole nanoparticelle 5,6 e caratterizzare cellule biologiche singole 7. Un sistema simile basato sulla tecnologia a getto di inchiostro termico 8 è stato testato per l&#39;analisi di campioni biologici 9. Anche se l&#39;Available singoli sistemi di introduzione gocciolina sono molto efficienti, può essere utilizzato per piccoli volumi di campione e sono promettenti per l&#39;analisi delle nanoparticelle e cellule, hanno diverse limitazioni. Per un ugello fisso, la dimensione delle gocce può essere variata leggermente (a meno impostazioni personalizzate vengono utilizzate 10). Variazioni delle proprietà fisiche del liquido (pH, contenuto di sale) possono alterare le caratteristiche delle gocce (dimensioni, velocità di iniezione). Inoltre, questi dispositivi sono piuttosto costosi, inclini a intasamento e sono difficili da pulire. Un altro metodo per generare goccioline è noto nel campo della gocciolina microfluidica 11. Negli ultimi anni goccia microfluidica ha guadagnato interesse (bio) reazioni chimiche 12-15 e per gli studi di cella singola 16,17. Inoltre, questa tecnica è stata applicata per l&#39;introduzione di campioni in ionizzazione electrospray massa spettrometria 18,19 e per la preparazione dei campioni in matrix-assisted laser desorbimento / ionization spettrometria di massa 20,21. Recentemente, abbiamo introdotto un sistema basato microfluidica per l&#39;introduzione del campione in ICPMS 22. La componente chiave del nostro sistema introduzione è il liquido assistita goccia espulsione (LADE) chip. Questo chip consiste completamente di poli (dimetilsilossano) (PDMS). Nel primo incrocio canale di flusso messa a fuoco viene utilizzato per generare goccioline monodisperse di una soluzione campione acquoso (Figura 1). A tale scopo il altamente volatile (punto di ebollizione 58-60 ° C 23) e portante immiscibile fase perfluoroesano (PFH) viene utilizzato (Figura 1). Queste proprietà PFH consentono una generazione goccia stabile e la rimozione veloce della fase portante. Le modifiche delle proprietà del influenza liquido campione questo metodo di generazione meno, rispetto ad altri generatori di gocce. La dimensione delle gocce è regolabile in un ampio intervallo variando le portate della fase acquosa e la PFH. In un secondar downstreamy giunzione, più PFH viene aggiunto per aumentare la velocità di flusso ad almeno 1 m sec -1. A questa velocità del liquido può essere espulso dal chip in jet stabile e diritta (Figura 1) senza distruzione gocciolina (Figura 1 riquadro). Questo design a doppia giunzione permette il controllo della stabilità del getto indipendente generazione goccia. Le goccioline vengono trasportati alle ICPMS con un sistema di trasporto personalizzato. Tale sistema comprende un tubo caduta e un desolvator membrana per rimuovere il PFH. I residui secchi delle goccioline acquose vengono successivamente ionizzati nel plasma del ICPMS e un rilevatore misura la massa degli ioni. La parte frontale della piastrina è quello di garantire un collegamento stretto con il sistema di trasporto goccia a botte. L&#39;espulsione del campione acquoso come goccioline PFH è vantaggioso, perché il contatto con l&#39;ugello è evitata. Questo riduce notevolmente il rischio di intasamento dell&#39;ugello, che può essere un problema quando si lavora con sospensioni cellulari o cosoluzioni saline ncentrated. I chip LADE, fabbricati da PDMS litografia soft, sono a buon mercato (costo del materiale di circa $ 2 per chip), monouso e facile da modificare. In combinazione con la fabbricazione che richiede solo una piccola quantità di lavoro manuale ciascun esperimento può essere eseguita con un nuovo chip. Pertanto, una pulizia laboriosa non è necessario e la contaminazione crociata è minimizzato. Qui, la fabbricazione del chip LADE da litografia morbida e la sua applicazione per ICPMS sono descritti. Esempi di misure con una soluzione acquosa ed una sospensione cellulare vengono presentati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="919">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:320px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Silicon wafer 100 mm</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Si-Mat (Kaufering, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">SU-8 2002</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">SU-8 2050</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Acetone</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Merk VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">100014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:269px;">MR-developer 600</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Isopropanol</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Merk VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:269px;">1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane</td>
			<td align="left" style="width:320px;">ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">AB111155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:269px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit (PDMS)</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Dow Corning (Michigan, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">39100000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Perfluorohexane 99%</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Sigma-Aldrich (Missouri, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">281042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-40</td>
			<td align="left" style="width:320px;">ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">AB103511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td align="left">Life Technologies (Paisley, U.K.)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:269px;">Red blood cells in phosphate-buffered saline</td>
			<td align="left">Rockland Immunochemicals Inc. (Pennsylvania, U.S.A.)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">R400-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:269px;">Single-element standard solutions Na, Fe</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Multielement standard solution&#160;</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.)</td>
			<td align="left" style="width:147px;">IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Nitric acid</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Sub-boiled</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ultrahigh-purity water</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:320px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Hot plate HP 160 III BM</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Sawatec (Sax, Switzerland)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td align="left">used for wafer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Spin modules SM 180 BM</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Sawatec (Sax, Switzerland)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td align="left">used for wafer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">MA-6 mask aligner</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Su&#776;ss MicroTec (Garching, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">High resolution film photomask</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Microlitho (Essex, U.K.)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Step profiler Dektak XT advanced</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Bruker&#160; (Massachusetts, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Hot plate MR 3002</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Heidolph (Schwabach, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td align="left">used for replica molding&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">1.5 mm biopsy puncher</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Miltex (Pennsylvania, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">33-31AA/33-31A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Spin coater&#160; WS-400 BZ-6NPP/LITE</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Laurell (Pennsylvania, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td align="left">used for adhesive bonding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe pump neMESYS</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Cetoni (Korbussen, Germany)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td align="left">Codan (Lensahn, Germany)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">62.1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 mL syringe&#160;</td>
			<td align="left">B. Braun (Melsungen, Germany)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">PTFE tubing&#160;</td>
			<td align="left">PKM SA (Lyss, Switzerland)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">PTFE-AWG-TFT20.N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Quadrupole-based ICPMS ELAN6000</td>
			<td align="left">PerkinElmer (Massachusetts, U.S.A.)&#160;</td>
			<td>n. a.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Membrane desolvator CETAC6000AT+</td>
			<td align="left">CETAC Technologies (Nebraska, U.S.A.)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td align="left">only the desolvator unit is used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">High speed camera Miro M110</td>
			<td align="left">Vision Research (New Jersey, U.S.A.)</td>
			<td style="width:147px;">n. a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Data analysis program Origin pro</td>
			<td align="left" style="width:320px;">OriginLab Corp. (Massachusetts, U.S.A.)</td>
			<td align="left" style="width:147px;">version 8.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:269px;">Microscope</td>
			<td align="left" style="width:320px;">Olympus (Tokyo, Japan)</td>
			<td align="left" style="width:147px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic chip for icpms sample introduction

Questo protocollo discute la fabbricazione e l&#39;utilizzo di un basso costo chip microfluidico monouso come sistema di introduzione del campione per accoppiamento induttivo spettrometria di massa di plasma (ICPMS). Il chip produce monodisperse goccioline campione acquoso a perfluoroesano (PFH). Dimensioni e frequenza delle goccioline acquose possono essere variate nel range tra 40 e 60 micron e da 90 a 7.000 Hz, rispettivamente. Le goccioline vengono espulsi dal chip con un secondo flusso di PFH e rimangono intatti durante l&#39;espulsione. Un sistema di desolvatazione fuoriserie rimuove il PFH e trasporta le goccioline nelle ICPMS. Qui, segnali molto stabili con una stretta distribuzione di intensità possono essere misurate, mostra la monodispersity delle goccioline. Abbiamo dimostrato che il sistema d&#39;introduzione può essere utilizzata per determinare quantitativamente ferro nei bovini singole cellule rosse del sangue. In futuro, le capacità del dispositivo di introduzione può essere facilmente esteso con l&#39;integrazione di ulteriori moduli microfluidica.

Il sistema presentato può essere impiegato per misurare piccoli volumi di soluzioni o sospensioni contenenti cellule o nanoparticelle. Esempi di una misurazione di una soluzione standard e caratterizzazione di singole cellule sono mostrati qui. Altri esempi si possono trovare in Verboket et al. 22. Tipicamente il segnale di una singola goccia di una soluzione è molto breve evento. Di solito dura per pochi 100 msec 26. Con i ICPMS utilizzati qui (tempo di sost...

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A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Vi presentiamo un sistema di introduzione del campione goccia discreto per accoppiamento induttivo spettrometria di massa di plasma (ICPMS). Si basa su un chip microfluidico economico e getta che genera goccioline altamente monodisperse in una gamma di dimensioni di 40-60 micron a frequenze da 90 a 7.000 Hz.

Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.0K Views.  ETH Zurich.  Vi presentiamo un sistema di introduzione del campione goccia discreto per accoppiamento induttivo spettrometria di massa di plasma (ICPMS). Si basa su un chip microfluidico economico e getta che genera goccioline altamente monodisperse in una gamma di dimensioni di 40-60 micron a frequenze da 90 a 7.000 Hz. 

Video: A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Ricerca

Bioingegneria

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

Chip Fabrication Microfluidic e metodo per rilevare l&#39;influenza

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Il Chip Multi-organo - Una piattaforma Microfluidic per lungo termine co-coltura Multi-tessuto

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-cultura del vivere Microbiome con Microengineered umana intestinale Villi in un Gut-on-a-chip microfluidico dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-step altezza variabile fotolitografia per Valvolati multistrato microfluidici Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...