Questo metodo ci permetterà di valutare il ruolo della cavità pericardica che circonda il cuore e il suo contenuto nella riparazione cardiaca dopo infarto miocardico. Rispetto ai metodi convenzionali di legatura coronarica per la modellazione dell'infarto miocardico, il nostro metodo mantiene intatta la cavità pericardica, consentendo la determinazione del contenuto e tiene traccia dei loro ruoli a seguito di lesioni ischemiche cardiache. Comprendere il contributo della cavità pericardica e la risposta alle lesioni cardiache fornirà importanti informazioni sulle strategie terapeutiche che mirano al pericardio per migliorare la guarigione del cuore.
Per iniziare con post anestesia, trattenere le zampe del topo e posizionarlo sul tavolo chirurgico. Dopo aver preparato il topo per l'intervento chirurgico come descritto nel manoscritto, ventilare il topo con il 2% di isoflurano e il 100% di ossigeno come gas di trasporto utilizzando un ventilatore commerciale. Quindi impostare una velocità di 110 respiri al minuto, un volume corrente di 250 microlitri e una pressione espiratoria positiva di quattro millimetri di mercurio.
Ruotare il mouse del 30% sul lato destro per posizionare il lato sinistro del torace per la chirurgia. Quindi fare un'incisione laterale di due o tre centimetri nella pelle del torace per visualizzare i muscoli pettorali sul lato sinistro. Fai un'incisione di un centimetro dalla linea mediana verso l'esterno per tagliare le pettorali maggiori e minori.
Evitare un eccessivo sanguinamento durante la cauterizzazione dei vasi sanguinanti. Visualizza i muscoli intercostali tra la terza e la quarta costola. Fare un'incisione di due centimetri nel muscolo intercostale sinistro per introdurre aria nella cavità toracica e consentire al cuore e ai polmoni di allontanarsi dall'incisione.
Per incidere l'intercostale senza sanguinamento, fermare temporaneamente il ventilatore ed espandere l'apertura utilizzando un dispositivo di cauterizzazione. Usando i divaricatori, ritrarre le costole per esporre il cuore. Quindi osservare il pericardio e il cuore sottostante sotto uno stereomicroscopio.
Posizionare delicatamente la pinza sulla superficie del pericardio per ridurre il pericardio e il movimento cardiaco sottostante. Punto di riferimento visivo dell'arteria coronaria LAD tracciando la sua comparsa sotto l'appendice sinistra. Utilizzando il driver a microago, guidare una sutura appropriata attraverso il pericardio sotto il LAD.
Osservare la sutura che emerge dall'altra parte del LAD e del pericardio. Rappresentando il modello di legatura permanente, legare la sutura per limitare il flusso sanguigno attraverso l'arteria coronaria, rendendo visibile lo sbiancamento della porzione anteriore del ventricolo sinistro. Quindi tagliare la sutura in eccesso con l'aiuto delle forbici.
Fornire iniezioni di mantenimento di analgesico per via sottocutanea ogni 12 ore per 72 ore dopo l'intervento chirurgico. Dopo aver ridotto l'isoflurano all'1%, spegnere l'isoflurano mantenendo la ventilazione con ossigeno. Una volta che l'animale mostra segni di respirazione, rimuovere il tubo tracheale calibro 23 dalla bocca e posizionare il topo in una gabbia di recupero per monitorare la ripresa della respirazione.
Consentire al mouse di recuperare nella gabbia con una parte della gabbia posizionata su un pad riscaldante per fornire una fonte di calore esterna. Monitorare lo stato di salute del topo ogni giorno per sette giorni valutando le incisioni e il disagio dell'animale. Se necessario, somministrare antibiotici per un recupero di successo dopo l'intervento chirurgico invasivo.
Dopo aver mantenuto il topo in anestesia generale con ossigeno, posizionare il topo in posizione supina su una piattaforma riscaldata e attaccare le zampe agli elettrocateteri ECG. Quindi sfregare il petto. Acquisire immagini ECG utilizzando la sonda del trasduttore e il gel di contatto e analizzarle con il software appropriato.
Dopo la valutazione ECG non invasiva, spegnere l'isoflurano e riportare il topo nella gabbia. Fissare il cuore in formalina al 10% per almeno 24 ore. Tagliare il campione usando una lama di rasoio dritta attraverso il ventricolo destro, il setto interventricolare e il ventricolo sinistro, assicurandosi che l'incisione attraversi il centro della zona dell'infarto.
E poi la paraffina incorpora i campioni di tessuto. Le sezioni tagliate vengono quindi posizionate in una cassetta di montaggio per un'ulteriore incorporazione della paraffina e il successivo sezionamento in sezioni spesse cinque micrometri. Dopo il posizionamento di sezioni di tessuto su vetrini, deparaffinizzare utilizzando toluene e lavaggi con alcool graduato con acqua deionizzata.
Quindi reidratare. Quindi, colorare la sezione con 0,1% di rosso sirio nell'acido picrico per due ore a temperatura ambiente. Lavare la sezione con acido acetico allo 0,5% per tre minuti, quindi risciacquare con etanolo al 70% per un minuto.
Disidratare la sezione utilizzando l'ordine inverso dei lavaggi con concentrazioni di etanolo crescenti e graduate prima del montaggio per la valutazione microscopica. L'induzione di infarto miocardico di successo con la legatura coronarica modificata è stata valutata esaminando i parametri funzionali e le caratteristiche strutturali del cuore. Per la funzione, la diminuzione della frazione di eiezione del ventricolo sinistro è stata valutata mediante ecocardiografia entro tre o quattro settimane dall'infarto post-miocardico.
La colorazione istologica ha dimostrato che i cambiamenti funzionali erano accompagnati da una significativa fibrosi della parete del ventricolo sinistro, che sono stati ulteriormente confermati dalla quantificazione della fibrosi colorata di rosso picrosirio nelle sezioni trasversali del cuore a quattro settimane dopo l'infarto con i modelli di legatura coronarica pericardica interrotta o intatta. La combinazione del metodo di etichettatura a sfere fluorescenti con l'analisi della citometria a flusso ha fornito un approccio per tracciare i macrofagi pericardici Gata6 positivi residenti. È importante sottolineare che è stata rilevata poca o nessuna etichettatura nel cuore o nel sangue.
Dopo l'infarto miocardico, il trasferimento delle cellule può essere monitorato mediante citometria a flusso e imaging. Viene mostrata la quantificazione delle cellule mieloidi pericardiche marcate con o senza perline fluorescenti con o senza infarto miocardico. È necessario prestare attenzione per evitare di interrompere o strappare inavvertitamente il pericardio sottile durante la procedura.
Questo metodo può essere combinato con il tracciamento del lignaggio del blocco cellulare o effettore, che consentirà di tracciare e determinare l'impatto della componente pericardica sulla risposta di guarigione nel cuore infartuato. Abbiamo identificato la cavità pericardica che protegge il cuore dopo l'infortunio, che è in parte mediato dai macrofagi pericardici residenti. Questo approccio apre una nuova area di ricerca per le malattie cardiovascolari.
