Gli autori desiderano ringraziare la Fondazione Baker e &#39;Women in Science Fellowship&#39; Fondazione dei bambini di reale sostegno Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty e Edouard G. Stanley sono NHMRC anziani borsisti di ricerca. Il lavoro nei loro laboratori è stata sostenuta da NHMRC e cellule staminali in Australia.

Etica dichiarazione: approvazione etica per la raccolta di malformazione e prepuzio tessuti linfatici sono state ottenute dai Comitati Etici di Ricerca Umane presso l&#39;ospedale pediatrico di Reale, Melbourne, Australia. Firmato accordo è stato ricevuto dai genitori dei pazienti prima di un intervento chirurgico. I campioni di tessuto sono stati prelevati da pazienti con diagnosi di LM sottoposti a procedure chirurgiche come parte della loro gestione clinica e pazienti sottoposti a circoncisione elettivo. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del National Health and Medical Research Council, Australia. 1. Preparazione di sospensione cellulare da prepuzio e linfatico malformazione tessuti <ol><li> Tamponi e preparazione Media. <ol><li> Preparare completo supporto delle cellule endoteliali utilizzando disponibili in commercio EGM-2 MV Kit pallottola riscaldando EGM-2 media e delicatamente lo scongelamento dei componenti del kit a 37 ° C bagnomaria. In classe II biosicurezza cabinet, in modo asetticoaggiungere ogni componente per i EGM-2 media. Una volta che tutti i componenti sono aggiunti ai media, si riferiscono a questo media come &#39;mezzi delle cellule endoteliali completo&#39;. Utilizzare sterile 50 ml pipetta per mescolare il contenuto prima dell&#39;uso. Nota: Tutti i passi relativi a colture cellulari vengono eseguite in un armadio rischio biologico di classe II. Tutte le soluzioni vengono conservati a 4 ° C secondo le istruzioni del costruttore e vengono riscaldati a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. I mezzi completi endoteliali cellulari, tamponi di coltura cellulare e soluzioni enzimatiche sono riscaldati a 37 ° C per 20 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Supplemento completo supporto delle cellule endoteliali con 50 ng / ml VEGF-C. Aliquota i mezzi di comunicazione delle cellule endoteliali completato in 50 ml provette sterili e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Il supporto è stabile per almeno 4 settimane se conservato a 4 ° C. </li><li> Preparare calcio e magnesio libero tamponata con fosfato salino (PBS) sciogliendo 8,752 g di NaCl, 1.416 g Na 2 HPO 4 .2H 2 O e0.395 g KH 2 PO 4 in 1000 ml di acqua. Regolare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare PBS con 0,22 micron filtro e conservare a 4 ° C. Prima dell&#39;uso aggiungere soluzione antibiotica / antimicotico (usato a 1: 100). </li><li> Per preparare fibronectina umana, sciogliere 1 mg di fibronectina in 10 ml di acqua sterile. Conservare soluzione ricostituita in aliquote di 100 microlitri a -20 ° C. Il giorno di utilizzo aggiungere 10 ml di PBS sterile per 100 ml di fibronectina aliquota (per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 10 mg / ml). </li><li> Per i media enzimatici, preparare una soluzione contenente 0,04% dispasi II, 0,25% Collagenase II e 0,01% DNase I in PBS sterile. Innanzitutto, pesare dispasi e collagenasi, posto in una provetta sterile da 50 ml, aggiungere il volume di PBS e incubare per 30 minuti con agitazione a 37 ° C per sciogliere. Una volta sciolto, sterilizzare filtro (0,22 micron filtro) soluzione dispasi / collagenasi in cappa di biosicurezza. Asetticamente aggiungere la DNasi I. Conservare la soluzione enzimatica a 37 ° C fino autilizzare. NOTA: DNase I è un reagente grado di coltura cellulare commerciale disponibile sotto forma di polvere liofilizzata sterile. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di sospensione cellulare da prepuzio e linfatiche Malformazioni <ol><li> Pesare un tubo da 50 ml contenente 10 ml di / 2% soluzione antimicotico antibiotico DMEM. Questo tubo verrà utilizzato per la raccolta dei tessuti. </li><li> Dopo la rimozione chirurgica della malformazione linfatica e tessuti prepuzio, aggiungere asetticamente campione di tessuto al tubo e trasferimento su ghiaccio al laboratorio di coltura cellulare. </li><li> Pesare il tubo contenente il tessuto e calcolare il peso dei tessuti. Utilizzare questo peso per calcolare il volume di soluzione enzimatica necessario per digerire il tessuto. </li><li> In un armadio biosicurezza di classe II, utilizzare pinzetta sterile per trasferire il tessuto e dei media in un piatto di coltura di tessuti a 100 mm. Usare le forbici sterili per tritare finemente il tessuto in ~ 1 mm 3 pezzi. </li><li> Tessuto tritato Transfer mescolato con i media into un tubo da 50 ml contenente ulteriori 10 ml di soluzione sterile DMEM / 2% di soluzione antimicotico antibiotico. Miscelare per inversione di risospendere il tessuto. Centrifugare il campione a 300 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante. Sulla base del peso del tessuto, aggiungere 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) collagenasi II / soluzione di digestione DNasi I / dispasi II per 100 mg di tessuto tritato. Generalmente, utilizzare 10 ml di soluzione enzimatica per circa 1 g di tessuto tritato. </li><li> Incubare il tessuto in un 37 ° C incubatore per 20-90 minuti con costante agitazione a 200 rpm. Alla fine di questo periodo, assicurarsi che quasi tutto il tessuto viene digerito in frammenti sottili. NOTA: esposizione delle cellule alla collagenasi e dispasi al momento di isolamento dal primario tessuti influenze sopravvivenza cellulare. Abbiamo scoperto che la maggior parte dei campioni empiricamente prepuzio neonatale ottimale richiedono 20-30 min di digestione, mentre i campioni fibrotiche malformazioni linfatiche possono richiedere 60-90 min di digestione. LM resa LECs sono influenzati dalla quantità di fibrosi presente, più tessuto fibroso cedevole meno cellule, forse a causa di effetti deleteri di una prolungata esposizione a collagenasi II e dispasi II. </li><li> Dopo la digestione, trasferire il tubo per la biosicurezza e passare la soluzione del tessuto digerito attraverso un colino 70 micron inserito in una provetta sterile da 50 ml. Utilizzando 3 ml della siringa a pistone con pistone di gomma, macinare il tessuto rimanente prima sono osservate solo piccole tracce di matrice extracellulare. </li><li> Lavare il filtro cella con un volume di cellule endoteliali supporto equivalente al volume di dissociare mezzo dell&#39;enzima di recuperare cellule incollati al setaccio e per disattivare gli enzimi. Ad esempio, per 2 ml di dissociare medio enzima per digerire il tessuto tritato, aggiungere 2 ml di mezzo di cellule endoteliali per inattivare gli enzimi. </li><li> Centrifugare la soluzione di cellule a 300 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. R&gt; e-sospendere le cellule in 10 ml di PBS. Cellule centrifugare a 300 xgper 5 minuti, rimuovere il surnatante quindi ripetere lavaggio cella due volte. &gt; Risospendere il pellet cellulare in 20 ml di terreno cellule endoteliali. Contare le cellule utilizzando trypan blue poi seme 2 x 10&gt; 6 cellule in 150 centimetri&gt; 2 beuta pre-rivestite con fibronectina in un volume finale di 20 ml di mezzo di cellule endoteliali. Coltura a 37 ° C in 5% CO&gt; 2 in incubatore umidificato dell&#39;aria.&gt; NOTA: Si prevede che il 75% -90% delle cellule nucleate sopravvivere digestione tessuto come stimato dalla trypan blue. La conta delle cellule iniziale riflette tutte le cellule nucleate della sospensione cellulare (cioè cheratinociti, leucociti, macrofagi, cellule del tessuto connettivo e le cellule dei vasi sanguigni). La conta delle cellule di 5-7 giorni riflette le cellule che hanno attaccato, sopravvissuti e proliferato durante coltura cellulare. Rivestimento tessuto fiasche di coltura con fibronectina migliora anche la successiva LEC e la sopravvivenza LM LEC. </li><li> Dopo incubazione durante la notte, lavare le cellule via non legato a tre lavaggi con PSoluzione BS / 1% antibiotico-antimicotico e aggiungere mezzo delle cellule endoteliali fresco. Effettuare tre lavaggi per rimuovere efficacemente le cellule non legato e globuli rossi presenti nel pallone. Modificare i media ogni due giorni. Le cellule saranno ~ 80% confluenti dopo 5-7 giorni. </li></ol> 3. Anticorpo colorazione delle cellule endoteliali per linfatico marcatori di cellule superficiali per Citometria a Flusso <ol><li> Dopo che le cellule hanno raggiunto l&#39;80% di confluenza, medio aspirare e cellule risciacquo con PBS. </li><li> Staccare cellule aderenti incubando le cellule con 7 ml di soluzione di distacco cellulare come Accutase ogni 150 cm 2 beuta per 5-7 minuti a 37 ° C. </li><li> Celle di raccolta indipendente, inattivano la soluzione distacco cellulare aggiungendo 3 volumi di medie cellule endoteliali e trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta sterile. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di PBS. Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti, togliere la supernatant quindi ripetere lavaggio delle cellule. Risospendere le cellule in 5 ml di PBS. </li><li> Contare il numero di cellule vitali. Miscelare 10 ml di sospensione cellulare con 90 ml di 0,4% trypan blu. Trasferire 10 ml di questa sospensione per emocitometro per il conteggio. NOTA: La quantità di cellule finale dipenderà dalle dimensioni campione trattato. La quantità di cellule usuale per 150 gamme cm 2 boccetta da 7 x 10 5-1,2 x 10 6 di cellule vitali. </li><li> Preparare le soluzioni di anticorpi per la colorazione delle cellule. NOTA: Le seguenti diluizioni sono stati titolati per la colorazione 1 x 10 6 in un volume di 100 microlitri di colorazione. <ol><li> Diluire PE topo coniugato anti- umano VEGFR-3 (01:50); PE-Cy7 topo coniugato contro CD34 umano coniugato (1: 200); APC-coniugato topo CD31 anticorpi umani (1: 100) e Alexa rat 488-coniugato anticorpi umani PODOPLANIN (1: 200) in volume totale di 100 microlitri sterile 5% FBS soluzione / PBS per campione di tessuto. Dopo la preparazione disoluzione di anticorpi, di tenere in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Allo stesso modo preparare miscela di anticorpi controllo isotipico diluito per facilitare l&#39;impostazione di citometria a flusso cancelli. </li></ol></li><li> Per ridurre i legami non specifici degli anticorpi, le cellule centrifugare a 300 xg per 2 minuti, rimuovere il surnatante quindi sospendere le cellule in 100 microlitri sterile 5% FBS / soluzione PBS per campione da colorare. Incubare le cellule in ghiaccio per 20 min a 4 ° C. </li><li> Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante quindi risospendere cellule del cocktail anticorpo coniugato. Macchiare Anche una piccola aliquota di cellule (1 x 10 5) in 100 microlitri miscela di anticorpi controllo isotipico. Incubare le cellule in ghiaccio per 20 min. </li><li> Per rimuovere l&#39;anticorpo non legato, aggiungere 2 ml di 2% FBS soluzione / PBS e centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e ripetere il lavaggio. </li><li> Risospendere il pellet di cellule per il controllo isotipico e il campione anticorpo macchiato da ordinare in 300 ml di 0,5 mg / ml di propidio ioDide / 2% soluzione FBS / PBS. Mettere tubi sul ghiaccio fino ordinamento. </li></ol> 4. cella Ordinamento <ol><li> Utilizzare i seguenti materiali per impostare lo strumento; perle di allineamento come particelle disponibili in commercio fluorescenti, salino basato liquido guaina tampone fosfato e perline di ritardo goccia, come perline fluorescenti Accudrop. </li><li> Isolare i LEC umane purificate su uno strumento di fluorescenza-attivato multiparametrico separazione delle cellule. Impostare lo strumento e allineare secondo le raccomandazioni del fabbricante. Inoltre, eseguire singoli comandi compensazione macchia con ogni sorta per generare la matrice di compensazione ed eliminare così sostanziale spurgo attraverso dell&#39;emissione di fluorocromi quale PE nel canale PE-Cy. NOTA: una percentuale maggiore dei FACS cellule ordinati sopravvivere all&#39;isolamento se viene utilizzato un ugello 100 micron e le cellule sono allineati in mezzo delle cellule endoteliali. </li></ol> 5. Colture Cellulari Posta FACS Ordinaing <ol><li> Dopo smistamento, cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5-10 ml di supporti (a seconda del pallone utilizzato per inseminare la cella). Se meno di 50.000 cellule sono ordinati, le cellule sono coltivate in fibronectina rivestite a 25 cm2 pallone. </li><li> Altrimenti coltura le cellule nel 75 cm 2 beuta fibronectina rivestite a 37 ° C in un CO 2, aria incubatore umidificato 5%. Cambiare media dopo 2 giorni. NOTA: supporti cellulare viene cambiato ogni secondo giorno perché prolungando il tempo tra le modifiche di supporto sembra favorire la sopravvivenza delle cellule non endoteliali. Abbiamo convalidare la linfatica fenotipo delle cellule endoteliali con rilevazione immunoistochimica di marcatori: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 e CD31 quando le cellule sono di prima divisione per un&#39;ulteriore espansione 15. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

LEC svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell&#39;omeostasi fluido, risposta immunitaria agli antigeni estranei e l&#39;assorbimento e il trasporto di alcuni nutrienti. Omeostasi LEC può essere influenzata da processi di malattia, come le infezioni batteriche e metastasi tumorali, ma LEC può anche sviluppare mutazioni somatiche che provocano la formazione di vasi linfatici disfunzionali e una significativa morbidità nei pazienti affetti. Per ottenere una maggiore comprensione di linfatica malformazione eziol...

Una delle principali funzioni del sistema vascolare linfatico è di assorbire la linfa, un fluido interstiziale eccesso contenente lipidi, proteine ​​e componenti cellulari, e condurre al sistema venoso del sangue. Una rete di capillari linfatici dirige linfa ai linfonodi dove viene proiettato per la presenza di antigeni estranei, un processo importante nella sorveglianza e la diffusione delle cellule bianche del sangue per neutralizzare antigeni estranei immunitario. Il sistema linfatico unidirezionale inizia nei tessuti con capillare linfatica iniziale, una struttura unica con un singolo strato discontinuo di cellule endoteliali piatte a parete sottile con giunzioni di cellule specializzate che consentono entrata linfatico 1,2. Questi capillari sono attaccati alla matrice del tessuto connettivo vicina Via ancoraggio filamenti per prevenire il collasso nave in presenza di un aumento della pressione interstiziale 3. I capillari linfatici iniziali vuoti nella raccolta capillari linfaticiche fondersi in vasi linfatici o vene più grandi. Rispetto alla prima vasi capillari linfatici, raccogliendo i vasi linfatici hanno pareti dei vasi più spessi, valvole linfatiche appaiati e sono racchiusi da una membrana basale discontinua in cui alcune cellule muscolari lisce sono incorporati 4. Apertura coordinata e chiusura delle valvole linfatiche e di contrazione delle cellule muscolari lisce facilita flusso della linfa 3. Negli esseri umani, le vene linfatiche provenienti da varie regioni del corpo si uniscono per formare tronchi linfatici che si fondono per formare due dotti linfatici: il dotto toracico e il diritto dotto linfatico. Il dotto toracico drena la linfa dal lato sinistro del corpo e dalla destra sotto il petto mentre la destra linfatica drena condotto linfa braccio destro e sul lato destro della testa, collo e torace. Entrambi i condotti conducono linfa nelle vene succlavia nel collo 5. Disturbi del sistema linfatico sono ampiamente raggruppate in acquisito unand congenite (Tabella 1). Esempi di condizioni acquisite sono linfangite e linfedema secondario. Linfangite è un&#39;infiammazione di un vaso linfatico a causa di un&#39;infezione batterica. I vasi linfatici colpiti si dilatano e si riempiono di essudato contenente cellule polimorfonucleati. In pelle, questi vasi linfatici sono visibili come rosso, striature sottocutaneo doloroso spesso accompagnata da allargamento nodo associato drenante linfatico (linfadenite) 6. Linfedema secondario nasce come conseguenza di un danno o ostruzione al linfatica nave o linfonodo ostruzione. Questo porta a gonfiore cronica progressiva a causa di accumulo di linfa distale al danno o ostruzione. Nei paesi sviluppati, linfedema secondario è più comunemente associato con malignità dove i tumori metastatizzanti ostruiscono i vasi linfatici o linfonodi regionali, o come conseguenza di una terapia anti-cancro dopo la rimozione chirurgica dei linfonodi, la fibrosi post-irradiazione e Throm post-infiammatorieBosis e cicatrici 7. In altre parti del mondo, linfedema secondario può essere secondaria ad ostruzione linfatica causata da vermi parassiti come Wuchereria bancrofti 6. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Disturbi del sistema linfatico vascolare </td></tr><tr><td> Acquisita </td><td colspan="3"> Congenito </td></tr><tr><td rowspan="3"> Linfadenite Linfedema secondario </td><td> Linfedema primario 10 </td><td> Sporadici linfatiche Malformazioni 13 </td><td> Linfatico malformazioni associate con Sindromi 13 </td></tr><tr><td rowspan="2"> ad esempio, Sindrome di Milroy Sindrome di Meige </td><td> Semplice: Malformazioni linfatiche </td><td rowspan="2"> ad esempio, Sindrome di Klippel-Tranaunay Sindrome Weber Parchi Sindrome di Sturge-Weber </td></tr><tr><td> Combinato: Malformazioni capillari-linfatica Malformazione capillare-linfatica-venosa Malformazione capillare-linfatica-arterovenose Capillare-linfatica malformazione venosa-arterovenose </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Panoramica dei disturbi del sistema vascolare linfatico. Disturbi congeniti del sistema linfatico sono primaria (idiopatica) linfedema pensato per essere causata da mutazioni genetiche, linfangectasia e anomalie del 8,9 sistema linfatico. Linfedema primario può essere sporadica presumibilmente causata da mutazioni de novo o ereditato. Disturbi linfatico può anche essere isolate o comprendere parte di una sindrome più generalizzata 10. Nella popolazione pediatrica, il 97% della linfaedema è sporadica con anomalie nella struttura dei vasi linfatici che compromettono linfa regionale drenaggio 11. Malattia Milroy è un esempio di linfedema primario causata dalla mutazione nel VEGFR-3 gene evidente alla nascita o subito dopo il 12. Sebbene stato per lo più familiare, la malattia Milroy può anche essere identificata nei bambini senza storia familiare di malattia Milroy 32. La gravità di qualsiasi linfedema dipende dalla quantità di produzione di linfa e capacità di trasporto linfatico ritorna circolazione venosa 6. Sulla base di presentazione clinica e in situ proliferazione delle cellule endoteliali, anomalie del sistema linfatico sono classificati come tumori linfatici o malformazioni linfatiche 13. Kaposiforme linfangiomatosi è un esempio di un tumore LEC 14. Malformazioni linfatiche sono pensati per sorgere durante lo sviluppo embrionale e crescere in proporzione al bambino 15,16. Raramente regredisce, ma può Remain asintomatica fino traumi o infezioni precipitati rapida crescita che porta a complicazioni cliniche. La struttura ordinata di rete linfatica e la conduzione della linfa dal tessuto di circolazione venosa sopra descritto è perturbato in malformazioni linfatiche che consistono in raccolte localizzate di strutture cistiche anormali pieni di liquido linfatico. Mentre non vi è alcuna evidenza clinica o sperimentale che questi vasi cistiche sono connessi alla circolazione linfatica o che contengono valvole linfatici funzionali, la loro identità linfatico è confermato dalla espressione di serie di marcatori di cellule linfatiche, come PODOPLANIN, CD31, linfatico Vaso endoteliale Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox proteina 1 (PROX-1) e VEGFR-3 15,17,18. Queste strutture cistiche possono essere sia piccole (microcistica) o grande (macrocistiche), ma la maggior parte malformazioni linfatiche contenere sia microcistica e componenti macrocistiche (Figura 1) 16. Dopo l&#39;intervento chirurgico, injection scleroterapia e / o ablazione con radiofrequenza delle malformazioni linfatiche spesso ripresentarsi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Morfologia dei vasi linfatici umani e delle malformazioni linfatiche. Normale linfatico umano (A) e vasi linfatici malformative (B e C) etichettati con anticorpi anti PODOPLANIN (etichetta marrone, freccia). Vasi linfatici malformazione umani sono caratterizzati da una marcata dilatazione e notevoli variazioni in termini di dimensioni del lume. Queste strutture cistiche anomalie localizzate possono essere sia piccole (microcistica, *) (B) o grande (macrocistiche, #) (C). La maggior parte delle malformazioni linfatiche contengono sia componenti microcistiche e macrocistiche. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.</a> &lt;/ P&gt; Alcuni ricercatori hanno suggerito che malformazioni linfatiche rappresentano un disturbo dello sviluppo dei vasi linfatici in cui le LEC non hanno un potenziale di crescita anormale, ma invece non sono riusciti a collegarsi alla normale circolazione 19. Tuttavia, abbiamo trovato che i LEC LM proliferano più velocemente e sono più resistenti all&#39;apoptosi di prepuzio LEC 15 suggerendo che vi è un difetto primario nella LM LEC. Quando LM LEC vengono impiantate in un modello murino di xenotrapianto, formano strutture che ricordano malformazioni linfatiche 15. Questo supporta l&#39;ipotesi che malformazioni linfatiche possono essere causati da una o più mutazioni somatiche derivanti LM LEC durante lo sviluppo fetale. Infatti, recenti studi hanno identificato un tale mutazione nel subunità catalitica p110α di (PIK3CA) gene 20-Kinase Phosphoinositide-3. Dati i progressi nella tecnologia di sequenziamento del DNA, mutazioni rilevanti cOuld essere più facilmente identificati in isolate LM LEC, guidando gli studi futuri di queste condizioni. L&#39;isolamento di LEC vitali faciliterebbe il confronto tra LEC anormali e normali test quali la migrazione, la proliferazione, la capacità di formatura tubi e la sopravvivenza in risposta alla ridotta disponibilità di nutrienti o agenti pro-apoptotici 15. Isolati LEC avrebbero ulteriormente ci permettono di eseguire l&#39;espressione genica specifica delle cellule e studi di proteomica, per delineare nuove sottopopolazioni LEC e scoprire nuovi agenti farmacologici adatti per la gestione clinica delle malformazioni linfatiche. Abbiamo già pubblicato un metodo di isolamento LEC basata sulla separazione magnetica tallone di LEC da prepuzio neonatale e malformazioni linfatiche 15. Abbiamo segnalato una strategia di separare LEC normali e malati da cellule endoteliali vascolari basate sulla mancanza di espressione CD34, seguita sottoponendo frazione di cellule CD34 Neg alla selezione positiva per CD31.Tuttavia, questo metodo è stato ostacolato dalla presenza di cellule non endoteliali residue. Questo era indipendente dalla rimozione dell&#39;epidermide prima successiva digestione tessuto connettivo. Questi contaminanti generalmente proliferavano più rapidamente e quindi alla fine overgrew colture cellulari endoteliali, nonostante i successivi tentativi di ripetere l&#39;isolamento LEC. Infatti, una contaminazione iniziale di cellule non endoteliali a partire da 2% al 5% è sufficiente a sopraffare la popolazione LEC 15. Questo ci ha spinto ad esplorare metodo delle celle di ordinamento fluorescenza attivata come opzione per migliorare la resa delle cellule LEC e purezza. Inoltre, abbiamo utilizzato multiparametrico smistamento per valorizzare le specificità delle popolazioni LEC, l&#39;aggiunta di VEGFR-3 e PODOPLANIN per i marcatori di selezione per identificare CD34 Basso CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LEC. Il razionale per la selezione di questi indicatori si è basata sulle relazioni che, mentre LEC e vascolare endoteliale nel sangue cells hanno molti marcatori di superficie delle cellule in comune, come CD31, LEC mostrare variazione fenotipica nella loro espressione di CD34, PODOPLANIN e VEGFR-3 celle marcatore di superficie rispetto al sangue vascolare cellule endoteliali 21-23. CD31 è una glicoproteina transmembrana di 130 kDa noto anche come piastrine molecola di adesione delle cellule endoteliali 1 (PECAM-1). Si è considerato un marcatore di cellule pan-endoteliale poiché è espresso su tutti i tipi di vasi sanguigni e linfatici 21,24,25. CD34 è di 110-kDa transmembrana glicoproteina presente sulla progenitore più ematopoietiche e le cellule staminali, le cellule endoteliali vascolari e alcuni vasi linfatici 26. VEGFR-3, il recettore per la crescita endoteliale vascolare fattori C e D, è inizialmente presente sulle vene del mouse embrione in via di sviluppo, ma a seguito di specifiche linfatico regolato dalla trascrizione SRY legati HMG-box Fattori (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f attore 2 (COUPTF-II) e PROX-1, VEGFR-3 espressione venosa è perso e si restringe a embrionale LEC 25,27. PODOPLANIN, un kDa membrana 38 mucoprotein, va osservato, innanzitutto sui vasi linfatici a circa embrionali giorno 11 (~ E11.0) di topo sviluppo embrionale 28 e, mentre è fortemente espressa da microvascolari vasi linfatici, espressione PODOPLANIN da macrocistiche endotelio linfatico malformazioni linfatiche è più variabile 15. Citometria a flusso esperimenti suggeriscono che almeno alcune cellule endoteliali CD34 alta CD31 Pos esprimono il marcatore linfatico PODOPLANIN 29. Anche se una valutazione sistematica delle LYVE-1 e PODOPLANIN colorazione in malformazioni linfatiche umani ha dimostrato che entrambi sono efficaci a macchiare linfatica malformazione endotelio 30, nei tessuti normali, LYVE-1 è stato segnalato per essere fortemente presente nella linfatico inizialeendotelio capillare ma ridotti, o addirittura assente nella raccolta di endotelio linfatico 31. Poiché il nostro obiettivo è quello di isolare sia le cellule endoteliali linfatiche iniziali e di raccolta che abbiamo scelto di non usare LYVE-1 come parte della nostra strategia di selezione delle cellule. Infine, la decisione di impiegare questi marcatori era basata sulla disponibilità di anticorpi che vengono utilizzati diagnosticamente per etichettare i vasi linfatici per l&#39;imaging microscopico, una caratteristica che permetta correlazione tra citofluorimetria e studi di immunofluorescenza. Questo articolo descrive il metodo di digestione dei tessuti, la colorazione delle cellule e le impostazioni necessarie per il successo FACS isolamento di CD34 Basso CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LEC così come le cellule endoteliali CD34 alta CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos dal prepuzio e malformazione linfatica tissue.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2179-VC-025</td>
			<td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>StemPro&#174;Accutase&#174; is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue dye</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Used as a viability stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Used at 0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington Lab</td>
			<td>4176</td>
			<td>Used at 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Used at 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm nylon cell strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>356204</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343516</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303116,</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>337006</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400126</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400120</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400525</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

Disturbi del sistema linfatico, come linfedema primario, malformazioni linfatiche e tumori linfatici sono condizioni rare che causano una significativa morbidità, ma poco si sa sulla loro biologia. Isolando cellule altamente puri umane endoteliali linfatiche (LECs) dal tessuto malato e sano faciliterebbe studi dell&#39;endotelio linfatico a livello genetico, molecolare e cellulare. Si prevede che queste indagini possono rivelare bersagli per nuove terapie che possono cambiare la gestione clinica di queste condizioni. Un protocollo che descrive l&#39;isolamento di umana prepuzio LEC e malformazioni linfatiche linfatici cellule endoteliali (LM LECs) è presentato. Per ottenere un unico tessuto sospensione cellulare è stata tritata e enzimaticamente trattati con dispasi II e collagenasi II. La sospensione risultante singola cellula fu poi etichettata con anticorpi anti-cluster di differenziazione (CD) marker CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) e PODOPLANIN. Staicellule vitali ned state ordinate su un cell sorter fluorescente attivate (FACS) per separare la popolazione CD34 Basso CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LM LEC da altre cellule endoteliali e non endoteliali. I LM LEC ordinati erano colti e ampliato su palloni fibronectina rivestite per uso ulteriore sperimentale.

Dopo la digestione del tessuto iniziale, dopo 24 ore di coltura di campioni non frazionate, distinte colonie di cellule endoteliali può essere osservato (Figura 2A) unitamente a cellule fibroblasto-simili e le cellule muscolari lisce. A seguito di selezione e dopo 24 ore di coltura cellulare, le CD34 Bassa CD31 Pos VEGFR-3 celle Pos Podoplanin Pos attaccare e mostra morfologia tipica di ciottoli (Figura 2B e C). Utilizzando i...

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Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule endoteliali linfatiche rivestono i vasi cisti-come malformazione linfatica umani e prepuzi utilizzando cellule fluorescenza attivate (FACS). Coltura delle cellule e successiva espansione di queste cellule permette un nuovo livello di sofisticazione sperimentale per studi genetici, proteomica, funzionali e differenziazione cellulare.

Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

14.2K Views.  The Royal Children&#146;s Hospital.  L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule endoteliali linfatiche rivestono i vasi cisti-come malformazione linfatica umani e prepuzi utilizzando cellule fluorescenza attivate (FACS). Coltura delle cellule e successiva espansione di queste cellule permette un nuovo livello di sofisticazione sperimentale per studi genetici, proteomica, funzionali e differenziazione cellulare. 

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A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

Un tempo reale impedenza elettrica tecnica basata su Misura Invasione di cellule endoteliali monostrato dalle cellule tumorali

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolamento, Cultura e Imaging di Human Fetal pancreatici gruppi di cellule

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali primarie dalle arterie e vene Canine

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

L&#39;isolamento di cellule progenitrici endoteliali da volontari sani e il loro potenziale migratori influenzato dal siero campioni dopo cardiochirurgia

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.