Questo lavoro è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine (RB3-02266) e il NIH (DK54441).

Note prima di iniziare: <ol><li> Pancreas fetali umani sono stati ottenuti dai difetti di nascita Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA), che ha raccolto il tessuto. Il consenso informato per la donazione di tessuto, la conservazione e l&#39;uso dei campioni è stato ottenuto da donatori il centro. La dichiarazione di consenso protocollo è stato fornito in forma scritta e L&#39;Università della California, San Diego umani Protezioni di ricerca Programma approvato l&#39;intero studio (protocollo # 081237XT). </li><li> E &#39;essenziale per mantenere sia il pancreas fetale umano e la tenuta del contenitore pancreas in ghiaccio durante l&#39;intera procedura. La dissociazione e la digestione devono essere eseguite più velocemente possibile. </li><li> Inviare clinica dove il pancreas fetale umano è stato ottenuto dal buffer per lo stoccaggio e il trasporto del pancreas. (RPMI-1640 + 10% di siero umano normale (NHS), 300 mm trealosio SG, penicillina / streptomicina, e Fungizone). </li></ol>1. Dissezione di umani fetali Pancreas <ol><li> Disciogliere 5 mg di collagenasi RT XI in HBSS per ottenere una concentrazione finale di 2,5 mg / ml. Filtrare sterilizzare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron in una sterile (autoclave) scintillazione flacone e conservare a 4 ° C. In una cappa di coltura di tessuti, di cui 2 piastre sterili, un piccolo crogiolo sterile (se un crogiolo non è disponibile, un piccolo bicchiere può essere sostituito), forbici, sterilizzati e pinze. Aggiungere 2 ml di HBSS ad un piatto di Petri per lavare il pancreas. Aspirare il liquido dalla provetta contenente il pancreas fetali, lasciando circa 1 ml. </li><li> Rimuovere il pancreas con una pinza nella capsula di Petri 60 millimetri senza HBSS. Per questi esperimenti, ICCs fetali sono generati dal pancreas fresco con età gestazionale vanno 9-23 settimane. Isolamento dal pancreas in precedenti età gestionational è difficile a causa delle dimensioni del pancreas. Il protocollo è probabile applicabile alle età gestazionali oltre 23 settimane, tuttavia l&#39;acquisizione di pancreata dopo questo tempo è difficile a causa di federali (US) limitazioni. Occasionalmente, il pancreas fetale arriva con splenica, grasso, o tessuto connettivo allegato dalla dissezione originale. Il tessuto supplementare è facilmente visibile ad occhio nudo e dovrebbe essere rimosso dal pancreas prima di iniziare il protocollo. </li><li> Risciacquare le pancreas in un volume minimo di freddo HBSS (~ 0,5 ml) nella piastra di Petri. </li><li> Spostare il pancreas puliti al piccolo crogiolo sterile con pinza sterile e posto in un secchio di ghiaccio. Porre il crogiolo in un supporto per un tubo da centrifuga da 50 ml, con 2 paia di forbici, tagliare il pancreas vigorosamente per alcuni minuti. (Generalmente 2-5 min, ma il tempo dipende dalla dimensione e compattezza del tessuto). Tecnica di taglio è importante. Tenere un lato delle forbici in una posizione fissa muovendo solo le maniglie opposte. Le punte delle forbici devono poggiare sul fondo del crogiolo. Continuare con rapido movimento a forbice per rompere le pancreas in piccolepezzi. Il più piccolo dei pezzi di tessuto, migliore è la collagenasi funzionerà. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di HBSS + pancreas tritate fino al flacone contenente la collagenasi e posto in un set shaker bagno d&#39;acqua a 37 ° C a 200 giri al minuto per un massimo di 10 min. Non controllare più frequentemente di una volta durante i primi 5 min. Tempo di digestione dipende dalla qualità del tessuto, non più di 6 min può essere sufficiente. Il punto finale è quando le particelle sono piccole e uniformi. </li><li> Riempire il flacone (10-15 ml) con HBSS freddo per interrompere l&#39;attività collagenasi. Immettono sul ghiaccio e permettere ai grumi di stabilirsi per 10 min. Spesso a questo punto, si è verificato un certo morte cellulare e il DNA viene rilasciato nel supporto. Questo può rendere i media &#39;filante&#39;; in questo caso, aggiungere 100 microlitri DNasi (10 mg / magazzino ml) alla soluzione. </li><li> Dopo il tessuto nella fiala di scintillazione è depositato per 10 minuti, aspirare lo strato superiore lasciando poco meno della metà (7-8 ml). Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, Aggiungere 5 ml HBSS. Centrifugare per 5 min a 300 x g. </li><li> Aspirare il HBSS e risospendere le cellule in 5 ml supporto contenente RPMI-1640, glutamax, siero umano normale 10% (NHS), 10 mM HEPES pH 7.2, penicillina / streptomicina, e fungizone. Piatto in 60 millimetri piatto di Petri. Per i ricercatori che cercano di generare cellule β, aggiungere HGF (10 ng / ml finale) ai media. Inoltre, un certo numero di gruppi hanno dimostrato che l&#39;integrazione terreni di coltura con l&#39;ormone incretin GLP-1 aumenta anche le cellule β 28. Le cellule devono essere lasciati in sospensione per 72 ore per aggregare e formare ICC. </li><li> Dopo 72 ore in sospensione, le cellule possono essere seminate su matrice della matrice HTB9 linea cellulare umana come descritto in precedenza 29. Indipendentemente dalle condizioni di crescita, i media dovrebbero essere cambiati ogni 48 ore. </li></ol> 2. Immunofluorescenza di marcatori di Endocrine proliferazione e maturazione in ICCs Cresciuto in sospeso, Monolayer, o su vetrini <ol><li> Per misurare la proliferazione cellulare, etichettatura BrdU sia di cellule aderenti o cellule in sospensione viene eseguita per 12 ore prima del fissaggio PFA. Reagente BrdU viene diluito 1:100 e filtro sterilizzato in RPMI-1640, glutamax, il 10% NHS, 10 mM HEPES pH 7,0, penicillina / streptomicina, e Fungizone. </li><li> Per le cellule in sospensione: centrifugare per 5 min a 300 xg ed aspirare terreno di coltura. Aggiungere 10 ml di PBS per lavare le ICC, centrifugare per 5 minuti a 300 xg ed aspirare. Se le ICC stanno per essere inclusi in paraffina, si prega di seguire il protocollo facoltativo 3,1-3,17 per cellule aderenti:. Togliere terreno di coltura e lavare le cellule con PBS come descritto sopra. Fissare le cellule per 20 min con 4% PFA a RT, poi lavare due volte con PBS. A questo punto, le piastre possono essere confezionate con parafilm e conservati in PBS a 4 ° C per 1 settimana. </li><li> Incubare le cellule con 0,2% Triton X-100 in PBS per 10 minuti a RT. Lavare le cellule due volte con PBS e applicare Blocking Buffer (2% faresiero nkey, 2% di siero albumina bovina, glicina 50 mM diluito in PBS) per 1 ora. Lavare le cellule con tampone di lavoro (Blocking Buffer diluito 1:10). Diluire l&#39;anticorpo in tampone di lavoro. Per cellule cresciute su vetrini, diluire l&#39;anticorpo in 60 microlitri di volume totale. Per le cellule in un piatto da 6 pozzetti, diluire l&#39;anticorpo in 600 microlitri di volume totale. Per colorare epitopi multipli, un cocktail di anticorpi può essere applicata. Come controllo, utilizzare IgG o pre siero immune al posto dell&#39;anticorpo specifico. I campioni di controllo devono essere incubate con IgG di controllo dalla stessa specie come utilizzarlo anticorpo primario. </li><li> Incubare l&#39;anticorpo primario sia 1,5 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Aspirare l&#39;anticorpo primario e lavare 3 volte con tampone di lavoro a RT. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario a 1:200 per Rodamina e FITC anticorpi coniugati, 1:500 - 1:1000 per gli anticorpi coniugati Alexa. È importante notare che tutti gli anticorpi secondari sono fotosensibili. Coprire i campionifoglio d&#39;alluminio per prevenire la perdita di segnale. Incubare per 1 ora a RT. OPTIONAL: Per visualizzare i nuclei, DAPI può essere aggiunto in 1:500 durante l&#39;incubazione secondario. Ciò è utile per la quantificazione dell&#39;espressione proteica nella popolazione cellulare totale. </li><li> Aspirare l&#39;anticorpo secondario e lavare 3 volte con tampone di lavoro a RT. Per le cellule coltivate su un vetrino, sollevare delicatamente il vetrino con una pinza immersi nel buffer; lavare immergendo in PBS. Per le cellule coltivate in un 6-pozzetti, aggiungere PBS per lavare e aspirare. A questo punto sono pronti ad esaminare sotto un microscopio invertito. </li><li> Toccare il bordo del vetrino delicatamente su un Kimwipe per sbarazzarsi di un eccesso di PBS. Aggiungere una goccia di gel di montaggio su un vetrino e invertire il coprioggetto sul vetrino. Rimuovere il gel di montaggio in eccesso mediante aspirazione. Toccare il vetrino delicatamente con il dorso di una punta di 200 microlitri pipetta per rimuovere le bolle. </li><li> Asciugare a temperatura ambiente per circa 20 minuti o O / N a 4 ° C ed esaminare al fluorescente o microscopio confocale. </li></ol> 3. (Facoltativo) immunofluorescenza di proteine ​​da paraffina ICC incorporati <ol><li> Preparare una soluzione di agarosio al 3% e lasciare raffreddare a 55-60 ° C. </li><li> Trasferire le ICCs incubate in sospensione in un tubo da 15 ml e centrifugare a 1500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il supporto dalle cellule e fissare con 500 microlitri PFA 4% per 10 min a RT. Non miscelare il pellet, a meno che il pellet è molto grande. </li><li> Lavare il pellet due volte con 750 microlitri di PBS. Come il 4% PFA, questo rifiuto è considerato pericoloso e deve essere smaltito secondo le specifiche di rifiuti pericolosi del vostro istituto. </li><li> Flick delicatamente il pellet di cellule per allentare e aggiungere 150-200 ml di agarosio lungo la parete del tubo da 15 ml. </li><li> Mescolare delicatamente sfogliando il tubo, ma non formano bolle. </li><li> Lasciar solidificare a 4 ° C per 5-10 min. </li><li> Utilizzare un ago 21 G a sloggiareil pellet e il luogo in un tubo da 15 ml fresco. </li><li> Paraffina e la preparazione delle sezioni su vetrini può essere fatto sul posto con un microtomo o dai vostri principali strutture di microscopia. </li><li> Deparaffinare tessuti, idratare e lavare con acqua rapidamente. </li><li> Aggiungere 0,2 M glicina per 30 min a RT per placare l&#39;aldeide rimanente. </li><li> Lavare il vetrino due volte con PBS per 2 min ciascuno. </li><li> Per il recupero di un antigene, portare 10 mM tampone citrato (pH 6.0) a bollire sulla piastra calda. Immergere i vetrini nel buffer, attendere che tornare a ebollizione, e attendere 15 min. </li><li> Togliere il becher dal piastra. Attendere circa 40 minuti per le diapositive per raffreddare nel buffer. </li><li> Lavare i vetrini due volte con H 2 O per 5 minuti ciascuno, lavare i vetrini due volte con PBS per 5 minuti ciascuno, bloccare con il 2% di siero asino normale in PBS per 1 ora. </li><li> Incubare con anticorpo primario, diluito corretta concentrazione nel buffer di lavoro contenente 0,2% Triton X-100.In generale, l&#39;anticorpo primario viene incubata overnight se colorazione per fattori di trascrizione e per 1,5 ore se la colorazione per ormoni, marcatori di proliferazione, e / o differenziazione. </li><li> Seguire i passaggi 2,3-2,9 sopra descritte. </li></ol>

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D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant.">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function.">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

I metodi qui presentati permettono di generare ICCs dal pancreas fetali umane e, successivamente, delle immagini per marcatori di proliferazione cellulare e endoderma pancreas. Il processo di dissociazione pancreas fetale umano richiesto circa 90 min, seguito da un periodo di formazione ICC 72 hr, un approccio che è sostanzialmente diverso da protocolli per isolare le cellule progenitrici cellule β da topo. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo riproducibile che consente al ricercatore di esplorare sviluppo pancreatico umano fetale. Due diversi tipi di studi longitudinali possono essere eseguite. In primo luogo, la possibilità di generare tipi funzionali di cellule del pancreas (cellule duttali, cellule esocrine, e le cellule positive ormonali) di diverse età gestazionali può essere valutata dopo il trapianto. In secondo luogo, ICC da un singolo età gestazionale possono essere coltivate in coltura, trattati con agenti farmacologici selezionati e trapiantati in diversi momenti durante la coltura ICC per esplorare le differenzenel destino delle cellule. Con gli enormi sforzi attualmente diretti a hESC differenziazione in cellule produttrici di insulina, i problemi connessi con la secrezione di insulina in risposta a stimoli fisiologici sono di nuovo in fase di rivivere. ICCs umane forniscono un sistema modello unico per studiare questo aspetto critico della proliferazione delle cellule del pancreas fetale e lo sviluppo delle cellule β. Come con qualsiasi protocollo per isolare le cellule dai tessuti, i dettagli sono fondamentali per il successo. Un certo numero di parametri sono purtroppo di fuori del controllo del personale di laboratorio incaricato dell&#39;esperimento. Due problemi incontrati da questo laboratorio comprendono scarsa qualità del materiale di partenza e la consegna di tessuto non-pancreatico. Tessuto pancreatico fetale sana è fermo per un taglio a forbice. Se i tagli di tessuto troppo facilmente, è un segno che gli enzimi pancreatici hanno cominciato a digerire il pancreas stesso. Da questo c&#39;è purtroppo alcun recupero e la preparazione è meglio annullata. Raramente, in untecnico esperto rimozione del pancreas confondere sezioni dell&#39;intestino per il pancreas. Questi campioni avranno molto più elasticità di un pancreas e un lume notevole saranno presenti. Ancora una volta, questi campioni devono essere eliminati. Quando il protocollo di cui sopra sono seguite come descritto, raramente ci sono eventuali problemi che sorgono a gettare l&#39;isolamento fuori pista. Alcuni punti da ricordare per garantire un isolamento liscio includono, per usare le forbici affilate per un preciso taglio pancreas e fare in modo di non lasciare alcun campione di tessuto troppo grande da digerire. Se i tagli non sono abbastanza piccolo, allora la collagenasi non funziona in modo efficace, e pochi ICCs sono formate. Al contrario, quando si utilizza un nuovo lotto di collagenasi, iniziare con un livello simile, se usati come precedentemente UI (unità internazionali) per la digestione. Tuttavia, diminuire il tempo di incubazione per assicurare che oltre digestione non si verifica. Questa tecnica di risoluzione dei problemi assicura che l&#39;etichetta UI non varia significativamente da lotto a batch. Preso in prospettiva, questa tecnica per l&#39;isolamento di ICCs fetali umani è relativamente standard nel settore. La maggior parte dei laboratori hanno confermato i nostri risultati che l&#39;aggiunta di HGF ai media aiuta le cellule sopravvivono e proliferano 33. In sintesi, abbiamo sviluppato un metodo per isolare ICCs fetali umane pancreas fresco con età gestazionale vanno 9-23 settimane. Le cellule possono essere coltivate in monostrato o in sospensione per esperimenti di visualizzare pancreas endocrino fattori di trascrizione e insulina umana.

Una limitazione principale per insulina terapie sostitutive a base di cellule nel diabete di tipo 1 è la scarsità di isole umane disponibili per il trapianto. La capacità di regolare la proliferazione e la differenziazione delle cellule precursori pancreatiche umane in cellule producenti insulina che soddisfano le esigenze metaboliche di uno stato di insulino-deficiente rimane un elemento fondamentale per una terapia cellulare per il trattamento di diabete di tipo 1. Fino all&#39;avvento delle cellule che producono insulina cellule staminali embrionali umane derivate, cellule endocrine del pancreas fetali umani o dei loro precursori sono stati visti come potenziali fonti di cellule per il trapianto clinico. Anche se il panorama scientifico e normativo è cambiato negli ultimi anni, rimane un bisogno vitale per capire come il pancreas fetale umano si sviluppa. Molti ora vedono l&#39;uso terapeutico delle cellule fetali umane improbabile, se sono stati stabiliti metodi efficaci e sicuri per espandere le cellule, uso terapeutico di queste cellule potrebbe agAIN essere esplorato. Un ostacolo principale che rimane è che nella trasformazione in vitro di cellule pancreatiche fetali aggregati umani (CICS) in glucosio reattivo, insulino-secernenti cellule endocrine è attualmente un processo inefficiente. Sebbene molto lavoro su quasi 30 anni ha chiarito e delineato il profilo di espressione di fattori di trascrizione necessari per lo sviluppo del pancreas endocrino, permangono lacune nella nostra conoscenza su come espressione temporale dei fattori di trascrizione è regolata e correlata alla funzione delle cellule. Fino all&#39;avvento delle cellule che producono insulina cellule staminali embrionali umane derivate, cellule endocrine del pancreas fetali umani o dei loro precursori sono stati visti come potenziali fonti di cellule per il trapianto clinico. Anche se il panorama scientifico e normativo è cambiato negli ultimi anni, rimane un bisogno vitale per capire come il pancreas fetale umano si sviluppa. Molti ora vedono l&#39;uso terapeutico delle cellule fetali umane improbabile, se efficacee metodi sicuri per espandere state stabilite le cellule, uso terapeutico di queste cellule potrebbe ancora essere esplorato. Un ostacolo principale che rimane è che nella trasformazione in vitro di cellule pancreatiche fetali aggregati umani (CICS) in glucosio reattivo, insulino-secernenti cellule endocrine è attualmente un processo inefficiente. Sebbene molto lavoro su quasi 30 anni ha chiarito e delineato il profilo di espressione di fattori di trascrizione necessari per lo sviluppo del pancreas endocrino, permangono lacune nella nostra conoscenza su come espressione temporale dei fattori di trascrizione è regolata e correlata alla funzione delle cellule. Recentemente, il campo delle cellule staminali ha impiegato la conoscenza accumulata sulle temporale espressione del fattore di trascrizione durante lo sviluppo isolotto di guidare la produzione di cellule che esprimono i marcatori di cellule endocrine mature. Anche se la genesi di cellule produttrici di insulina da cellule staminali embrionali umane e cellule pluripotenti indotte (iPSC) ha fatto sostanziale esignificativi progressi negli ultimi anni, i protocolli più efficaci necessitano di due fasi di differenziazione distinte: 1) una differenziazione precoce in vitro per generare cellule pancreatiche che esprimono fattori di trascrizione precursori, seguiti da 2) maturazione in vivo dopo il trapianto - la cosiddetta &quot;scatola nera &quot;periodo. Per andare avanti, i progressi nella comprensione della biologia sottostante maturazione isolotto in vivo, indipendentemente dalla fonte di cellule, deve essere intesa a livello biochimico. La somiglianza tra i risultati ottenuti con ICCs e hESC suggerisce che un certo numero di processi biochimici critici che regolano il passaggio di cellule precursori pancreatiche umane in glucosio, reattivo, che secernono insulina cellule mature in vitro rimane sconosciuta. Una parte centrale di questa comprensione sarà quello di sviluppare nuove metodologie per derivare le popolazioni di cellule endocrine funzionali da cellule progenitrici pancreatiche e cellule staminali embrionali umane richiederà non solo ca biochimicaoaches che chiarire i fatti di maturazione, ma i metodi per analizzare i cambiamenti. Perché crediamo che l&#39;imaging cellule pancreatiche fetali umane è un aspetto critico di individuare cambiamenti nel isolotto di maturazione? La risposta sta in parte nella ricerca storica per generare cellule produttrici di insulina. Entrambi i sistemi tessuto-coltura modello e precursori pancreatici e isolotti hanno permesso ai ricercatori di esplorare le significative differenze che esistono tra la maturazione di isolotti animali e isolotti umani in vitro. Una limitazione all&#39;esplorazione dello sviluppo pancreas fetale umano è che l&#39;età gestazionale utilizzabili legalmente unicamente dar luogo ad aggregati cellulari eterogenee. Anche se le isolate cellule umane fetali assomigliano isolotti, colorazione dopo coltura in vitro di età gestazionale 9-23 settimane rivela meno del 15% contiene marcatori per le cellule endocrine, con la maggior parte delle cellule non colorazione per gli ormoni insulari. Tuttavia, dopo il trapianto e nelin vivo maturazione, la grande maggioranza delle cellule esprimono marcatori endocrine 6,25. I risultati di questi studi sono stati ripresi oggi con i protocolli di differenziazione hESC che sono solo in grado di generare popolazioni modesti di cellule endocrine positive unico ormone dopo la differenziazione in vitro in metodi per migliorare popolazioni di cellule ormonali positivi. Vitro probabilmente fornire una conoscenza in vivo isolotto maturazione. Inoltre, comprendere gli eventi molecolari che guidano lo sviluppo del pancreas fetale umano probabilmente migliorare gli sforzi per ricavare cellule produttrici di insulina da cellule staminali embrionali umane e in seguito delineare i meccanismi che regolano la rigenerazione delle cellule β e transdifferenziamento delle cellule pancreatiche. Le somiglianze tra cellule pancreatiche fetali umane e hESC maturazione possono essere estesi per la funzione delle cellule. Come le cellule murine, sia le cellule fetali umani e hESC differenziato sono in grado di rilasciare insulina in risposta al glucosiodopo isolotto neoformazione in vitro 26,27. Tuttavia, dopo il trapianto in topi nudi e maturazione, entrambi i cluster isolotto-come umani e di cellule produttrici di insulina derivate da cellule staminali embrionali umane mostrano un fenotipo endocrino. Tre mesi dopo il trapianto, quasi il 90% delle cellule trapiantate da entrambi popolazione è insulina positivo, e funziona normalmente come determinato dal rilascio di peptide C 17,26. Questi risultati indicano che il trapianto fornisce il contesto e non identificati spunti che promuovono isolotto maturazione. Protocolli di imaging ottimizzati, come quella descritta qui, per le cellule pancreatiche fetali umani aiuteranno nella ricerca per identificare fattori che modulano e accelerano la maturazione. Fondamentale esplorazione biochimica delle cellule pancreatiche fetali umani e hESC dissociati verso un lineage endocrino in questa fase di sviluppo è essenziale per misurare l&#39;efficienza di maturazione. Il seguente protocollo, delineato nel Figure 1, fornisce il nostro metodo attuale per l&#39;isolamento di cellule pancreatiche fetali umani, chiamato ICCs da tutta pancreas fetale umana e l&#39;imaging di queste cellule. Questo protocollo richiede una preparazione iniziale di cellule da tessuto, che può essere successivamente coltivata come monostrato o in sospensione. Preparazione delle cellule per l&#39;imaging di marcatori comunemente usati di proliferazione cellulare endocrino e maturazione è descritto. Generazione e l&#39;imaging di ICCs in assenza o presenza di una varietà di agenti chimici modificando offre un metodo rapido, rispetto ai modelli di trapianto, per aiutare identificare condizioni di coltura e composti che accelerano la maturazione delle cellule pancreatiche fetali umani in esocrina completamente funzionale, duttale, o ormone della produzione di cellule pancreatiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:219px;">Hayashibara</td>
			<td style="width:115px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with glutamate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879020</td>
			<td>no glucose or HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human AB Sera, Male Donors</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fungizone</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin Solution 50 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Hepes, pH 7.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin - Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepatocyte Growth Factor (HGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>130-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td>
			<td>D210-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BrdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-47910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (goat polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ki67</td>
			<td>Lab Vision Neomarkers</td>
			<td>RM 9016-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pan-CK (mouse monoclonal; 1:100)</td>
			<td>Immunotech</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK19</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA 2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HTB9 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>5637</td>
			<td>see Beattie 1997 reference to generate matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters

Per quasi 30 anni, gli scienziati hanno dimostrato che ICCs fetali umane trapiantate sotto la capsula renale di topi nudi maturato in funzionamento delle cellule endocrine, come evidenziato da un aumento significativo circolanti C-peptide umano in seguito alla stimolazione di glucosio 1-9. Tuttavia, in vitro, genesi di cellule produttrici di insulina da ICCs fetali umane è basso 10; risultati che ricordano recenti esperimenti effettuati con le cellule staminali embrionali umane (hESC), una fonte rinnovabile di cellule che contengono una grande promessa come trattamento terapeutico potenziale per il diabete di tipo 1. Come ICC, il trapianto di cellule staminali embrionali umane in parte differenziati generi di glucosio reattivo, cellule produttrici di insulina, ma in genesi vitro di cellule che producono insulina da cellule staminali embrionali umane è molto meno robusta 11-17. Una completa comprensione dei fattori che influenzano la crescita e la differenziazione delle cellule precursori endocrine probabilmente richiederà i dati generati da entrambi ICC e HESC. Mentre un certo numero di protocolli esistenti per generare cellule produttrici di insulina da cellule staminali embrionali umane in vitro 11-22, molto meno esistono per ICCs 10,23,24. Parte di tale discrepanza deriva probabilmente dalla difficoltà di lavorare con pancreas fetali umani. Verso questo fine, abbiamo continuato a sviluppare metodi esistenti per isolare le isole dal pancreas fetali umani con età gestazionale vanno 12-23 settimane crescere le cellule come un monostrato o in sospensione, e l&#39;immagine per la proliferazione cellulare, marcatori pancreatici e ormoni umani compresi glucagone e C-peptide. ICCs generato dal protocollo descritto sotto il risultato nel rilascio del peptide C dopo trapianto sotto la capsula renale di topi nudi che sono simili ai livelli di peptide C ottenuti per trapianto di tessuto fresco 6. Sebbene gli esempi presentati qui si concentrano sulla proliferazione endoderma pancreatica e β genesi delle cellule, il protocollo può essere utilizzato per studiare altri aspetti dello sviluppo pancreatico, Compresi esocrino, duttale, e altre cellule che producono ormoni.

L&#39;attenta preparazione di ICCs fetali è fondamentale per il successo di questo protocollo. Quadri rappresentativi di come le cellule tipicamente guardano periodi definiti dopo la placcatura sono mostrati nella Figura 2. Dopo la purificazione, gli aggregati di cellule appena placcati appaiono come piccoli cluster chiare sparse che contengono poche cellule (Figura 2A). Dopo le prime 24 ore (Figura 2B), molti dei gruppi di cellule diventano più grandi, ma restano numerosi piccoli gruppi. Entro 48 ore, i cluster hanno ampliato in modo significativo, ma rimangono asimmetrica (Figura 2C). A 72 ore, le ICC dovrebbero essere chiare, relativamente uniforme in termini di dimensioni e forma (Figura 2D). È a questo punto che le cellule possono essere sia piastrate su matrici, come HTB-9, per 24 ore prima di immunofluorescenza o lasciati crescere per altre 72 ore in assenza o presenza di sostanze chimiche o farmaci che possono alterare l&#39;espressione di geni necessario per pancreatica delle cellule endocrine generation. Figura 3 mette in evidenza un certo numero di anticorpi comunemente utilizzati per valutare ICC proliferazione o il differenziamento verso endoderma pancreas. Nella Figura 3A, ICCs sono state piastrate su HTB-9, coltivate per 4 giorni, e colorate per PDX1, un marcatore critica dello sviluppo del pancreas. Anche se la colorazione in vitro di ICC viene eseguita di routine nel nostro laboratorio, più spesso, ICCs fetali umani vengono trapiantate sotto la capsula renale di topi nudi e ha permesso di proliferare e differenziarsi in vivo 6,9,30-32. A volte specificato dopo il trapianto, i topi vengono sacrificati e il rene contenente le ICCs trapiantati viene rimosso, fissate in paraformaldeide al 4%, e inclusi in paraffina. Sequenziali sezioni 5 micron vengono generati sul posto utilizzando un microtomo o da un impianto di base di microscopia. Smascheramento di epitopi e colorazione delle proteine ​​da paraffina tessuto per la microscopia a immunofluorescenza sono descritti nel protocollo facoltativo 3,10-3.17. Nella Figura 3B, ICCs trapiantati sono stati colorati con il marker delle cellule epiteliali pan citocheratina (PanCK, verde) e con Ki67 (rosso) per valutare la proliferazione cellulare. In un altro esempio, sia l&#39;insulina umana (verde) e glucagone (rosso) sono stati rilevati dopo il trapianto e maturazione sotto la capsula renale di un topo nudo (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Diagramma di flusso preparazione ICC fetale umano e la colorazione di immunofluorescenza. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Rappresentativa fetale preparazione ICCs a 0, 24, 48, o 72 ore dopo la placcatura. (A) ICCsin sospensione sono state ripreso subito dopo la placcatura, (B) 24 ore dopo placcatura, (C) 48 ore dopo la placcatura o (D) 72 ore dopo la placcatura. Barra della scala per AC, ingrandimento 10X = 300 micron, bar scala D, 20 ingrandimenti = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg" /> .. Figura 3 immunofluorescenza di ICCs placcati routine, ICC sono ripreso per (A) il PDX1 marcatore endoderma pancreatico (verde), (B), le cellule endocrine (pan-CK, verde) e la proliferazione (Ki67, rosso), (C) di insulina (verde) e glucagone (rosso). Barra della scala per AC, 40X di ingrandimento = 20 micron.

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Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Un protocollo per isolare, i cluster cultura e l&#39;immagine delle cellule insulari (CICS) derivate da cellule pancreatiche fetali umane è descritto. Il metodo in dettaglio i passi necessari per generare ICCs dal tessuto, la cultura come monostrati o in sospensione come aggregati, e immagine per i marcatori di proliferazione e decisioni destino delle cellule pancreatiche.

Isolamento, Cultura e Imaging di Human Fetal pancreatici gruppi di cellule

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

isolation-culture-and-imaging-of-human-fetal-pancreatic-cell-clusters

Research

JoVE Journal

Medicine

14.0K Views.  University of California, San Diego.  Un protocollo per isolare, i cluster cultura e l'immagine delle cellule insulari (CICS) derivate da cellule pancreatiche fetali umane è descritto. Il metodo in dettaglio i passi necessari per generare ICCs dal tessuto, la cultura come monostrati o in sospensione come aggregati, e immagine per i marcatori di proliferazione e decisioni destino delle cellule pancreatiche. 

Video: Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Ricerca

Medicina

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Non invasiva di misurazione ottica del metabolismo cerebrale ed emodinamica nei neonati

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Un Mouse fetale Modello Skin of Wound Repair scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...