Siamo grati al signor Roger Ackroyd, Andrew Wyman e Mr Chris Stoddard, consulente chirurghi a Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, per il loro aiuto ad acquisire campioni di tessuto esofageo e il loro sostegno del nostro lavoro. Ringraziamo Ashraful Haque per il suo aiuto incorporare linee di cellule tumorali nel modello. Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario per questo studio da sovvenzioni dal Bardhan Research and Education Trust (BRET) e Yorkshire Cancer Research (YCR).

Cellule esofagee umane sono ottenute da pazienti sottoposti a chirurgia gastrica o esofagea. Il consenso informato è ottenuto per il tessuto da utilizzare a scopo di ricerca, e il tessuto utilizzato in modo anonimo sotto le opportune approvazioni etiche (SSREC 165/03, Tessuto umano di ricerca Bank Licenza 12179). 1. Isolamento di cellule umane esofageo epiteliali <ol><li> Lavorando in una cappa coltura tissutale flusso laminare e con tecnica sterile, preparare il terreno di coltura epiteliale mescolando medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) e F12 di Ham in un rapporto 3: 1 (v: v). Aggiungere 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml fattore di crescita epidermico, 0,4 mg / ml idrocortisone, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml transferrina, 2 x 10 -7 M triiodotironina, 1 x 10 -10 M tossina colerica, 2 x 10 -3 M glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml anfotericina B. </li><li> Utilizzo di serietecniche sterili, mettono 11 ml di DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml di amfotericina B in un pallone di coltura tissutale T75. Aggiungere 1 x 10 6 lethally irradiati topo fibroblasti 3T3 12 in 1 ml dello stesso terreno e incubare una notte a 37 ° C in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. Ciò produrrà uno strato alimentatore per la successiva coltura di cellule epiteliali. </li><li> Usando un bisturi e seguendo le raccomandazioni di un anatomopatologo, sezionare un 2 campione di circa 2 cm di tessuto dallo sfondo regione libera da malattia esofagea mucosa squamosa ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia gastrica o esofagea. Trasporto al laboratorio in un contenitore 50 ml di terreno di trasporto sterile (PBS 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e 0.625 mg / ml anfotericina B) a temperatura ambiente. </li><li> A questo punto, memorizzare il tessuto nel trasportomezzo per fino a 12 ore (una notte) a 4 ° C, per convenienza; tuttavia non utilizzare periodi di inattività quali risultano nella vitalità cellulare ridotta. </li><li> Lavorando in una cappa coltura tissutale flusso laminare e con tecnica sterile, sterilizzare un bisturi per immersione in etanolo al 70% per 5 min. Sciacquare in PBS sterile. </li><li> Collocare il tessuto in una piastra di Petri sterile e utilizzare il bisturi per tagliare in 0,5 centimetri strisce. Aggiungere 5 ml di 0,1% (w / v) in PBS tripsina al piatto Petri, posizionare il coperchio sul piatto e incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 5 ml di FCS al tessuto in piastra di Petri di inibire la tripsina. Tenendo la striscia di tessuto con pinze sterili, raschiare delicatamente la superficie epiteliale con la lama di bisturi per 1-2 min per strip per rimuovere le cellule epiteliali nel mezzo circostante. Rimuovere il tessuto raschiato e mettere da parte. Ripetere il processo per tutte le strisce di tessuto. </li><li> Raccogliere il terreno contenente le cellule epiteliali staccate in una provetta da centrifuga da 15 mle centrifugare (5 min, 200 xg). Versare il surnatante e risospendere il pellet in 12 ml di terreno epiteliale (descritto al punto 1.1). </li><li> Eliminare e scartare il supporto dallo strato di cellule di alimentazione nel pallone T75 preparato al punto 1.2. Utilizzare una pipetta sterile per aggiungere la sospensione cellulare contenente cellule epiteliali appena isolate nel pallone e incubare a 37 ° C in 5% CO 2, atmosfera umidificata. </li><li> Dopo 24 ore versare fuori e scartare il terreno di coltura, che conterrà anche detriti cellulari, e sostituirlo con 12 ml di mezzo fresco epiteliale. Continuare incubando a 37 ° C in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. Colonie inizierà ad apparire nei prossimi 24-48 ore e possono essere visualizzati posizionando il pallone di coltura al microscopio ottico standard. Versare il terreno di coltura esaurito e sostituirlo con un volume uguale di mezzo fresco ogni 2 o 3 giorni. </li><li> Una volta che il pallone ha raggiunto l&#39;80% di confluenza, il passaggio delle cellule 13. Dividere il cells in un rapporto di 1: 5 per aumentare il numero di cellule per uso nel modello. Seguire passo 1.2 per stabilire strati di alimentazione del combustibile irraggiato 3T3 in ogni contenitore che riceverà le cellule epiteliali 24 ore prima di passaging cellule. Nota: utilizzare le cellule epiteliali del modello esofageo descritto di seguito tra i passaggi 1 e solo il 4. </li></ol> 2. Isolamento di fibroblasti umani esofagee <ol><li> Lavorare in una cappa a flusso laminare e con tecnica sterile, prendere il tessuto accantonato nella fase 1.7. Mettere in una piastra di Petri sterile e tritare finemente da taglio con una lama di bisturi sterile. Aggiungere 10 ml di 0,5% (w / v) collagenasi Una soluzione e posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e incubare a 37 ° C durante la notte in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. </li><li> Trasferire il digest in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare (10 min, 200 xg), con attenzione versare fuori e scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno di coltura di fibroblasti (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml anfotericina B). </li><li> Posizionare la sospensione in un pallone T75 e incubare a 37 ° C in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. Dopo 24 ore versate fuori dal mezzo, che conterrà detriti e sostituirlo con 12 ml di terreno fresco fibroblasti. Sostituire il terreno di coltura ogni 2 o 3 giorni e le cellule di passaggio una volta raggiunto l&#39;80% di confluenza 13, dividendo le cellule in un rapporto 1: 5 per aumentare il numero di cellule. Nota: utilizzare le cellule di fibroblasti nel modello descritto di seguito tra i passaggi 4 e solo il 10. </li></ol> 3. Preparazione del De-cellularized esofageo Scaffold <ol><li> Ottenere intatto suina esofagi a un mattatoio di suini Landrace appena macellati che vengono utilizzati per la produzione alimentare. Una sola esofago fornirà ponteggi sufficienti per circa 30 costrutti separati. Nota: A causa della vasta e ora consuming protocollo di sterilizzazione richiesto, è normalmente vale ottenimento e l&#39;elaborazione di un minimo di 10 esofagi contemporaneamente. </li><li> Porre immediatamente l&#39;esofago appena asportato in una pentola sterile 180 ml contenente circa 150 ml di soluzione di iodio-povidone 10% per 5 minuti per ridurre qualsiasi carica microbica contaminante. Trasferire l&#39;esofago di una seconda pentola contenente circa 100 ml di PBS sterile contenente 200 UI / ml di penicillina, 200 mg / ml di streptomicina, e 1,25 mg / ml di amfotericina B. <ol><li> Rimettere il coperchio sul recipiente e trasportare il esofagi torna al laboratorio a temperatura ambiente. Due o tre esofagi possono essere trasportati in ciascun contenitore, a seconda delle loro dimensioni. </li></ol></li><li> Una volta in laboratorio, gestire il tessuto in una cappa a flusso laminare con tecnica asettica per minimizzare la contaminazione microbica. Sterilizzare pinzette, forbici e lame bisturi immergendo per 5 minuti nel 70% di etanolo, e risciacquo in PBS sterile. </li><li> Maneggiare le esophagus utilizzando una pinzetta sterile. Utilizzando le forbici, tagliare aperto l&#39;esofago longitudinalmente. Sciacquare il tessuto posizionando l&#39;esofago in una pentola sterile 180 ml contenente circa 100 ml di PBS sterile e scuotendo delicatamente per rimuovere eventuali detriti. </li><li> Pulire una bacheca di sughero dissezione spruzzando liberamente con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. </li><li> Rimuovere l&#39;esofago dalla PBS, e l&#39;utilizzo di aghi sterili, pin out l&#39;esofago sul bordo, mucosa più in alto di superficie. Afferrare la superficie mucosa ad una estremità dell&#39;esofago con una pinzetta sterile e tirare fuori dal bordo. Questo separerà mucosa dalla sottomucosa sottostante. <ol><li> Quindi, utilizzare un bisturi sterile per sezionare l&#39;esofago longitudinalmente lungo la lamina propria, rimuovendo gli spilli dissezione progredisce per consentire la mucosa per essere sollevato lontano. </li></ol></li><li> Conservare la mucosa sezionato e gettare la sottomucosa sottostante. </li><li> Tagliare ed eliminare i più prossimale e distale 2 cm di tegli mucosa in quanto vi è un maggior numero di ghiandole della sottomucosa e una spessa lamina propria in quelle aree, rispettivamente, 7. </li><li> Utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto rimanente in 5 centimetri 2. Mettere tutto il tessuto tagliato in una pentola sterile 180 ml contenente circa 150 ml di PBS sterile e agitare delicatamente per lavare il tessuto. Se il trattamento più di cinque esofagi contemporaneamente, può essere necessario utilizzare più vasi per questo e le tre fasi successive. </li><li> Con una pinzetta sterile, trasferire il tessuto tagliato in una pentola 180 ml contenente 150 ml di sterile 1 M NaCl, 200 UI / ml di penicillina, 200 mg / ml streptomicina e 1,25 mg / ml di amfotericina B. Incubare per 72 ore a 37 ° C. </li><li> Collocare il tessuto in una nuova pentola 180 ml contenente 150 ml di PBS sterile. L&#39;epitelio avrà iniziato a separare visibilmente dal tessuto sottostante. Buccia delicatamente l&#39;epitelio staccarsi dal esofago maiale con pinza sterile e scartare. <ol><li> Posizionare il restante tproblema in una nuova pentola 180 ml e aggiungere 150 ml di PBS sterile. Agitare delicatamente per 5 minuti per lavare. Eliminare il PBS e ripetere altre due volte con PBS fresco. </li></ol></li><li> Posizionare tutto il tessuto in una bottiglia di vetro da 500 ml contenente 400 ml di soluzione sterile 80% (v / v) di glicerolo soluzione per 24 ore a temperatura ambiente. Trasferimento a 400 ml di soluzione sterile 90% (v / v) di glicerolo per altre 24 ore. </li><li> Conservare in 400 ml di soluzione di glicerolo sterile al 100% a temperatura ambiente per un minimo di 4 mesi a disidratarsi e sterilizzare il tessuto preservando l&#39;integrità della membrana basale. </li></ol> 4. Produzione della cultura mediatica <ol><li> Preparare siero di vitello neonato chelato per l&#39;uso nel terreno di coltura. <ol><li> Versare 100 g di Chelex 100 in una bottiglia di vetro 1 L e aggiungere acqua deionizzata. Il volume esatto non è critica ma acqua sufficiente deve essere aggiunto a coprire la polvere Chelex. Aggiungere un agitatore magnetico e sterilizzare in autoclave (121 ° C per15 min). </li><li> Lasciare che la bottiglia si raffreddi e la Chelex di stabilirsi. In una cappa a flusso laminare versare l&#39;acqua in eccesso, aggiungere 500 ml di siero di vitello neonato (NCS) e lasciare suscitare una notte a 4 ° C. </li><li> Smettere di mescolare, lasciare il Chelex di stabilirsi, questo può richiedere fino a 30 minuti. In una cappa a flusso laminare decantare il siero chelato con una pipetta sterile, facendo attenzione a non disturbare il Chelex, e conservare in 10 ml aliquote a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparare tre diversi media in una cappa a flusso laminare, che inizia con pro-proliferativa e termina con formulazioni pro-differenziativi. <ol><li> Preparare Composite Media I composto da DMEM e Hams F12 in un rapporto 3: 1 (v: v), 4 x 10 -3 M L-glutammina, 0.5 mg / ml idrocortisone, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triiodotironina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M progesterone, 10 mg / ml ininsulina, 10 ug / ml transferrina, 10 ng / ml di selenio, 1 x 10 -3 M etanolammina e 0,1% (v / v) chelato NCS. </li><li> Preparare Composite Media II come Composite Media I eccetto sostituire siero chelato con 0,1% (v / v) non chelato NCS. </li><li> Preparare composito medio III come Composite Media II tranne progesterone omettere e siero aumento al 2% (v / v) non chelato NCS. </li></ol></li></ol> 5. La produzione della mucosa esofagea modello umano <ol><li> Eseguire il lavoro in una cappa a flusso laminare, con tecnica asettica per mantenere un ambiente sterile. Sterilizzare tutti gli strumenti da immersione in etanolo al 70% per 5 minuti, prima di risciacquare in PBS sterile. </li><li> Il giorno prima che sia necessario, reidratare il acellulare suina patibolo esofageo. Un pezzo di scaffold è richiesto per ogni costrutto per essere preparati. <ol><li> Per reidratare i tessuti posto sufficienti pezzi di ponteggio suina in una pentola contenente 100 ml di PBS sterile, agitarsi e ammollo per 10 minuti. Decant PBS e sostituirlo con PBS fresco. Ripetere il processo di lavaggio cinque volte per garantire la rimozione di ogni traccia di glicerolo. </li></ol></li><li> Testare la sterilità scaffold incubando il tessuto reidratato notte in 100 ml di DMEM a 37 ° C. Se non vi è alcun cambiamento del colore o torbidità del terreno di coltura alla fine del periodo di incubazione del ponteggio viene considerato sterile. Una volta che la sterilità è stata confermata, posizionare il 5 centimetri 2 acellulare ponteggio in un piatto ben 6, lato sottomucosa alto. </li><li> Inserire un anello sterile grado medico acciaio inossidabile (diametro interno 10 mm, diametro esterno 20 mm) sul centro di ciascun scaffold e premere delicatamente con pinza sterile, per garantire una tenuta adeguata con il tessuto. </li><li> Raccogliere i fibroblasti utilizzando Tripsina-EDTA 13 per produrre una sospensione cellulare. Contare le cellule utilizzando un emocitometro 14. Centrifugare la sospensione cellulare (10 minuti, 200 xg). Risospendere il pellet di cellule in un appropriate volume di terreno fibroblasti per produrre un conteggio cellulare finale di 2,5 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di terreno fibroblasti, contenente 5 x 10 5 fibroblasti esofagee umani, all&#39;interno di ogni anello. Inondare la zona intorno all&#39;esterno dell&#39;anello con circa 2 ml di terreno di fibroblasti. Incubare a 37 ° C in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. </li><li> Dopo 24 ore rimuovere il anelli e fibroblasti medio e aggiungere almeno 5 ml di terreno di fibroblasti fresco in ogni pozzetto, assicurando che il ponteggio è totalmente immerso nella media. Culture per 1 settimana a 37 ° C in 5% CO 2, atmosfera umidificata sostituendo la soluzione ogni 2 o 3 giorni. </li><li> Dopo 1 settimana rimuovere le piastre e 6 contengono i ponteggi ad una cappa diluvio laminare, rimuovere il supporto e capovolgere ogni impalcatura con pinza sterile, ponendo la superficie della mucosa superiore. Questo punto di tempo è indicato come giorno 0. </li><li> Posizionare gli anelli in acciaio sulla superficie della mucosa nel centro diil tessuto come al punto 5.4. </li><li> Preparare i flaconi T75 delle cellule epiteliali per tripsinizzazione 13. Dopo il lavaggio PBS e prima dell&#39;aggiunta della soluzione di tripsina-EDTA, aggiungere 2 ml di soluzione sterile 0,02% (w / v) di EDTA a ciascun contenitore. Incubare per 2 min a 37 ° C. Toccare delicatamente il pallone staccare selettivamente lo strato alimentatore i3T3 lasciando le cellule epiteliali allegati. Nota: Generalmente non è pratico o necessario al paziente abbinare le cellule epiteliali dei fibroblasti già incorporati nel modello della settimana precedente. </li><li> Eliminare la soluzione EDTA contenente il livello di alimentazione e aggiungere la soluzione tripsina-EDTA per raccogliere le cellule epiteliali 13. Contare le cellule utilizzando un emocitometro 14. Centrifugare la sospensione cellulare (10 minuti, 200 xg). Risospendere il pellet di cellule in un volume appropriato di composito Piano 1 per produrre un conteggio cellulare finale di 5 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di composito Media I, contenente 1 x 10 6 cellule epiteliali, all&#39;interno del ring. Inondare la zona intorno all&#39;esterno dell&#39;anello con circa 2 ml di Composite medio I e posizionare i costrutti in incubatore a 37 ° C in 5% CO 2, atmosfera umidificata. </li><li> Dopo 24 ore (giorno 1) rimuovere gli anelli e medie e aggiungere almeno 5 ml di fresco Composite Medio I, garantendo i ponteggi sono completamente sommerse e tornare alla incubatrice. Dopo un ulteriore 24 ore (Day 2) rimuovere il supporto e sostituiti con almeno 5 ml di Composite Media II, ancora una volta garantendo i ponteggi sono completamente sommerse e tornare al incubatrice. </li><li> Il giorno 4 place grado medico sterile griglie maglia di acciaio inossidabile (2 cm di larghezza x 2 centimetri alti lunghezza x 0,5 cm), entro piastre 6 e fresco, uno per ogni costrutto. Utilizzare pinzette sterili per trasferire i costrutti sulla parte superiore delle griglie in acciaio, mucosa alto superficie. <ol><li> Aggiungere sufficiente Composite Piano III in modo che il liquido raggiunge la parte inferiore del composito, ma la superficie èesposto all&#39;aria, questo assicura che il campione viene mantenuto ad una interfaccia aria-liquido. Il volume esatto di medio richiesto varierà a seconda dello spessore del ponteggio, il volume del pozzo e l&#39;altezza esatta del reticolo in acciaio inossidabile. </li></ol></li><li> Mantenere i compositi in un&#39;interfaccia aria-liquido da 10 a 20 giorni (giorno 14 al giorno 24), a seconda delle esigenze dell&#39;esperimento. Sostituire il composito medio III con terreno fresco ogni 2 o 3 giorni (Lunedi, Mercoledì, Venerdì è un regime user-friendly). Nota: Dopo 5 giorni a un&#39;interfaccia aria-liquido (giorno 9) i costrutti hanno un epitelio esofageo sufficientemente maturo per essere utilizzato in esperimenti di impatto dei fattori ambientali sull&#39;epitelio esofageo. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, fissare i costrutti per analisi istologica e immunoistochimica 7, o estratto proteico 15 o RNA 11,16 dall&#39;epitelio per ulteriori analysè. Se necessario, trattenere il terreno di coltura condizionato per analisi di molecole di segnalazione 17 extracellulari. </li></ol>

<ol>
	<li>Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">Epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).</li><li>Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+effect+of+bile,+and+bile+and+hydrochloric+acid+mixture+on+the+esophageal+mucosa.">Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa.</a> Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).</li><li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Underwood, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+primary+oesophageal+squamous+epithelial+cells+with+HET-1A+in+organotypic+culture.">A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture.</a> Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Okawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+EGFR+overexpression,+hTERT+activation,+and+p53+mutation+in+esophageal+epithelial+cells+with+activation+of+stromal+fibroblasts+induces+tumor+development,+invasion,+and+differentiation.">The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).</li><li>Green, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+an+organotypic+tissue-engineered+human+esophageal+mucosal+model.">The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+induces+immortalization+of+human+esophageal+keratinocytes+without+p16INK4a+inactivation.">Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation.</a> Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).</li><li>Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+buccal+mucosa+for+substitution+urethroplasty.">Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty.</a> BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).</li><li>Ralston, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+contract+human+dermal+extracellular+matrix+and+reduce+soluble+fibronectin+production+by+fibroblasts+in+a+skin+composite+model.">Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model.</a> Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).</li><li>Green, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+exposure+to+simulated+reflux+leads+to+changes+in+gene+expression+in+a+3D+model+of+oesophageal+mucosa.">Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa.</a> Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).</li><li>Wang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+epithelial+cells+from+primary+breast+carcinomas+using+irradiated+3T3+cells+as+feeder+layer.">Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer.</a> Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells.">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+a+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abnormal+expression+of+retinoic+acid+receptor-beta,+p+53+and+Ki67+protein+in+normal,+premalignant+and+malignant+esophageal+tissues.">The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues.</a> World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).</li><li>Moll, R., Divo, M., Langbein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+keratins:+biology+and+pathology.">The human keratins: biology and pathology.</a> Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).</li><li>Rice, R. H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope:+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions.">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li><li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes.">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo manoscritto descrive la produzione e caratterizzazione di un modello mucosa esofagea umana biologicamente rilevante adatto per l&#39;uso come una piattaforma sperimentale per studiare l&#39;impatto dell&#39;esposizione a fattori di stress ambientali sulla dell&#39;epitelio esofageo. I passi più critici per la produzione di successo di un modello mucosa esofagea umano sono: garantire che la maggior parte delle cellule epiteliali rimangono proliferativa e non hanno già cominciato a di...

La mucosa esofagea comprende una stratificato, epitelio squamoso sopra uno strato di tessuto connettivo, la lamina propria, ed è uno dei primi siti per incontrare stress ambientali ingeriti. L&#39;esposizione a tossine alimentari è implicato nello sviluppo del carcinoma squamoso dell&#39;esofago, mentre reflusso duodenogastro-esofageo è un fattore critico nella patogenesi della Barrett Metaplasia, che è associata ad un aumentato rischio di progressione di adenocarcinoma esofageo. Carcinomi esofagei sono l&#39;8 ° più comune tumore maligno nei maschi del Regno Unito e di adenocarcinoma esofageo è in rapido aumento nel mondo occidentale 1. Inoltre, c&#39;è stata poca miglioramento nella prognosi della malattia, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni complessiva di circa il 15%. Di conseguenza, vi è la necessità per le piattaforme sperimentali per studiare l&#39;impatto dell&#39;esposizione a fattori di stress ambientali su questo epitelio esofageo e il loro potenziale coinvolgimento nella svipment di metaplasia o neoplasia. Sebbene linee cellulari immortalizzate o tumorali permettono ai ricercatori di studiare la risposta delle cellule epiteliali a questi fattori di stress in vitro, rimangono proliferativa e non riescono a differenziarsi in cellule epiteliali mature trovate su gli strati superficiali della mucosa esofagea. Inoltre, linee cellulari che hanno già subito tumorigenesi possono fornire solo informazioni limitate per quanto riguarda le reazioni iniziali di cellule normali all&#39;interno dell&#39;epitelio a fattori ambientali; e questa è la fase in cui il potenziale di intervento terapeutico potrebbe essere più alta. Infine, i sistemi di coltura cellulare convenzionali non riescono a catturare le interazioni potenzialmente importanti tra cellule epiteliali e mesenchimali e tra queste cellule e la matrice circostante che si verificano all&#39;interno dei tessuti in vivo. Modelli animali forniscono un microambiente più realistico per studiare le risposte del epitheli esofageoum e può incorporare l&#39;induzione artificiale della malattia da reflusso gastro-esofageo 2. Tuttavia può essere più impegnativo per manipolare i fattori di stress ambientali in questi modelli, e non può rappresentare appieno la risposta entro dell&#39;esofago umano. Altri modelli sperimentali esofagee umani sono stati sviluppati che utilizzano cellule primarie, cellule immortalizzate o linee cellulari tumorali su un collagene, o combinati collagene / Matrigel, impalcatura contenenti fibroblasti 3,4. È meno laborioso per generare questi scaffold rispetto al ponteggio esofageo acellulare descritto in questo manoscritto, e questi modelli organotipiche fornire uno strumento utile, in particolare nello studio di invasione del 5,6, dove l&#39;infiltrazione delle cellule tumorali nel gel di collagene può essere prontamente osservato. Tuttavia questi gel di collagene hanno non nativi proprietà meccaniche e mancano di alcune caratteristiche del tessuto originale, tra cui una membrana basale specifico e l&#39;appropriate topografia della superficie. Ciò può influenzare il comportamento delle cellule con conseguente, ad esempio, più povera adesione tra l&#39;epitelio e scaffold utilizzando un gel di collagene scaffold 7. Di conseguenza è stato sviluppato il acellulare porcine scaffold esofageo, con il vantaggio di essere un ponteggio biologicamente più realistica e quindi più appropriato per l&#39;uso come una piattaforma sperimentale. E &#39;stato anche dimostrato che è preferibile incorporare cellule primarie nei costrutti esofagee di linee cellulari immortalizzate esofagee epiteliali, come Het-1A, poiché queste cellule formano un epitelio multistrato ma non riescono a stratificare o differenziare 4,7,8 . Di conseguenza, questo protocollo è stato adattato da un metodo già in uso in laboratorio MacNeil per fare ingegneria tessutale della pelle e della mucosa orale 9,10 e incorpora un porcine scaffold esofageo de-cellularized combinata con cellule primarie umane esofagee epiteliali e fibroblasti. Thiprotocollo s produce un maturo, epitelio stratificato, simile a quello della normale esofago umano come dimostrato da CK4, CK14, Ki67 e involucrin colorazione. Il modello risultante fornisce una piattaforma sperimentale per studiare le risposte ai fattori di stress ambientale, ed è stato utilizzato in modo efficace per studiare i cambiamenti nell&#39;espressione genica nell&#39;epitelio esofageo in risposta a refluito componenti 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">215240</td>
			<td>Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-D1112</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-H1236</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>FB-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Prepare 200 &#181;g/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydorcortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0396</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2767</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2036</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2752</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Prepare stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>Brand name Fungizone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td>Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">10103578001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>10830E</td>
			<td>Brand name Videne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">433209</td>
			<td>Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26010074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0503</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin, transferrin, selenium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-838Z</td>
			<td>Used for composite media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.02% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">11819650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml universal tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>SLS7504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 ml pot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td align="right">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel mesh grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ki67</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>KI67-MM1-L-CE</td>
			<td>Clone MM1 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9004</td>
			<td>Clone 6B10 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>LL002-L-CE</td>
			<td>Clone LL002 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Involucrin</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>INV</td>
			<td>Clone&#160; SY5 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE21</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96062201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE33</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96070808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Het-1A</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>previously growth arrested by irradiation (60 Gy)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, characterization and potential uses of a 3d tissue-engineered human esophageal mucosal model

L&#39;incidenza di adenocarcinoma esofageo e il suo precursore, metaplasia di Barrett, sono in rapido aumento nel mondo occidentale. Inoltre adenocarcinoma esofageo ha in genere una prognosi infausta, con scarso miglioramento dei tassi di sopravvivenza negli ultimi anni. Queste sono condizioni difficili da studiare e vi è stata una mancanza di piattaforme sperimentali adatti per indagare i disturbi della mucosa esofagea. Un modello della mucosa esofagea umano è stato sviluppato in laboratorio MacNeil che, a differenza dei sistemi di coltura cellulare 2D convenzionali, ricapitola le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice presenti in vivo e produce un maturo, epitelio stratificato simile a quello della normale umana esofago. In breve, il modello si usano cellule non trasformate normali primari fibroblasti umani esofagee e epiteliali coltivate all&#39;interno di un ponteggio acellulare esofageo suina di derivazione. Caratterizzazione immunoistochimica di questo modelloda CK4, CK14, Ki67 e involucrina colorazione dimostra adeguata ripresa del istologico della mucosa esofagea umano. Questo modello fornisce un robusto, modello sperimentale biologicamente rilevanti della mucosa esofagea umana. Può essere facilmente manipolato per indagare su una serie di domande di ricerca, tra cui l&#39;efficacia di agenti farmacologici e l&#39;impatto dell&#39;esposizione a fattori ambientali, come l&#39;alcool, le tossine, ad alta temperatura o componenti refluito gastro-esofageo. Il modello facilita anche periodi prolungati di coltura non ottenibili con coltura cellulare convenzionale 2D, consentendo, tra l&#39;altro, lo studio dell&#39;impatto di esposizione ripetuta di un epitelio maturo per l&#39;agente di interessi per un massimo di 20 giorni. Inoltre, una varietà di linee cellulari, come quelli derivati ​​da tumori esofagei o metaplasia di Barrett, può essere incorporata nel modello per studiare processi come invasione tumorale e responsivene drogass in un ambiente più biologicamente rilevante.

Questo manoscritto descrive il processo necessario, indicata schematicamente in figura 1, alla cultura modelli 3D dell&#39;epitelio esofageo umana con successo. Per confermare l&#39;idoneità del modello come una piattaforma sperimentale istologico e gli studi di immunoistochimica sono stati intrapresi confrontando i tessuti coltivati ​​con mucosa esofagea squamose umano. Valutazione istologica dell&#39;epitelio prodotto con il metodo descritto mostra un maturo, multistr...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model at JoVE.com

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all&#39;interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Views.  University of Sheffield.  Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all'interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano. 

Video: Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocollo per la relativa valutazione idrodinamica del Tri-volantino Polymer Valvole

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Ricerca

Bioingegneria

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema Tumore test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Una cultura Modello 3D Ormone-sensibile della Human ghiandola mammaria Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Un Tessuto 3D combinata Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Polmone tumore per predire l&#39;efficacia della droga in specifici Sfondi mutazionali

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Semina e impianto di un innesto trachea tessutale biosintetico in un modello murino

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

Innesto ingegnerizzato per la ricostruzione esofagea circonferenza nei ratti

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...