Il carcinoma esofageo a cellule squamose, ESCC, è mortale e prevalente in tutto il mondo. Gli organoidi tridimensionali possono essere utilizzati per accelerare i progressi nel campo per combattere il grave onere dell'ESCC. Gli organoidi 3D derivati da singole cellule di topi trattati con 4NQO possono essere facilmente ed economicamente manipolati per l'annotazione funzionale dei cambiamenti molecolari che accompagnano l'inizio e lo sviluppo dell'ESCC.
Questo modello cattura l'eterogeneità genetica dei tumori indotti da mutageni. Pertanto, questi organoidi forniscono una piattaforma fisiologicamente rilevante per testare nuove strategie terapeutiche o identificare i cambiamenti genetici salienti che guidano la tumorigenesi. Ad aiutare a dimostrare la dissezione animale e la raccolta di organi sarà Yasuto Tomita, un collaboratore dello staff, e a dimostrare la preparazione dell'organoide per la procedura di incorporazione della paraffina sarà Norihiro Matsuura, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio.
Per iniziare, apri la pelle dei topi eutanizzati pizzicando la pelliccia addominale centrale e usando le forbici chirurgiche, fai un'incisione craniocaudale della linea mediana ventrale dall'addome inferiore al mento. A partire dall'incisione della linea mediana, effettuare tagli radiali che si estendono agli arti su entrambi i lati del topo, gonfiare i lembi della pelle aperti. Per esporre la trachea cervicale, usando le forbici da dissezione, dividere le ghiandole salivari sulla linea mediana.
Per esporre la trachea toracica, rimuovere lo sterno. Pizzicare delicatamente e sollevare il peritoneo con una pinza e usare le forbici per dividere il peritoneo craniocaudalmente. e lateralmente lungo la gabbia toracica.
Ritrarre delicatamente il fegato dalla superficie caudale del diaframma e usare le forbici per fare una piccola incisione nel diaframma alla tacca sternale, in particolare sulla superficie dorsale del processo xifoideo. Una volta che la gabbia toracica è separata dal contenuto toracico, inserire le forbici nell'incisione nel diaframma e sezionare cranialmente alla cintura cervicale aderendo strettamente alla superficie dorsale dello sterno per evitare danni agli organi sottostanti. Tagliare le costole su entrambi i lati dello sterno usando le forbici e rimuovere lo sterno.
Per esporre l'esofago addominale, sollevare delicatamente lo stomaco anteriormente tenendo l'antro con una pinza. Usando le forbici, sezionare la milza, il pancreas e il mesentere dallo stomaco e dall'esofago. Per esporre l'esofago toracico, sollevare delicatamente la trachea immediatamente caudale alla cartilagine tiroidea e sezionare l'esofago del lato dorsale della trachea usando le forbici dell'iride.
Dividere la trachea sulla cartilagine tiroidea con le forbici dell'iride. Staccare la trachea dal resto dell'esofago sezionandolo attentamente nella direzione caudale. Rimuovere il polmone, il cuore e il timo del tutto con la trachea.
Dividere lo stomaco al piloro con le forbici. Separare l'esofago dalla vertebra tenendo l'antro con una pinza e sezionando cranialmente. Dividere l'esofago a livello della cartilagine tiroidea e raccogliere l'esofago e lo stomaco del tutto.
Separare lo stomaco e l'esofago dividendo l'esofago al cardias e sezionare qualsiasi fascia sulla superficie esterna dell'esofago. Per riservare un campione per l'istologia, dividere longitudinalmente con le forbici. Posizionare l'esofago intatto rimanente e il PBS freddo sul ghiaccio.
Aprire lo stomaco lungo la maggiore curvatura e lavare sufficientemente con PBS. Separare il prestomaco e lavare con PBS freddo. Per raccogliere la lingua, rimuovere l'ago appuntato dal naso ed estrarre la lingua con una pinzetta.
Tagliare la lingua il più a lungo possibile e metterla in PBS freddo sul ghiaccio. Dopo aver trasferito il tessuto dissociato in un piatto di coltura, rimuovere con cura lo strato muscolare dall'epitelio usando una pinza. Trasferire l'epitelio in una provetta da microcentrifuga contenente 500 microlitri di tripsina allo 0,25% e incubare in un termomiscelatore per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 800 giri / min.
Dopo una breve centrifugazione, trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri tenuto su un tubo conico da 50 millilitri con una punta a foro largo usando movimenti circolari, quindi aggiungere 3 millilitri di inibitore della tripsina di soia, o STI, attraverso il filtro usando movimenti circolari per lavare, quindi strofinare il filtro con la base di uno stantuffo della siringa di tubercolina da 1 millilitro per spingere le cellule attraverso. Lavare il colino con 3 millilitri di PBS da 3 a 5 volte, strofinando il colino con la base della siringa tra un lavaggio e l'altro. Dopo aver pellettato le cellule mediante centrifugazione, rimuovere il surnatante lasciando 1 millilitro di soluzione nel tubo per la ri-sospensione.
Una volta che il pellet è stato risospeso, trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver centrifugato nuovamente il tubo, risospendere il pellet in 100 microlitri di mezzo organoide di topo, o MOM, ed eseguire un conteggio automatico delle cellule. Piastra 5.000 cellule vitali in estratto di membrana basale al 75%, o BME, e MOM con volume totale di 50 microlitri per pozzetto.
Utilizzando una punta a foro largo da 200 microlitri, aggiungere lentamente una goccia da 50 microlitri al centro di ciascun pozzetto evitando il contatto tra la punta e il fondo o i lati del pozzetto. Lasciare solidificare il BME per 30 minuti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità relativa. Dopo l'incubazione, aggiungere con attenzione 500 microlitri di MOM per pozzetto.
Cambia la mamma il giorno 3 o 4, e poi ogni 2 o 3 giorni dopo fino a quando non è pronto per il passaggio. Mantenere il BME scongelato sul ghiaccio, preriscaldare MOM, 0,05% tripsina e STI a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Utilizzando una punta di micropipetta ad ampio foro, raccogliere gli organoidi nella cupola BME insieme al surnatante e interrompere il BME pipettando su e giù.
Dopo aver ottenuto il pellet organoide mediante breve centrifugazione, una volta spostato, risospenderlo in 500 microlitri di tripsina allo 0,05%. Incubare il tubo in un termomiscelatore a 37 gradi Celsius e 800 giri / min per 10 minuti. Inattivare la tripsina con 600 microlitri di STI.
Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di MOM. Eseguire un conteggio automatico delle celle mediante l'esclusione del blu tripano. Per fissare gli organoidi, rimuovere delicatamente il pellet e risospeso in 300 microlitri di paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 gradi Celsius.
Quindi, preparare una superficie di incorporamento capovolgendo un rack di tubi per microcentrifuga e coprendo la superficie con un foglio di pellicola per soffitto, quindi etichettare con l'ID organoide corrispondente. Sovrapporre con attenzione la paraformaldeide rimossa in pellet organoide lavato con PBS aggiungendo 50 microlitri di agar lungo il lato del tubo. Ripetere questo passaggio.
Senza disturbare il pellet, trasferire il pellet nella goccia di gel di agar sul film del soffitto sulla superficie di incorporazione per la solidificazione a 4 gradi Celsius per 45 minuti. Usando una pinza, trasferire con attenzione la goccia contenente il pellet organoide solidificato in una cassetta patologica etichettata. I normali organoidi murini della lingua esofagea e del prestomaco sono stati analizzati morfologicamente mediante imaging in campo chiaro e colorazione istologica.
Il carcinoma esofageo a cellule squamose di un topo trattato con 4NQO ha mostrato atipia nucleare e brusca cheratinizzazione. La capacità di auto-rinnovamento degli organoidi valutata determinando il tasso di formazione degli organoidi in sottocoltura ha mostrato che il tasso di formazione diminuisce in funzione del tempo riflettendo la diminuzione delle cellule basaloidi proliferative negli organoidi maturi. La cinetica di crescita degli organoidi è rivelata dalla loro morfologia in vari punti temporali.
La cheratinizzazione del nucleo interno degli organoidi diventa prominente entro il giorno 10. Le cellule basaloidi proliferative rimangono nello strato cellulare più esterno, anche nei punti temporali del giorno 14 e del giorno 21. Una curva di raddoppio della popolazione di organoidi normali della lingua di topo generati da topi non trattati con 4NQO dimostra la loro crescita costante su più passaggi e una cultura a lungo termine.
Gli organoidi sono piattaforme per lo screening ad alto rendimento per identificare nuovi bersagli terapeutici, l'editing basato su CRISPR per interrogare specifiche funzioni geniche o co-colture per definire quali interazioni nel microambiente tumorale influenzano la trasformazione. Questa tecnica ci ha permesso di studiare fenomeni come l'EMT parziale e l'infezione da HPV, insieme alla loro interazione con il sistema immunitario nella biologia dei tumori a cellule squamose del tratto aerodigestivo.
