Gli autori ringraziano W. Sun e K. Jansen per le discussioni critiche, e per il sostegno da parte del Nano Biomeccanica Lab presso l&#39;Università Nazionale di Singapore. NAK riconosce il sostegno di una Marie Curie IIF Fellowship.

Raccolta 1. Cella <ol><li> Ottenere MD-MBA-231 cellule dal 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Staccare le cellule dal tessuto piastra di coltura con 0,5% di soluzione di tripsina-EDTA. Usare 1 ml di soluzione di tripsina-EDTA per cellule coltivate in un pallone T25. </li><li> Cellule pellet in un tubo da 15 ml per centrifugazione a 200 g per 4 minuti, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 ml di coltura. </li><li> Conte densità cellulare, ρ, utilizzando un emocitometro. Nota: Per preparare il gel interno delle cellule testa di serie, la sospensione cellulare viene successivamente diluito 10 × per raggiungere la finale densità di semina delle cellule. Pertanto, è necessario 10 × sospensione cellulare concentrata. </li><li> Calcolare il volume di terreno richiesta per ottenere una concentrazione di 10 × cellulare: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> Nota: Un finale densità di semina delle cellule, c finale, di circa 215; 10 6 cellule / ml è consigliato per MD-MBA-231 cellule ed è utilizzato in questo protocollo. Altri densità di semina possono essere esplorate anche per altri tipi di cellule. </li><li> Cellule pellet ancora una volta in un tubo da 15 ml per centrifugazione a 200 g per 4 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in quantità necessaria (V calcolati in fase di 1.3) di terreno privo di siero di coltura cellulare a fondo per ridurre al minimo aggregazione delle cellule. Nota: Il rosso fenolo è auto-fluorescente, e può interferire con l&#39;imaging di fluorescenza / riflessione. Uso di mezzo privo di rosso fenolo può essere considerato per ottenere la migliore qualità dell&#39;immagine. </li></ol> 2. Preparazione di collagene Solutions <ol><li> Ottenere la soluzione di riserva di collagene, 10 × tampone PBS, Milli-Q H 2 O, 0.1 M NaOH, e diversi microprovette. Tenere tutti sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione, e mantenere condizioni sterili. </li><li> Equilibrare un vetro- sterilepiatto fondo di pre-riscaldamento nella C incubatore 37 °. Nota: Tutti i volumi di questo protocollo sono stati ottimizzati per un piatto fondo di vetro con 12 millimetri pure. Se si utilizza un altro tipo piatto, regolare i volumi di conseguenza. </li><li> Calcolare il volume richiesto di preparazione di 50 ml di 2,4 mg / ml soluzione di collagene per il gel interno (soluzione I) basata sulla concentrazione collagene magazzino. Nota: altre concentrazioni di collagene per il gel interno possono anche essere utilizzati. </li><li> In un ambiente sterile (tipicamente una cappa di biosicurezza), aggiungere lentamente 5 ml di 10 × tampone PBS alla quantità necessaria di collagene soluzione madre (calcolata al punto 2.3) con dolce vorticoso. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Regolare il pH della miscela a 7,4 usando NaOH 0,1 M utilizzando calibrato pH-metro. Indicativamente, utilizzare circa 5 microlitri per portare il pH vicino a 7,4 (la quantità varia a seconda della concentrazione di magazzino e pH). Nota: Si noti che i volumi coinvolti in questopasso è troppo piccolo per l&#39;uso normale pH metro. Utilizzare uno dei seguenti trucchi: <ol><li> Preparare le soluzioni di collagene per più campioni. Regolare il pH in massa con pH normale metro e distribuire le soluzioni di collagene attraverso i campioni. </li><li> In alternativa, regolare il pH di una soluzione di collagene in volume più grande (i. E., Il volume che consente l&#39;utilizzo di pH normale metro). Notare la quantità di NaOH necessaria per portare il pH a pH finale. Scale giù i volumi e utilizzare la quantità appropriata di NaOH per l&#39;esperimento. Confermare il valore del pH utilizzando carta tornasole. </li><li> Altrimenti, utilizzare un elettrodo di pH micro per regolare più accuratamente il pH di piccole quantità. </li></ol></li><li> Portare la soluzione ad un volume di 45 microlitri con H 2 O. Eseguire tutti i passi sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione. </li></ol> 3. La formazione di Concentric Gel Cultura <ol><li> Prendete il piatto fondo di vetro pre-riscaldato (vedi punto 2.2) da the incubatore. </li><li> Aggiungere 5 ml di sospensione cellulare concentrata 10 × (preparata al punto 1.5) di soluzione I. Risospendere accuratamente. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle d&#39;aria. La miscela ha ora un volume di 50 microlitri e contiene la concentrazione finale collagene (2,4 mg / ml) e la densità delle cellule (c finale = 2 x 10 6 cellule / ml). </li><li> Aggiungere 20 ml della soluzione di cellule contenenti lentamente al centro del pozzo, in modo da formare una cupola a forma di goccia (Figura 1A). Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle in questa fase. Se si forma un bolla, con attenzione ma rapidamente cercare di rottura sia o aspirare utilizzando un puntale. Posizionare delicatamente il piatto di nuovo in incubatrice per lasciare il gel interno polimerizzare per 45 min. </li><li> Preparare la soluzione O (per esterno, gel di collagene acellulare) circa 15 minuti prima della fine di questa fase di incubazione. Nota: La condizione gel esterno può variare in termini di concentrazione di collagene e polimerizzazione a pHottenere reti con diverse microstrutture 10. In questo protocollo, concentrarsi su un 1,5-4,0 mg / ml di gel di collagene polimerizzato ad un pH di 7,4. <ol><li> Sulla base della concentrazione di collagene magazzino, calcolare il volume richiesto necessario per preparare 200 ml di soluzione di collagene O alla concentrazione finale. </li></ol></li><li> Aggiungere 20 ml di 10 × tampone PBS lentamente la quantità richiesta di soluzione di collagene magazzino (calcolata al punto 3.4) con dolce vorticoso. Regolare il pH della miscela a pH finale con 0,1 M NaOH con l&#39;uso di calibrato pH-metro. Vedere nota al punto 2.5 per quanto riguarda la regolazione del pH. </li><li> Portare la soluzione ad un volume finale di 200 microlitri con H 2 O. Eseguire tutti i passi sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione. </li><li> Prendete il piatto dal incubatrice dopo 45 min polimerizzazione del gel interno (vedi punto 3.3). Aggiungere delicatamente 180 microlitri di soluzione di O sulla parte superiore del gel interno, in modo che la soluzione copre completamente i internagel e riempie il pozzo (Figura 1B). <ol><li> Eseguire attentamente questo passo senza agitazione la soluzione, che può portare ad orientamenti fibre non uniformi nel gel esterno. Fare attenzione a non toccare il gel interno con un puntale, e per evitare la formazione di bolle o sacche d&#39;aria. Se si forma un bolla, con attenzione ma rapidamente cercare di rottura sia o aspirare utilizzando un puntale. Posizionare delicatamente il piatto di nuovo in incubatrice per lasciare il gel polimerizzarli esterno. </li></ol></li><li> Prendete il piatto dal incubatrice dopo 45 min di polimerizzazione. Il gel dovrebbe essere già abbastanza solidificato, a questo punto, anche se può ancora staccarsi dalla superficie inferiore se maneggiata. <ol><li> Versare delicatamente 2 ml di mezzo di coltura cellulare riscaldata al piatto (Figura 1C). Assicurarsi che il gel è completamente sommerso nel mezzo. Aggiornare la media ogni 2 - 3 giorni in tutta la durata della cultura. </li></ol></li></ol> 4. Imaging Live-cell <ol><li> Eseguire immagini utilizzando un microscopio confocale invertito dotato di capacità di imaging live-cell-lungo termine. Include un built-in camera di incubazione con una temperatura (37 ° C) e controllo CO 2 (5%). Accendere il microscopio e riscaldare il palco, almeno 1 ora prima di avviare l&#39;esperimento. Nota: Utilizzare lente obiettivo con lunga distanza di lavoro per ottimizzare l&#39;osservazione e la localizzazione delle cellule in gel 3D. </li><li> Incubare il gel in terreno contenente 5 ml di colorante fluorescente inseguitore cellule per 30 minuti per consentire la localizzazione precisa delle cellule del sistema 3D. Successivamente, rimuovere il colorante mediante lavaggio tre volte con 1 × PBS. Successivamente, aggiungere mezzo di coltura cellulare al piatto. </li><li> Prendete il piatto dal termostato e posizionarlo sul palco microscopio (Figura 1D). Nota: l&#39;imaging cellulare dal vivo può iniziare in linea di principio a destra dopo la polimerizzazione del gel esterno. Tuttavia, a questo punto, le cellule in i gel interni non sono ancora diffuse. Per esaminare la migrazione delle prime cellule che hanno invaso il gel esterna, live-cell imaging può iniziare 24 ore (a seconda del tipo di cellula) dopo l&#39;inizio della coltura. Indicativamente, circa 12 - 14 giorni di coltura sono necessari per la maggior parte delle cellule del gel interno per immettere il gel esterno. </li><li> Selezionare Volumi di View (UTP di) nelle regioni del gel esterno che circonda il gel interno. Dopo 24 ore di incubazione, la popolazione cellulare sarà diffuso, attraversato l&#39;interfaccia tra i gel interno ed esterno, e ha iniziato a invadere il gel esterno. <ol><li> Per il Vov di includere le regioni gel immediatamente accanto all&#39;interfaccia gel, regioni intermedie, e le regioni vicino alla periferia del gel esterno 7. Esclusione regioni più stretta di 50 micron dalla superficie inferiore e laterale, nonché dalla parte superiore del gel, per evitare possibili effetti di bordo. Ogni vov misura tipicamente 647 × 647 × 100 micron 3 (in x, Y e Z, rispettivamente), con intervallo di 5 micron di z impili. </li></ol></li><li> Assicurare modalità di imaging, i canali / filtri, tempi di esposizione, e le risoluzioni di immagine sono selezionati correttamente. Per l&#39;imaging senza etichetta della rete di collagene, utilizzare la microscopia confocale riflettanza simultaneamente durante il time-lapse imaging live-cell. </li><li> Prendere immagini di esempio, tracciare gli istogrammi di intensità, e regolare i guadagni e offset a osservare il segnale sufficiente e evitare la saturazione assicurando che l&#39;istogramma si trova tra lo zero e l&#39;intensità massima. Non modificare queste impostazioni più tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Prendere immagini time-lapse dei VOV di selezionati, con un intervallo di tempo, Δ t, di 10 minuti per 8 ore (o più se necessario). </li></ol> 5. Monitoraggio cellulare e analisi dei dati <ol><li> Effettuare immagine quantitative post-processing delle immagini impili z utilizzando appropria<html> te software di elaborazione delle immagini. <ol><li> Segmento le immagini time-lapse per selezionare automaticamente le posizioni di cellule 3D in (x, y, z, t). </li><li> Per ogni fotogramma, controllare manualmente la precisione di localizzazione e rimuovere i falsi positivi dovuti a detriti cellulari e sporgenze cellulari che potrebbero essere stati scambiati per le cellule. Rimuovere le cellule proliferative dall&#39;analisi e le cellule sovrapposte o collegate dividere in oggetti distinti. </li></ol></li><li> Generare tracce cellulari temporizzata 3D dalle coordinate di cella (x, y, z, t) ottenuti nella fase precedente collegando la posizione di ogni cella nella sequenza temporale. </li><li> Eliminare il rumore casuale e sistema rimuovendo tracce inferiori alla lunghezza di traccia soglia (tipicamente 20 min). </li><li> Correggere per la deriva del campione sottraendo gli spostamenti netti complessivi dai binari se necessario. </li><li> Calcolare spostamento delle cellule,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt;, e la distanza migrazione cellulare, <img alt="Equazione 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> , Dalle traiettorie cella osservati, dove è un vettore che rappresenta la posizione 3D di una cella al tempo ed è il numero totale di punti temporali. <ol><li> Calcolare velocità cella come S = d / (n • Δ t), dove Δ t è l&#39;intervallo di tempo tra i fotogrammi. Calcola direzionalità migrazione cellulare (o persistenza) con P = Δd / d. Questa semplice misura di persistenza implica che per P = 0 lo spostamento netto è zero e per P = 1 la traiettoria è una linea retta direzionale. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration.">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li><li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dimensions+in+cell+migration.">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li><li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration.">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li><li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering:+the+effects+of+pH,+temperature+and+ionic+strength+on+gelation.">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li><li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

La migrazione di cellule svolge un ruolo chiave nella varie risposte fisiologiche quali lo sviluppo embrionale, emostasi, e la risposta immunitaria, nonché in processi patologici come le malattie vascolari, infiammazione e cancro 1. Analisi dei fattori biochimici e biofisici sottostanti migrazione delle cellule è quindi di fondamentale importanza non solo per capire i principi fondamentali di funzioni cellulari, ma anche per avanzare varie applicazioni biomediche, come in ingegneria tissutale, anti-metastasi e sviluppo anti-infiammatori droga. Poiché osservazione in vivo è tecnicamente difficile, molti sforzi si è focalizzata sulla ricapitolazione in vitro della migrazione cellulare. Metodi in vitro per studiare la migrazione delle cellule sono state in gran parte progettato per test su due superfici bidimensionali (2D), in particolare il graffio o ferita guarigione test 2. Tali saggi offrono semplice setup sperimentale, facile live-imaging cellulare, e fornire indicazioni utili in diversi meccanismi biochimici alla base delle migrazioni delle cellule. Tuttavia, questi test non rappresentano matrice (ECM) Architettura e rimodellamento extracellulare, che sono aspetti critici nella comprensione della migrazione vivo. Recentemente, è stato sempre più apprezzato che un modello di coltura 3D, spesso in matrici a base di collagene 3, fornisce una piattaforma che meglio assomiglia la situazione in vivo. Infatti, le cellule presentano dinamiche migratori che sono distinti da quelli sulle superfici 2D, soprattutto a causa della diversa dimensionalità dell&#39;ambiente 4. Inoltre, le proprietà biofisiche e meccaniche della matrice influiscono sensibilmente migrazione cellulare 5, anche nel contesto di invasione delle cellule tumorali 6. Qui vi presentiamo un metodo per studiare il comportamento di migrazione delle cellule 3D in ECM con proprietà biofisiche che possono essere facilmente variati condizioni di preparazione. Le cellule sonotesta di serie in un &quot;gel interno&quot; e sono autorizzati a fuggire in e invadere la &quot;gel esterno&quot; inizialmente acellulare. Il metodo si basa sulla capacità delle cellule di riconoscere la presenza e la propensione a migrare in regioni prive di cellule nel gel esterna, che è strettamente legato alla cella mechanosensing 7. In questo studio, ci avvaliamo di reti di collagene come il ECMs invasi dalle cellule del cancro al seno altamente invasive, MD-MBA-231. Le proprietà meccaniche e microstruttura di entrambi i gel interno ed esterno possono essere sintonizzati 8 e 9 caratterizzato per raggiungere condizioni fisiologicamente rilevanti. Ricostruzione e analisi delle tracce cellulari consentono esame quantitativa dettagliata del comportamento di migrazione spaziotemporale sia a livello della popolazione e livello di singola cellula. È importante sottolineare che la messa a punto del sistema di gel concentrica imita il vivo topologia tessuto affrontato da migrazione delle cellule, in particolare invadere le cellule tumorali, offrendo spunti importantiai meccanismi fisici di migrazione cellulare e metastasi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

La capacità delle cellule di migrare è cruciale in un&#39;ampia varietà di funzioni cellulari per tutta la vita di sviluppo embrionale e la guarigione della ferita al tumore e metastasi. Nonostante intensi sforzi di ricerca, i principi biochimici e biofisici fondamentali della migrazione cellulare non sono ancora pienamente compresi, soprattutto nelle fisiologicamente rilevanti (3D) microambienti tridimensionali. Qui, descriviamo un test in vitro per permettere l&#39;esame quantitativo di comportamenti di migrazione delle cellule in 3D. Il metodo sfrutta la capacità mechanosensing della cellula e propensione a migrare nella matrice extracellulare precedentemente occupato (ECM). Usiamo l&#39;invasione delle cellule del cancro al seno altamente invasivo, MDA-MB-231, in gel di collagene come sistema modello. La diffusione della popolazione cellulare e le dinamiche di migrazione delle singole cellule nel corso di settimane della cultura possono essere monitorati tramite live-cell imaging e analizzati per estrarre i dati spatiotemporally-risolti. Inoltre, Il metodo è facilmente adattabile per diverse matrici extracellulari, offrendo così un modo semplice ma potente per studiare il ruolo dei fattori biofisici del microambiente sulla migrazione delle cellule.

Il test gel concentrica qui presentato è stata effettuata utilizzando cellule di carcinoma mammario altamente invasive, MDA-MB-231, con 2,4 mg / ml di gel di collagene interna e una densità di semina cellulare di = 2 × 10 6 cellule / ml, come esempio. Come mostrato in Figura 2, tipicamente dopo alcuni giorni di coltura, le cellule violato l&#39;interfaccia gel interno-esterno e ha iniziato ad invadere il gel esterno. La popolazione di cellule diffuse prevalentemente radialmente verso l&#39...

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Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Le proprietà meccaniche e microstruttura della matrice extracellulare influenzano fortemente la migrazione delle cellule 3D. Un metodo in vitro per studiare il comportamento di migrazione delle cellule spazio-temporale in ambienti biofisico variabili, sia a livello della popolazione e delle singole celle, è descritto.

Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Views.  FOM Institute AMOLF.  Le proprietà meccaniche e microstruttura della matrice extracellulare influenzano fortemente la migrazione delle cellule 3D. Un metodo in vitro per studiare il comportamento di migrazione delle cellule spazio-temporale in ambienti biofisico variabili, sia a livello della popolazione e delle singole celle, è descritto. 

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ricerca

Bioingegneria

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Studio della Migrazione cellulare in canali microfabbricati

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Etichettatura delle vescicole extracellulari per il monitoraggio della migrazione e dell'assorbimento negli espianti di cartilagine

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...