Il nostro protocollo dimostra che l'ECM può promuovere la differenziazione adipogenica in assenza di classici mediatori adipogenici ed è il primo a dimostrare una regolazione specifica della malattia del metabolismo cellulare da parte dell'ECM. La nostra tecnica fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel metabolismo dei tessuti adiposi e consente lo studio del ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi del tessuto adiposo. Rispetto alla coltura cellulare 2D standard, il nostro modello 3D consente un esame e una dissezione più robusti del cross-talk tra adipociti e ECM del tessuto adiposo nel contesto del diabete di tipo 2.
Si consiglia di iniziare con campioni più piccoli per valutare quanto bene è cellularizzato. Tieni presente che c'è variabilità interpaziale nel modo in cui le cellule crescono e in che bene il tessuto decellularizza. È importante osservare il tessuto prima e dopo ogni passaggio per garantire che il tessuto stia diventando decellularizzato e per comprendere le potenziali differenze tra i campioni.
Dopo aver ottenuto il tessuto adiposo viscerale o l'IVA dall'intervento chirurgico, prepararlo per la conservazione aggiungendo 5-10 grammi del tessuto a 15-25 millilitri di soluzione tampone di congelamento in un tubo conico da 50 millilitri. Immergere completamente il campione e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino alla decellularizzazione. Per l'isolamento dei preadipocite, posizionare due grammi di un campione fresco di IVA intatta in 20 millilitri di soluzione di collagenasi di tipo II, quindi inserire forbici sterili nel tubo e tritare accuratamente il tessuto.
Una volta tritato in un liquame fine, incubarlo nella soluzione di collagenasi a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale per 60 minuti. Dopo l'incubazione, filtrare il risultante digerito attraverso una rete di nylon da 100 micrometri in un tubo conico fresco da 50 millilitri. Il digerito dovrebbe essere un liquido giallo-arancio con viscosità moderata e una piccola quantità di fili residui di tessuto non digerito.
Centrifugare il campione a 270 volte g per 10 minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in due millilitri di soluzione di lysing 1X RBC con una pipetta. Incubare la soluzione per un minuto a 25 gradi Celsius, quindi aggiungere 10 millilitri di 15%FBS DMEM F12 e centrifugarla a 270 volte g per 10 minuti. Per preparare l'ECM, congelare/scongelare il campione di IVA precedentemente congelato a 37 gradi Celsius incubandolo in un bagno d'acqua preriscaldato per 20 minuti con agitazione manuale delicata periodica.
Una volta scongelato, trasferire il tessuto a meno 80 gradi Celsius per 20 minuti e ripetere il processo di congelamento / scongelamento tre volte terminando con lo scongelamento. Utilizzare forcep sterili per trasferire il campione di IVA in un tubo conico fresco da 50 millilitri contenente 15-25 millilitri di soluzione enzimatica 1 assicurandosi che il campione sia completamente immerso. Quindi incubarlo durante la notte a 37 gradi Celsius mentre trema a 130 giri/min.
Il giorno successivo, lavare il campione tre volte con 15-25 millilitri di soluzione tampone di risciacquo, versando la soluzione dopo ogni lavaggio. Trasferire il campione in un tubo fresco da 50 millilitri con 15-25 millilitri di soluzione enzimatica 2 e incubarlo durante la notte. Ripetere i lavaggi con la soluzione tampone di risciacquo e trasferire il campione in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione di estrazione del solvente polare.
Incubare il campione durante la notte mentre si trema. Dopo l'incubazione con la soluzione di solvente polare, è importante esaminare il campione per la rimozione lipidica. Se la maggior parte dei lipidi non viene rimossa, potrebbe essere necessario ripetere questo passaggio.
Può essere utilizzato un tempo di incubazione più breve. Dopo l'incubazione, trasferire il campione in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione tampone di risciacquo e lavare il campione tre volte sullo shaker. Quindi lavare il campione tre volte con una soluzione di etanolo al 70%, versando l'etanolo dopo ogni lavaggio.
Lavare il campione una volta con soluzione di stoccaggio, quindi utilizzare forcep sterili per trasferirlo in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione di stoccaggio assicurandosi di immergerlo completamente. Il campione può quindi essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. L'isopropanolo e l'etanolo sono infiammabili e devono essere a temperatura ambiente e smaltiti in rifiuti infiammabili.
Tutti i rifiuti umani devono essere smaltiti separatamente dai normali rifiuti a rischio biologico. Trasferire i frammenti di ECM immagazzinati su singoli pozzi di una piastra a 24 pomp po' con forcep sterili aggiungendo tutti i frammenti necessari per i test a valle pianificati. Lavarli tre volte con 500 microlitri di 70%etanolo su uno shaker orbitale, quindi reidratarli lavandoli tre volte con PBS.
Utilizzare forbici sterili per tagliare l'ECM in frammenti da 100 milligrammi. Posizionare ogni frammento in un pozzo di una piastra di 24 po 'e incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 15 minuti per consentire al PBS in eccesso di estrudere dai frammenti. Quindi rimuovere con cura qualsiasi PBS rimasto dai pozzali con una pipetta.
Seme ogni frammento con 20 microlitri di sospensione cellulare preadipocite tubazionando le cellule direttamente nell'ECM. Posizionare la punta della pipetta nell'ECM ed espellerla delicatamente al centro della matrice assicurandosi che la sospensione cellulare non trabocca e finisca nella parte inferiore del pozzo. Se la sospensione della cella trabocca dall'ECM, rimuovere la punta della pipetta da tale posizione e inserirla altrove nell'ECM.
Dopo la semina cellulare, incubare l'ECM per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Riempire ogni bene con 500 microlitri di mezzi di crescita per coprire i frammenti di ECM seminati. Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore.
Dopo 72 ore, aspirare attentamente il mezzo di crescita senza disturbare il frammento ECM. Aggiungere 500 microlitri di mezzi di differenziazione e coltura le cellule per 14 giorni cambiando il supporto ogni due o tre giorni. Verificare la differenziazione utilizzando la microscopia ottica.
Le cellule accumuleranno lipidi, diventeranno di colore marrone-giallo e diventeranno più sferiche man mano che si differenziano. La preparazione dell'ECM del tessuto adiposo, la semina con preadipociti e la differenziazione in vitro in adipociti maturi sono state monitorate con microscopia elettronica a scansione che ha rivelato la decellularizzazione dell'ECM e la successiva ricapitolazione dei lipidi contenenti adipociti al momento del reseeding e della differenziazione. L'immunoistochimica specifica collagene 1 dell'ECM decellularizzato ha mostrato il mantenimento della micro architettura del collagene mentre la colorazione Oil Red-O di costrutti 3D ECM-adipociti vivi e fissi ha mostrato lipidi contenenti adipociti.
Gli adipociti differenziati in ECM sono stati vengono Viene mostrata la differenza completa nei livelli di trascrizione. Quattro combinazioni di ECM e adipociti di soggetti diabetici e non diabetici sono state sottoposte a fenotipizzazione metabolica.
L'assorbimento alterato del glucosio nella funzione litivitica è stato scoperto nei costrutti dei tessuti diabetici. È importante sottolineare che l'ECM nondiabetica salva l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e la capacità limolitica negli adipociti diabetici. La contaminazione dei preadipociti isolati, del tessuto decellularizzato e dell'ECM risigillato non è rara.
La sterilità deve essere diligentemente mantenuta in tutto il protocollo.
