Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a JLRR da: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880, e NIMH R37 MH049428. PRW è stato sostenuto da una borsa di studio dal National Science Council di Taiwan. SFS è stato sostenuto da F32 (MH103003).

Dichiarazione etica: Le seguenti procedure sono state approvate dal nostro protocollo istituzione e animali. Assicuratevi di ottenere l&#39;approvazione per tutte le procedure che comportano interventi chirurgici di sopravvivenza prima di iniziare gli esperimenti e verificare tutti i protocolli siano aggiornati. 1. Lentivirus Preparazione (Fase Opzionale) <ol><li> Split tre 10 piatti di cellule HEK293T cm per ogni lentivirus da effettuare, alla presenza di 10 ml DMEM / 10% FBS, e crescere a ~ 60-70% di confluenza. Grow cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Trasfettare i seguenti plasmidi DNA (10 mg totali) in ogni piatto con un reagente di trasfezione: 6.4 mg CAG-Flex-GFP vettori lentivirali (sequenza di DNA del vettore di cui alla tabella 1), 1.2 mg pMD2.G (codifica VSV-g), 1.2 mcg pRSV-Rev, e 1,2 mg pMDLg / pRRE. I tre vettori lentivirali imballaggio sono disponibili in commercio (Tabella Nota: Questo particolare approccio utilizza generazione lentivir 3 °AL vettori ma vettori di 2 ° generazione e plasmidi associati anche lavorare. </li><li> Preparare un contenitore di rifiuti contenente una soluzione di candeggina al 10% entro un cappuccio BSL2 certificato per inattivare eventuali soluzioni o dispositivi che hanno contattato o che contengono lentivirus. Avanti, rimuovere completamente i media 4-6 ore dopo la trasfezione nella soluzione di candeggina, sostituire con lo stesso volume di nuovi media, e permettono alle cellule di crescere. </li><li> Dopo 4 giorni, raccogliere i media in 50 ml provette coniche e centrifugare a 1000 xg per 15 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. Successivamente, filtrare il surnatante con una membrana da 0,45 micron. Ogni proteina filtro vincolante basso, come PVDF, funziona bene. Attenzione: posto sia i rifiuti solidi e liquidi virale nella soluzione di candeggina. </li><li> Carico 30 ml filtrati surnatante in provette ultracentrifuga e in un&#39;ultracentrifuga. Centrifugare a 100.000 xg per 2,5 ore a 4 ° C. Aprire le provette in un cappuccio BSL2 e rimuovere il surnatante in 10% Bleach. Aggiungi ~ 100 ml di PBS al pellet, che produce titoli di 1x10 ^ 7-8 infettive unità / ml. Aliquota della giornata e negozio successivo a -80 ° C. Lentivirus aliquote sono stabili a -80 ° C per almeno sei mesi. </li><li> Considerazione importante: molte istituzioni hanno ora core virali. Acquisire virus concentrato con un titolo minimo di 1x10 7 infettive unità / ml, per ottenere risultati ottimali. </li></ol> 2. I topi donatori per MGE Dissection <ol><li> In primo luogo, impostare un accoppiamento a tempo tra una linea Cre-espressione di interessi e di un wild type (WT) mouse o un mouse che esprimerà un giornalista dopo ricombinazione Cre-mediata. Nota: Molte linee Cre driver sono transgenici e sono mantenuti e allevati in stato emizigote. Pertanto, solo la metà degli embrioni conterrà il transgene Cre. DNA può essere rapidamente preparato dagli embrioni per un breve PCR per rilevare l&#39;allele Cre. I + embrioni Cre possono essere raccolte in modo che venga utilizzato solo il tessuto MGE del genotipo desiderato. Alternativamente, un reporter Cre-dipendente può essere utilizzato, per selezionare gli embrioni per MGE dissezione e di trapianto. </li><li> Calcola che giorno corrisponderà E13.5. Se gli animali sono stati accoppiati la sera prima, il giorno della spina è 0,5. Ordine topo gravide temporizzata o una femmina con i cuccioli WT P1 per tempo avere postnatale (P) 1 topi nel giorno del tessuto del donatore sarà E13.5. In alternativa, impostare queste accoppiamenti in casa una settimana prima l&#39;accoppiamento degli animali donatori. Nota: La prima strategia di generare sia E13.5 e embrioni P1 / cuccioli per lo stesso giorno è spesso difficile da fare in modo affidabile. </li></ol> 3. Preparazione di media, strumenti e attrezzature. <ol><li> Preparare i reagenti e gli strumenti per la preparazione di cellule MGE (Tabella 2). <ol><li> Preparare una superficie pulita e posizionare pinze pulite, forbici e un coltello o microchirurgico o pinza sottile (per una precisa dissezione dei tessuti) sulla superficie. </li><li> Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), fo dissezione, e mezzo di Eagle modificato di Dulbeco (DMEM) con il 10% fetale bovino surem (FBS), per la trasduzione. </li><li> Preincubare 20-30 ml DMEM / 10% FBS in un tessuto C cultura incubatore 37 ° per circa 1 ora. Il coperchio deve essere allentato per permettere lo scambio di gas e pH equilibrio dei media. Nota: La preincubazione dei media può essere preparata poco prima di iniziare la dissezione. </li></ol></li></ol> 4. MGE cellulare Preparazione <ol><li> Sacrifica il mouse incinta secondo un protocollo animali approvato e rimuovere gli embrioni in una capsula di Petri 10 centimetri contenente ghiacciata HBSS. </li><li> Rimuovere il cervello da ogni embrione utilizzando un ambito dissezione (fare uno alla volta, lasciando il resto degli embrioni in ghiacciata HBSS) e quindi procedere a tagliare il tessuto MGE. Nota: Si riporta di seguito, e in Figura 1, sono passaggi chiave che mostrano come rimuovere il MGE. Inoltre, la figura 2 è un film che mostra tutta la dissezioneprocedura. <ol><li> Posizionare il cervello con lato ventrale rivolto verso l&#39;alto (figure 1A, A &#39;). Nota: è anche giusto avere la dorsale verso l&#39;alto. Tagliare il cervello a metà lungo il piano sagittale per generare due pezzi. Un esempio hemisected cervello viene mostrato (figure 1B, B &#39;), notare che dorsale (la corteccia sovrastante) e gli aspetti ventrale del coperchio cervello e circondano il tessuto eminenza gangliare (GE). </li><li> Poi, con la mano dominante, tenere sia pinza molto sottili o un stabknife (tabella 2), mentre immobilizzare l&#39;emisfero con una pinza detenuti da una mano non dominante. (Mediale del dell&#39;emisfero deve essere rivolto verso l&#39;alto). Aprire la dorsale e ventrale del tessuto con una pinza e un coltello pugnalata per rivelare il tessuto sottostante GE (Figura 1C e schematizzato in figura 1C &#39;). Nota: la rimozione alcuni media dal piatto dissezione di Petri può rendere più facile per stabilizzare il tessuto mentre performing la dissezione MGE. </li><li> Fare tagli rettilinei con stabknife o una pinza sottile per separare la CGE, LGE e tessuti del setto (vedi esempio tagli indicati con colore rosso linee tratteggiate, figure 1D e D &#39;). Questi tagli possono essere realizzati in qualsiasi ordine. Nota: Immaginate il MGE come una &#39;scatola&#39; che è tagliato fuori dal tessuto circostante. In questo modo contribuisce a rendere riproducibile tagli simili per ogni dissezione, riducendo così la variabilità in dissezioni dei tessuti. </li><li> Infine, girare il MGE su un lato e tagliare la parte inferiore (quella che era la parte laterale del cervello). Questo elimina la zona manto della MGE (scartare nelle figure 1E e 1E &#39;) dal resto del MGE. L&#39;ultimo aspetto della MGE contiene zone prevalentemente ventricolare e porzioni zona subventricolare di MGE, che contiene quasi tutte le cellule progenitrici MGE. Procedere con questo tessuto. </li></ol></li><li> Considerazione importante: L&#39;aggiunta di gel di silicone al fondo di una capsula di Petri can servire come un eccellente superficie dissezione in quanto protegge le delicate punte di pinza e fornisce una superficie morbida per appuntare il tessuto con una pinza. </li></ol> 4.3 strategie aggiuntive per MGE Dissection. <ol><li> Tagliare la pelle dell&#39;embrione con pinze come le forbici per rimuovere rapidamente il cervello. Come l&#39;embrione depone su un lato, tenere il tessuto alla base della testa con le pinze utilizzati per ancorare il tessuto. In primo luogo, tagliare anteriore ventrale al cervello e posteriore ventrale al cervello, e quindi collegare i due tagli lungo il lato dell&#39;embrione. Poi afferrare il lembo di pelle e tirarlo sopra la parte superiore del cervello. Il cervello può essere rapidamente sezionato dal tessuto rimanente. </li><li> In alternativa, ancorare la faccia posteriore tutto il cervello dietro la corteccia. Nel frattempo, afferrare ciascun emisfero all&#39;aspetto caudale più dorsale della corteccia e strappare la corteccia lontano dal tessuto ancorata in direzione anteriore. In questo modo, sia cortices possono essere rimossi e le eminenze gangliari bilaterali sono rivelati, ancora attaccato al resto del tessuto preservare l&#39;anatomia mediale-laterale. </li><li> Passare alla pugnalata coltello per fare tagli precisi in tutto il MGE su ogni emisfero. Utilizzare un set pulito separata di pinze per raccogliere il MGE o una pipetta con una grande punta (es., P1000). Nota: Mantenere il tessuto raccolti lontano da ogni altro materiale sezionato, come alcuni media è inevitabilmente trasferito quando il MGE viene raccolto. </li><li> Raccogliere il MGE e mettere il tessuto in una provetta da 1,5 ml di raccolta contenente DMEM / 10% FBS, (un volume di 500 microlitri è sufficiente per raccogliere i MGEs). Ripetere l&#39;operazione per l&#39;altro emisfero e luogo nello stesso tubo di raccolta. I campioni in ghiaccio fino a quando tutti i tessuti vengono raccolti. </li></ol> 5. etichettatura lentivirali e Trapianti <ol><li> Spostare i tubi di tessuto MGE in una cappa BSL2 certificato e rimuovere il supporto. Nota: IlTessuto MGE è abbastanza grande da essere visibili a occhio e si depositano sul fondo della provetta consentendo media fredde per essere facilmente e delicatamente rimossi. </li><li> Aggiungi ~ 500 ul dei media DMEM / 10% FBS, che è stato preincubata in un 37 ° C tessuto cultura incubatore. Successivamente, aggiungere polibrene facilitare trasduzione a ciascun tubo ad una concentrazione finale di 8 mg / ml. Triturare il tessuto MGE per creare una sospensione di cellule singole, con una punta P1000 pipetta. Infine, aggiungere ~ 15-20 ml di lentivirus concentrato ad ogni provetta. </li><li> Considerazione importante: Una triturazione di 10-12 volte è sufficiente a rompere il tessuto MGE da un unico embrione, ma più triturazioni può essere richiesto se più MGEs sono raggruppate. Provate diverse condizioni triturazione per determinare che cosa funziona meglio. </li><li> Chiudere bene ogni tubo, miscelare, di luogo tutti i tubi in un C incubatore 37 °. Incubare le cellule in lentivirus per almeno 30 minuti e fino a 1 ora. Tempi più lunghi hanno portato a devitalità cellulare sgualcito. Invertire i tubi ogni 10 minuti fino a quando il tempo è scaduto. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con lentivirus, togliere i tubi dal incubatore e centrifugare a ~ 700 xg per 3 minuti per far sedimentare le cellule. Nel cofano BSL2, rimuovere il surnatante e gettarlo in candeggina al 10%. Successivamente, aggiungere 1 ml DMEM / 10% FBS e triturare il pellet 2-3 volte per lavare, centrifugare di nuovo alla stessa velocità per sedimentare le cellule. Ripetere questo lavaggio-passo 2-3 più volte per rimuovere il virus in eccesso. Nota: Eseguire le operazioni di centrifugazione a 4 ° C, tuttavia, ridotta vitalità non è stato osservato quando brevi rotazioni vengono eseguite a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il più media come possibile e mettere ogni tubo in ghiaccio. Grazie ai media residua sui lati del tubo, ~ 2-3 microlitri di supporti finirà copre il pellet dal tempo della procedura di trapianto è iniziato. </li></ol> 6. Trapianti e Validazione <ol><li> Acquisire cuccioli P1 ospitanti e preparare la proceduraArea spruzzando giù con il 70% di etanolo. Per mantenere la sterilità durante la procedura si raccomanda di eseguire queste procedure in una stanza pulita procedura dedicata. Inoltre, utilizzare uno strumenti chirurgici autoclavato sterilizzare le superfici che i cuccioli saranno in contatto con con il 70% di etanolo. Un esempio di equipaggiamenti rappresentativi necessari per effettuare trapianti e un&#39;area procedimento rappresentativo è mostrato in Figura 3. </li></ol> Nota: Mentre questo procedimento è una iniezione di piccoli volumi, e non una procedura chirurgica che richiederebbe un&#39;incisione, ferita aperta o suture, è comunque raccomandato che una nuova micropipetta viene utilizzato per ogni mouse da iniettare. Le micropipette sono sterilizzati calore quando tirato e smussato su una superficie che è stata spruzzata con etanolo al 70% immagazzinato in un contenitore sigillato. <ol><li> Generare micropipette avere un diametro di punta tra i 40-80 micron. A seguito di queste dimensioni sarà resa ottimalerisultati. Calore sterilizzare le micropipette quando tirato e smussato su una superficie e spruzzare con il 70% di etanolo prima di riporre le micropipette in un contenitore sigillato. Nota: In alternativa, se l&#39;accesso ai dispositivi necessari per creare questi aghi (Tabella 2) è limitante, utilizzare qualsiasi altro dispositivo di iniezione. Tuttavia, questi non possono essere adatti come le micropipette causa di diversi diametri. </li><li> Elaborare olio minerale in una siringa da 1 ml, e con un ago 30 G 1/2, riempire completamente la pipetta di vetro con olio minerale. Successivamente, montare il pistone sul dispositivo stereotassico, quindi collegare la pipetta di vetro al dispositivo di carico e stereotassico sul pistone. Utilizzando l&#39;unità idraulica, sposta lo stantuffo a metà strada nella pipetta di vetro, la rimozione di olio minerale che si riversa con un pulito un tovagliolo di carta pulito. <ol><li> In alternativa all&#39;utilizzo di una siringa, immergere l&#39;estremità posteriore della pipetta in olio minerale e riempito per azione capillare. Per evitare bolle d&#39;aria nel pipette, mantenere la pressione positiva sulla siringa fino completamente fuori dalla pipetta di vetro. Nota: Altri dispositivi possono essere utilizzati per trapiantare con successo cellule MGE 14. Qualsiasi dispositivo in grado di fornire un volume inferiore o vicino 100 opere nl anche per questa procedura. </li></ol></li><li> Quindi, utilizzare un tovagliolo di carta sterili, o qualsiasi materiale assorbente, con l&#39;angolo contorto in una punta sottile per rimuovere delicatamente l&#39;eccesso dei media sopra il pellet MGE. Questo passaggio concentra la densità cellulare in modo che i volumi di iniezione più piccoli possono essere raggiunti. Avanti, utilizzare un volume basso (P2 è preferito) pipetta di elaborare lentamente il pellet e triturare 1-2 volte prima di passare la sospensione cellulare su una superficie idrofobica. Il volume dovrebbe essere appena sotto 1 ml. Spostare la punta dell&#39;ago nella sospensione cellulare e con il motore idraulico, elabora la sospensione cellulare nella pipetta. </li><li> Anestetizzare un cucciolo P1 tramite ipotermia (avvolgere in un guanto in lattice e messo in ghiaccio per ~ 2-4 minuti).Verificare l&#39;efficacia di anestesia con uno stimolo nocivo. Pizzica la pelle tra le dita dei piedi con una pinza sottile: il cucciolo deve essere insensibile se pizzicato. Quindi, posizionare il cucciolo su uno stampo che si trova sotto il dispositivo di iniezione, quindi rendere la pelle tesa tirando indietro la pelle sulla testa e fissare con nastro adesivo di laboratorio standard. Nota: Durante l&#39;ipotermia è molto efficace su topi e si traduce in basso tasso di mortalità neonatale, le procedure devono essere fatte in fretta, come cuccioli cominceranno a recuperare in meno di 10 min. Inoltre, 4 min in ghiaccio è un limite superiore di ciò che può essere tollerato. Cercate di indurre ipotermia solo una volta se è richiesto un tempo più lungo per preparazioni iniettabili. Tuttavia, se un cucciolo recupera presto, prima permettere al cucciolo di riprendersi completamente prima di indurre nuovamente ipotermia. Inoltre, solo indurre ipotermia uno più tempo per eseguire le iniezioni. Pups si riprenderà entro 5-10 minuti di ipotermia. Questo può essere facilitato mettendo i cuccioli con lettiera e la mamma o mettendo il cucciolo in un surfac caldoe per recuperare. </li><li> Utilizzando un dispositivo stereotassico, posizionare la punta della pipetta di vetro sulla superficie sulla testa del cucciolo, perpendicolare alla superficie della testa. Quando la pipetta è in contatto con la testa, considerare questo come &#39;0&#39;. Successivamente, spingere la pipetta attraverso la superficie della pelle e del cranio nella corteccia, quindi inserire e ritirare la pipetta ~ 2 volte prima di fermarsi. Per ottimale il targeting delle cellule nella neocorteccia, iniezioni vengono eseguite quando la micropipetta è ad una profondità di 0,1 mm. Tuttavia, questo dovrebbe essere ottimizzato dall&#39;utente (vedi nota sotto). Nota: Durante questa profondità si rivolge in modo affidabile gli strati più profondi neocorticali con i dispositivi sopra descritti, alcuni profondità dovrebbe essere testato determinati empiricamente. Inoltre, un campo di profondità in posizione rostro-caudale e medio-laterale differente deve essere testato per determinare quali profondità è ottimale in ogni sito. Inoltre, la puntura iniziale deve essere rapida, come lenta penetrazione nella neocorteccia diminuisce la capacità di cleanly penetrare il tessuto. Provare diverse velocità al primo avvio di questa procedura per trovare ciò che funziona meglio. Inoltre, per le coordinate di prova, non esiste un vero sostituto per l&#39;utilizzo di cellule marcate, come i coloranti sono stati inaffidabili per indicare la posizione. </li><li> Una volta che l&#39;ago è in posizione, ruotare il dispositivo idraulico per avanzare lo stantuffo nella pipetta di vetro, spingendo un determinato volume di sospensione cellulare nella corteccia. Iniettare 50-70 nls per sito. Ripetere questa procedura in 3-6 siti diversi a diversi livelli rostrale-caudale se l&#39;obiettivo è quello di ottenere una vasta distribuzione delle cellule in tutto il neocorteccia. Nota: I volumi di 100 nl o superiori possono causare lesioni e portare a grandi ciuffi di cellule iniettate che non riescono a migrare in modo efficiente del sito di iniezione. Così, volumi di iniezione più piccoli (~ 70 nl o meno) sono ottimali, su più siti se il tempo lo permette. </li><li> Quando le iniezioni sono, rimuovere il cucciolo dal palco e segnare (tep clipping è un modo affidabile per identificare il pups in seguito). Una volta che il cucciolo ha recuperato ed è in grado di muoversi da solo (questo avviene in pochi minuti di rimuoverli dal palco), la rimise con la mamma e la lettiera. Nota: Dal momento che si tratta di una procedura minimamente invasiva non ci sono procedure di post-chirurgiche, una volta che il cucciolo è liberi di muoversi e riscaldato. Tuttavia, cuccioli devono essere controllati, non solo dopo la procedura, ma anche il giorno seguente per assicurare non hanno segni di deterioramento della salute. </li><li> Prima di avviare la procedura sul successivo cucciolo, spruzzare giù la zona con etanolo al 70% per mantenere una zona di lavoro sterile. Lasciare i cuccioli iniettati di sviluppare e poi valutare il tessuto in fase di sviluppo appropriato (s). </li></ol>

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J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+&#8220;MGE+Enhancers&#8221;+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+(MGE)+Progenitors+and+Neurons.">Use of &#8220;MGE Enhancers&#8221; for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).</li><li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex.">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

L&#39;uso di precursori degli interneuroni GABAergici corticale dalle eminenze gangliari embrionali (GES) per le terapie cellulari basate sta mostrando la promessa per molte condizioni 12 -1 4. Sono necessarie tecniche molecolari precisi per monitorare, ed esprimere geni di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni. Qui forniamo un protocollo dettagliato per etichettare le cellule MGE embrionali con lentivirus prima del trapianto e mostriamo come questa tecnica può essere usata per esprimere geni di...

GABAergici interneuroni corticali costituiscono ~ 20-30% dei neuroni nella neocorteccia dei mammiferi, mentre il resto corrisponde a eccitatori, principali neuroni glutamatergici. Interneuroni sono molto diverse nelle proprietà elettrofisiologiche, assoni e dendriti morfologia e sinaptica mira 1, e gli squilibri in eccitatoria tono / inibitorio Si ipotizza che alla base di alcuni fenotipi di disturbi neuropsichiatrici / neurologici, tra cui l&#39;autismo, la schizofrenia e l&#39;epilessia 2. L&#39;obiettivo generale del protocollo qui descritto è quello di fornire un mezzo per modificare in modo efficiente geneticamente GABAergici progenitori degli interneuroni corticali prima del trapianto in vivo per le analisi. Interneuroni GABAergici corticale nascono in eminenze gangliari mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente) 3,4, così come la zona preottica 5. Progenitori degli interneuroni corticali sottoposti seguita a lunga distanza di migrazione tangenzialedalla migrazione radiale per raggiungere i loro obiettivi finali. All&#39;arrivo a destinazione, questi interneuroni corticali devono integrarsi correttamente nella rete neuronale esistente, e ogni sottogruppo interneurone unica contribuirà alla circuiteria corticale in modi specifici. Quattro sottogruppi principali possono essere distinti da marcatori molecolari: somatostatina MGE-derivato (SST) + e parvalbumina (PV) + sottogruppi, e CGE-derivati ​​peptide intestinale vasoattivo (VIP) + e Reelin +; SST - sottogruppi 6. Diversi sottogruppi interneuroni corticali sono nati più di momenti diversi durante lo sviluppo embrionale nel MGE e CGE 7, 8. Questi e altri corticali marcatori interneuroni GABAergici sono stati utilizzati per generare specifiche linee di Cre-driver per molti di questi sottogruppi 9-11. Il trapianto di progenitori MGE è emersa come una terapia cellulare potenziale per il trattamento di disturbi che possono essere causati da squilibriin eccitazione / inibizione 12 - 24. Questi benefici terapeutici possono essere dovuti in parte alla capacità unica di progenitori MGE (per disperdere, differenziare e integrare in un cervello host), o potenzialmente perché molti peri-somatiche PV inibitorio + cellule derivano dalla MGE. Cellule MGE possono anche essere rapido ed efficiente trasdotte con lentivirus prima del trapianto 15, consentendo alle cellule che sono geneticamente modificati in vitro da studiare in vivo. Il razionale per lo sviluppo di questo approccio è stato quello di superare i blocchi stradali in studio GABAergici sviluppo interneuroni corticale e la maturazione. In particolare, MGE il trapianto ha permesso ai ricercatori di studiare lo sviluppo di cellule mutanti in vivo, quando il mouse mutante avrebbe altrimenti morto in un punto di tempo in anticipo. Inoltre, introducendo geni di interesse prima del trapianto, gli effetti di geni specifici su un fenotipo mutante possono essere valutati in un effmaniera icient. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per trasdurre cellule MGE con lentivirus prima del trapianto. Inoltre, si mostra come questa tecnica può essere adattato per esprimere un gene di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni da un gruppo eterogeneo di precursori degli interneuroni corticali, utilizzando una combinazione di lentivirus espressione Cre-dipendenti e disponibili linee del mouse Cre-driver. Inoltre, questo protocollo introduce tecniche e una piattaforma per i ricercatori di modificare geneticamente GABAergici precursori degli interneuroni corticali per studi in vivo in un modo unico. Un vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri approcci attuali è che le cellule trapiantate MGE si disperderanno di distanza dal sito di iniezione. Inoltre, a differenza di iniezioni virali focali, dopo che le cellule MGE disperdono la loro morfologia è più facile da valutare. Questo approccio può essere usato per studiare l&#39;effetto di introdurre geni di interesse in tipo selvatico o mutante cellule, introducendo un tipo di cellula specificogiornalista per valutare la morfologia, o potenzialmente per studiare l&#39;effetto della malattia alleli in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents and equipment for MGE cell transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>REF 309602</td>
			<td colspan="2">BD, Becton Dickinson and company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301/2 gauge needle</td>
			<td>305106</td>
			<td colspan="2">BD, Becton Dickinson and company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision bore to deliver 5 &#181;l (comes with plunger)</td>
			<td>5-000-1005</td>
			<td colspan="2">Drummond scientific company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td colspan="2">Polysciences, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with boomstand **</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital just for mice stereotaxic instrument **</td>
			<td>51725D</td>
			<td colspan="2">Stoelting company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond coated rotary beveler</td>
			<td>n.a.</td>
			<td colspan="2">made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pipette puller</td>
			<td>730</td>
			<td colspan="2">Kopf instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>n.a.</td>
			<td colspan="2">Any drug store or pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Any pipette and tips that can reliaby measure 1 &#181;l of volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">** These are the particular models we use, but many other setups should work</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional Reagents (for making Lentiviruses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm, 0.45 &#181;m filter</td>
			<td>09-719B</td>
			<td colspan="2">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)</td>
			<td>344058</td>
			<td colspan="2">Beckman Coulter&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)</td>
			<td>11668019</td>
			<td colspan="2">Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other commercially available supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol</td>
			<td>12251</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev plasmid encoding Rev</td>
			<td>12253</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G plasmid encoding VSVG</td>
			<td>12259</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-Flex-GFP</td>
			<td>28304</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral-mediated labeling and transplantation of medial ganglionic eminence (mge) cells for in vivo studies

GABAergici interneuroni corticali, derivati ​​dalla mediale embrionale e eminenze gangliari caudale (MGE e EGC), sono funzionalmente e morfologicamente diversificato. Incursioni sono stati fatti nella comprensione dei ruoli di distinti sottogruppi di interneuroni corticali, tuttavia, ci sono ancora molti meccanismi da elaborati che possono contribuire allo sviluppo e la maturazione dei diversi tipi di cellule GABAergici. Inoltre, la segnalazione GABAergici alterata può contribuire a fenotipi di autismo, la schizofrenia e l&#39;epilessia. Specifiche linee Cre driver hanno cominciato a spartire le funzioni di sottogruppi interneuroni unici. Nonostante i progressi nella modelli murini, è spesso difficile da studiare in modo efficiente GABAergici progenitori degli interneuroni corticale con approcci molecolari in vivo. Una tecnica importante usata per studiare la cellula di programmazione autonoma di queste cellule è il trapianto di cellule MGE in corteccia di accoglienza. Queste cellule trapiantate migrano ampiamente, differenziarsi, unND funzionale integrazione. Inoltre, le cellule possono essere efficacemente MGE trasdotte con lentivirus immediatamente prima del trapianto, consentendo una moltitudine di approcci molecolari. Qui abbiamo i dettagli di un protocollo di trasdurre efficientemente cellule MGE prima del trapianto per l&#39;analisi in vivo, utilizzando disponibili linee Cre-driver e vettori di espressione Cre-dipendenti. Questo approccio è vantaggioso perché unisce manipolazione genetica preciso con la capacità di queste cellule di disperdersi dopo il trapianto, permettendo una maggiore risoluzione specifico tipo cellulare in vivo.

Poiché le cellule MGE hanno la capacità unica di migrare e integrare quando trapiantati in un neocorteccia serie 16, che forniscono un ottimo sistema modello per la manipolazione genetica prima di studi in vivo. Qui, si mostra come si possa isolare il tessuto MGE da embrioni E13.5 (Figure 1 e 2), che possono poi essere trasdotte con lentivirus sia in vitro o in modo rapido prima del trapianto per gli studi in vivo. Etichettatura MGE via lentivirus è stata eseguit...

Watch this Scientific Journal Video about Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies at JoVE.com

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

GABAergici progenitori degli interneuroni corticali disperdono, sviluppare e sinapticamente integrarsi in una corteccia di accoglienza dopo il trapianto. Queste cellule possono essere facilmente trasdotte prima del trapianto per gli studi in vivo di precursori GABAergici geneticamente modificati. Qui, vi mostriamo le tecniche di etichettatura virale per indirizzare specifici sottogruppi di interneuroni utilizzando linee Cre esistenti e giornalisti Cre-dipendenti.

Etichettatura Viral-mediata e trapianto di Medial gangliari Eminenza (MGE) Celle per<em&gt; In Vivo</em&gt; Studi

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

viral-mediated-labeling-transplantation-medial-ganglionic-eminence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

11.4K Views.  University of California San Francisco.  GABAergici progenitori degli interneuroni corticali disperdono, sviluppare e sinapticamente integrarsi in una corteccia di accoglienza dopo il trapianto. Queste cellule possono essere facilmente trasdotte prima del trapianto per gli studi in vivo di precursori GABAergici geneticamente modificati. Qui, vi mostriamo le tecniche di etichettatura virale per indirizzare specifici sottogruppi di interneuroni utilizzando linee Cre esistenti e giornalisti Cre-dipendenti...

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Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Isolamento delle cellule staminali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto per la differenziazione in cellule produttrici di insulina

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum