Este trabalho foi financiado por doações para JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 e NIMH R37 MH049428. PRW foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan. SFS foi apoiada por F32 (MH103003).

Declaração de Ética: Os seguintes procedimentos foram aprovados pelo nosso protocolo da instituição e animal. Certifique-se de obter a aprovação de todos os procedimentos que envolvem cirurgias de sobrevivência antes de iniciar experiências e verificar todos os protocolos estão em dia. 1. Preparação Lentivirus (Passo Opcional) <ol><li> Dividir três placas de 10 cm de células HEK293T por cada lentivírus para ser feita, na presença de 10 ml de DMEM / FBS a 10%, e crescer até ~ 60-70% de confluência. Cultivar células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Transfectar as seguintes plasmídeos de ADN (10? G no total) para cada placa utilizando qualquer reagente de transfecção: 6,4 ug CAG-Flex-GFP (sequência de vector lentiviral vector de ADN fornecida na Tabela 1), 1,2 ug pMD2.G (codifica VSV-g), 1,2 ug pRSV-Rev, e 1,2 ug pMDLg / pRRE. Os três vectores lentivirais de embalagem estão disponíveis comercialmente (Tabela Nota: Esta abordagem particular utiliza lentivir 3ª geraçãovetores al mas vetores de 2ª geração e plasmídeos associados também irá funcionar. </li><li> Prepare um recipiente de resíduos contendo uma solução de água sanitária a 10% dentro de um BSL2 certificada capa de inativar quaisquer soluções ou dispositivos que contenham ou contatados lentivírus. Em seguida, remova completamente os media 4-6 horas após a transfecção para a solução de água sanitária, substitua com o mesmo volume de novas mídias, e permitir que as células a crescer. </li><li> Após 4 dias, recolher meios em tubos cónicos de 50 ml e centrifugar a 1000 xg durante 15 min para sedimentar os detritos celulares qualquer. Em seguida, filtrar o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 um. Qualquer filtro de baixa proteína de ligação, como PVDF, funciona bem. Cuidado: lugar tanto resíduos sólidos e líquidos viral na solução de água sanitária. </li><li> Carregar 30 ml de sobrenadante filtrado em tubos de ultracentrífuga e numa ultracentrífuga. Centrifuga-se a 100.000 x g durante 2,5 horas a 4 ° C. Abra os tubos de centrífuga em uma capa BSL2 e remover o sobrenadante para 10% Bleach. Adicionar ~ 100 ul de PBS para o pellet, que produz títulos de 1x10 ^ 7-8 unidades infecciosas / ml. Alíquota do dia e armazenar seguinte à -80 ° C. Alíquotas de lentivírus são estáveis ​​à temperatura de -80 ° C durante pelo menos seis meses. </li><li> Consideração importante: Muitas instituições têm agora núcleos virais. Adquirir vírus concentrado com um título mínimo de 1x10 7 infecciosas unidades / ml, para melhores resultados. </li></ol> 2. Ratos de Doadores para MGE Dissection <ol><li> Em primeiro lugar, estabelecer um acasalamento cronometrado entre uma linha Cre-expressando de interesse e quer um mouse tipo selvagem (WT) ou um rato que vai expressar um repórter após recombinação Cre-mediada. Nota: Muitas linhas de Cre-driver são transgênicos e são mantidos e criados no estado hemizygous. Assim, apenas metade dos embriões irá conter o transgene Cre. O ADN pode ser rapidamente preparados a partir dos embriões durante um curto de PCR para detectar o alelo Cre. Os embriões + Cre pode então ser colhida, de modo que apenas o tecido MGE do genótipo desejado é usado. Alternativamente, um repórter Cre-dependente pode ser usado, para selecionar os embriões para MGE dissecção e transplante. </li><li> Calcule qual dia corresponderá a E13.5. Se os animais foram pareados na noite anterior, no dia da ficha é de 0,5. Encomendar camundongos dura entrada grávidas ou uma fêmea com filhotes WT P1, a fim de ter tempo de pós-natal (P) 1 ratos no dia do tecido do doador será E13.5. Como alternativa, configurar esses acasalamentos em casa uma semana antes de emparelhar os animais doadores. Nota: A primeira estratégia de gerar tanto E13.5 e embriões P1 / filhotes para o mesmo dia é muitas vezes difícil de fazer de forma confiável. </li></ol> 3. Preparação dos meios de comunicação, ferramentas e equipamentos. <ol><li> Prepare os reagentes e ferramentas para preparação de células MGE (Tabela 2). <ol><li> Prepare uma superfície limpa e coloque forceps limpas, tesoura e uma faca ou microcirúrgica ou pinça fina (para dissecção dos tecidos preciso) na superfície. </li><li> Preparar a solução de sal equilibrada de Hank (HBSS), fou dissecação, e meio de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM) com 10% surem fetal bovino (FBS), durante a transdução. </li><li> Pré-incubar 20-30 ml de DMEM / FBS a 10% em uma temperatura de 37 ° C cultura de tecidos incubadora durante cerca de 1 h. A tampa deve ser solto para permitir a troca de gases e de equilíbrio do pH dos meios de comunicação. Nota: A pré-incubação de mídia podem ser preparadas imediatamente antes do início da dissecção. </li></ol></li></ol> 4. MGE celular Preparação <ol><li> Sacrificar o ratinho grávida de acordo com um protocolo aprovado animais e remover os embriões numa placa de Petri contendo 10 centímetros de gelo-HBSS frio. </li><li> Remover o cérebro de cada embrião usando um escopo de dissecação (fazer um de cada vez, deixando o resto dos embriões em gelada HBSS) e, em seguida, proceder para cortar o tecido MGE. Nota: detalhado abaixo, e na Figura 1, são passos importantes que mostram como remover a MGE. Além disso, a Figura 2 é um filme que mostra toda a dissecçãoprocedimento. <ol><li> Posicione o cérebro com o lado ventral para cima (Figuras 1A, A &#39;). Nota: também é bom ter o dorso virado para cima. Cortar o cérebro em metade ao longo do plano sagital para gerar duas peças. Um exemplo hemisected cérebro é mostrado (Figuras 1B, B &#39;), observe que aspectos ventrais da tampa do cérebro dorsal (o córtex sobreposta) e e cercam o tecido eminência ganglionar (GE). </li><li> Em seguida, com a mão dominante, segure o auxílio de pinças muito finas ou um stabknife (Tabela 2), enquanto que a imobilização do hemisfério com uma pinça na posse de uma mão não-dominante. (Aspecto medial do hemisfério deve ser voltada para cima). Desdobrar o dorsal e ventral de tecido com uma pinça e uma faca facada para revelar o tecido subjacente GE (Figura 1C e diagramado na Figura 1C). Nota: A remoção de alguns meios de comunicação do prato dissecção petri pode tornar mais fácil para estabilizar o tecido enquanto performing a dissecção MGE. </li><li> Faça cortes retos com o stabknife ou uma pinça fina para separar o CGE, LGE e tecidos do septo (ver exemplo cortes indicados por linhas quebradas vermelhas, as Figuras 1D e D &#39;). Estes cortes podem ser feitos em qualquer ordem. Nota: Imagine a MGE como uma &#39;caixa&#39; que é cortada para fora do tecido circundante. Fazer isso ajuda reproducibly fazer cortes semelhantes para cada dissecção, reduzindo a variabilidade nas dissecções de tecido. </li><li> Por fim, vire a MGE de lado e retire o fundo (o que foi o aspecto lateral do cérebro). Isto remove a zona do manto da MGE (descartar nas Figuras 1E e 1E &#39;) a partir do resto do MGE. O aspecto remanescente de MGE contém principalmente zona ventricular e porções zona subventricular da MGE, que contém quase todas as células progenitoras MGE. Continue com este tecido. </li></ol></li><li> Consideração importante: A adição do gel de silicone para o fundo de uma placa de Petri cAn servir como uma superfície excelente dissecação, pois protege as pontas delicadas de uma pinça e proporciona uma superfície macia para fixar o tecido com uma pinça. </li></ol> 4.3 estratégias adicionais para MGE dissecação. <ol><li> Cortar a pele do embrião utilizando fórceps como tesouras para remover rapidamente o cérebro. À medida que o embrião fixa no seu lado, manter o tecido na base da cabeça com as pinças utilizadas para fixar o tecido. Primeiro, corte anterior ventral para o cérebro e posterior ventral para o cérebro, e em seguida, conecte os dois cortes ao longo do lado do embrião. Em seguida, pegue o pedaço de pele e puxe-o sobre a parte superior do cérebro. O cérebro pode então ser rapidamente dissecado afastado do restante tecido. </li><li> Alternativamente, ancorar o aspecto posterior do cérebro inteiro atrás do córtex. Enquanto isso, segure cada hemisfério no aspecto caudal mais dorsal do córtex e rasgar o córtex longe do tecido ancorado em uma direção anterior. Desta forma, tanto cortices pode ser removido e os eminencias ganglionares bilaterais são revelados, ainda ligado ao resto do tecido preservando a anatomia medial-lateral. </li><li> Alterne para a facada-faca para fazer cortes precisos em todo o MGE em cada hemisfério. Utilize qualquer um jogo limpo separado de fórceps para recolher o MGE ou uma pipeta com uma grande ponta (ie., P1000). Nota: Mantenha o tecido coletado longe de todos os outros materiais dissecado, como alguns meios de comunicação social é inevitavelmente transferida quando a MGE é coletado. </li><li> Recolhe-se o MGE e colocar o tecido num tubo de recolha de 1,5 ml contendo DMEM / FBS a 10%, (um volume de 500 ul é suficiente para recolher os EGM). Repita para o outro hemisfério e colocar no mesmo tubo de coleta. Manter as amostras em gelo até todo o tecido é coletado. </li></ol> 5. Lentivirus rotulagem e Transplante <ol><li> Mova os tubos de tecido MGE em um BSL2 certificada capô e remova a mídia. Nota: AMGE tecido é suficientemente grande para ser visível a olho nu e vai assentar no fundo do tubo permitindo que os meios frios e poderem ser facilmente removidos cuidadosamente. </li><li> Adicionar ~ 500 ul de meio DMEM / FBS a 10%, que foi pré-incubada em um temperatura de 37 ° C incubadora de cultura de tecidos. Em seguida, adicionar polibreno para facilitar a transdução de cada tubo para uma concentração final de 8 ug / ml. Tritura-se o tecido MGE para criar uma suspensão de células simples, utilizando uma ponta de pipeta P1000. Finalmente, adicionar ~ 15-20 ul de lentivírus concentrou-se para cada tubo. </li><li> Consideração importante: A trituração de 10-12 vezes é suficiente para quebrar o tecido MGE a partir de um único embrião, mas mais triturações pode ser necessária se vários EGM são agrupados. Experimente diferentes condições de trituração para determinar o que funciona melhor. </li><li> Feche bem cada tubo, inverta para misturar, de lugar todos os tubos em um 37 ° C incubadora. Incubar as células em lentivírus durante pelo menos 30 minutos e até 1 hora. Tempos maiores resultaram em deviabilidade celular vincado. Inverta os tubos a cada 10 minutos até que o tempo acabou. </li><li> Após incubação com lentivírus, remover os tubos da incubadora e centrifugar a 700 xg durante ~ 3 min para sedimentar as células. Na capa BSL2, remover o sobrenadante e descartar em lixívia a 10%. Em seguida, adicionar 1 ml de DMEM / FBS a 10% e tritura-se o sedimento de 2-3 vezes para lavar, depois centrifugar de novo à mesma velocidade para sedimentar as células. Repita esta lavagem passo 2-3 vezes mais para remover o excesso de vírus. Nota: executar os passos de centrifugação a 4 ° C, no entanto, reduziu a viabilidade não foi observada quando rodadas curtas são realizados à temperatura ambiente. </li><li> Após a lavagem final, retire o máximo de mídia quanto possível e colocar cada tubo em gelo. Devido aos meios de comunicação residual sobre os lados do tubo, ~ 2-3 uL de meios vai terminar cobrindo o pellet celular no momento em que o procedimento de transplante começou. </li></ol> 6. Transplante e Validação <ol><li> Adquirir filhotes P1 hospedeiras e preparar o procedimentoa área por baixo de pulverização com 70% de etanol. Para manter a esterilidade durante o procedimento, recomenda-se realizar esses procedimentos em uma sala dedicada procedimento limpo. Além disso, use um instrumentos cirúrgicos autoclavada esterilizar superfícies que os filhotes estarão em contato com a utilização de 70% de etanol. Um exemplo de equipamento representativo necessário para realizar os transplantes e uma área procedimento representativo é mostrado na Figura 3. </li></ol> Nota: Embora este procedimento é uma injecção de pequenos volumes, e não um procedimento cirúrgico, que exigiria uma incisão, ferida aberta ou suturas, é ainda recomendado que um novo micropipeta é utilizado para cada rato para ser injectada. As micropipetas são esterilizada pelo calor quando puxada e chanfrado numa superfície que foi pulverizada com etanol a 70% a ser armazenado num contentor selado. <ol><li> Gerar micropipetas para ter um diâmetro na ponta entre 40-80 mm. Seguindo estas dimensões irá produzir óptimaresultados. Calor esterilizar as micropipetas quando puxado e chanfrado sobre uma superfície e spray com etanol 70% antes de guardar as micropipetas em um recipiente fechado. Observação: Como alternativa, se o acesso aos dispositivos necessários para criar estas agulhas (Tabela 2) é limitativo, utilizar qualquer outro dispositivo de injecção. No entanto, estes podem não ser tão adequados como as micropipetas devido a diferentes diâmetros. </li><li> Elaborar óleo mineral em uma seringa de 1 ml, e com uma agulha de 30 G 1/2, encher a pipeta de vidro completamente com óleo mineral. Em seguida, monte o êmbolo para o dispositivo estereotáxico, em seguida, anexar a pipeta de vidro para o dispositivo estereotáxico e carga para o êmbolo. Usando a unidade hidráulica, mover o êmbolo na metade do caminho para a pipeta de vidro, remoção de óleo mineral que sai com uma toalha de papel limpa limpa. <ol><li> Como alternativa ao uso de uma seringa, submergir a extremidade traseira da pipeta em óleo mineral, sendo preenchido por acção capilar. Para evitar bolhas de ar na pipetae, manter uma pressão positiva na seringa até completamente para fora da pipeta de vidro. Nota: Outros dispositivos podem ser utilizados para o transplante com sucesso células MGE 14. Qualquer dispositivo que pode entregar um volume menor ou perto de 100 obras nl bem para este procedimento. </li></ol></li><li> Em seguida, use uma toalha de papel estéril, ou qualquer material absorvente, com o canto torcido em uma ponta fina para remover delicadamente o excesso de mídia acima do pellet celular MGE. Este passo concentra a densidade de células, de modo que o volume de injecção mais pequenos podem ser atingidos. Em seguida, utilizar um volume baixo (P2 é o preferido) a pipeta para desenhar-se lentamente o pellet celular e tritura-se 1-2 vezes antes de passar a suspensão de células para uma superfície hidrofóbica. O volume deve ser um pouco menos de 1 ml. Mover a ponta da agulha no interior da suspensão de células e o uso da unidade hidráulica, chamar-se a suspensão de células para a pipeta. </li><li> Anestesiar um filhote P1 via hipotermia (embrulhe em uma luva de látex e colocar em gelo durante ~ 2-4 min).Verifique se há eficácia da anestesia com um estímulo nocivo. Aperte a pele entre os dedos dos pés com uma pinça fina: o filhote deve ser responder se beliscou. Em seguida, coloque o filhote em um molde que está sob o dispositivo de injecção, em seguida, fazer a pele firmemente puxando para trás a pele da cabeça e prenda com fita do laboratório padrão. Nota: Enquanto a hipotermia é muito eficaz em ratos neonatais e resulta em baixa taxa de mortalidade, os procedimentos devem ser feitos rapidamente, como filhotes começará a se recuperar em menos de 10 min. Além disso, 4 min em gelo é um limite superior do que pode ser tolerado. Tente apenas induzir hipotermia uma vez se for necessário um tempo maior para injectáveis. No entanto, se um filhote de cachorro recupera cedo, primeiro permitir que o filhote de cachorro para se recuperar totalmente antes de induzir hipotermia novamente. Além disso, só induzir hipotermia mais uma vez para efectuar injecções. Os filhotes de cachorro vai se recuperar dentro de 5-10 min de hipotermia. Isso pode ser facilitado, colocando os filhotes com maca e mãe ou colocando o filhote em um surfac quentee para se recuperar. </li><li> Usando um dispositivo estereotáxico, posicionar a ponta da pipeta de vidro sobre a superfície sobre a cabeça do filhote, perpendicular à superfície da cabeça. Quando a pipeta está em contato com o chefe, considere isso como &#39;0&#39;. Em seguida, empurrar a pipeta através da superfície da pele e do crânio para o córtex, e, em seguida, inserir retrair a pipeta ~ 2 vezes antes de parar. Para um óptimo de células alvo para o neocórtex, injecções são realizadas quando a micropipeta está a uma profundidade de 0,1 mm. No entanto, este deve ser otimizado pelo utilizador (ver nota abaixo). Nota: Enquanto esta profundidade atinge de forma confiável as camadas mais profundas neocortical com os dispositivos descritos acima, algumas profundidades devem ser testados determinada empiricamente. Além disso, uma variedade de diferentes profundidades em rostro-caudal e médio-lateral posição deveria ser testado para se determinar que profundidade é óptima em cada local. Além disso, a punção inicial deve ser rápida, pois a penetração lenta no neocórtex diminui a capacidade de cleanly penetrar no tecido. Tente diferentes velocidades quando a primeira partida este procedimento para descobrir o que funciona melhor. Além disso, para as coordenadas de teste, não há nenhum substituto real para usando células marcadas, como corantes têm sido pouco confiável para indicar posição. </li><li> Uma vez que a agulha esteja em posição, rodar o dispositivo hidráulico para fazer avançar o êmbolo para a pipeta de vidro, que empurra um volume definido da suspensão celular no córtex. Injectar 50-70 nls por site. Repita este procedimento em 3-6 locais diferentes em diferentes níveis rostral-caudal se o objetivo é a obtenção de uma ampla distribuição de células de todo o neocórtex. Nota: Volumes de 100 nl ou maior pode causar lesões e levar a grandes aglomerações de células injectadas que não migrem para fora de forma eficiente no local da injecção. Assim, o volume de injeção de menores (~ 70 nl ou menos) são ótimas, mais de mais sites se o tempo permitir. </li><li> Quando as injeções são concluída, remova o filhote do palco e marcá-lo (recorte dedo do pé é uma maneira confiável para identificar o pups mais tarde). Uma vez que o filhote se recuperou e é capaz de se mover por conta própria (o que ocorre dentro de minutos de removê-los do palco), colocá-lo de volta com a mãe e ninhada. Nota: Uma vez que este é um procedimento minimamente invasivo, não existem procedimentos pós-cirúrgicos, uma vez que o filhote está se movendo livremente e aquecido. No entanto, os filhotes devem ser verificadas, não só após o procedimento, mas também no dia seguinte para garantir que eles não têm sinais de deterioração da saúde. </li><li> Antes de iniciar o procedimento na próxima cachorro, pulverize a área com etanol 70% para manter uma estéril área de trabalho. Permitir que os filhotes injectados para desenvolver e avaliar em seguida o tecido no estádio de desenvolvimento apropriado (s). </li></ol>

<ol>
	<li>Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GABA+innervation+in+the+cerebral+and+cerebellar+cortices.">Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).</li><li>Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+of+autism:+increased+ratio+of+excitation/inhibition+in+key+neural+systems.">Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems.</a> Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).</li><li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+migration+from+basal+forebrain+to+neocortex:+dependence+on+Dlx+genes.">Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes.</a> Science. 278 (5337), 474-476 (1997).</li><li>Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+specification+of+cortical+interneurons.">The origin and specification of cortical interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).</li><li>Gelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wide+Diversity+of+Cortical+GABAergic+Interneurons+Derives+from+the+Embryonic+Preoptic+Area.">A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area.</a> J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).</li><li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons.">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).</li><li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network.">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).</li><li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Bias+in+the+Mitotic+Origins+of+Somatostatin.">Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin.</a> and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resource+of+Cre+Driver+Lines+for+Genetic+Targeting+of+GABAergic+Neurons+in+Cerebral+Cortex.">A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622 (2014).</li><li>Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+progenitors+grafted+into+the+adult+epileptic+brain+control+seizures+and+abnormal.">GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).</li><li>Braz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+GABAergic+Neuron+Precursors+Integrate+into+Adult+Spinal+Cord+and+Reduce+Injury-Induced+Neuropathic+Pain.">Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain.</a> Neuron. 74, 663-675 (2012).</li><li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+Directly+Regulates+Arx+and+CXCR7+to+Determine+Cortical+Interneuron+Fate+and+Laminar+Position.">Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position.</a> Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).</li><li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain.">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).</li><li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6.">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).</li><li>Arguello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dapper+Antagonist+of+Catenin-1+Cooperates+with+Dishevelled-1+during+Postsynaptic+Development+in+Mouse+Forebrain+GABAergic+Interneurons.">Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+in+prefrontal+cortex+receive+subtype-specific+forms+of+excitation+and+inhibition.">Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition.</a> Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).</li><li>Chen, Y. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+&#8220;MGE+Enhancers&#8221;+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+(MGE)+Progenitors+and+Neurons.">Use of &#8220;MGE Enhancers&#8221; for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).</li><li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex.">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

O uso de GABAergic precursores Interneuron cortical das eminências ganglionares embrionárias (BEE) para terapias à base de células está mostrando a promessa para muitas condições 12 -1 4. São necessárias técnicas moleculares precisos para acompanhar e expressar genes de interesse em subgrupos Interneuron específicos. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a marcação das células embrionárias com lentivírus MGE antes do transplante e mostrar como esta técnica pode ser utilizada para e...

GABAergic interneurons corticais compreendem ~ 20-30% dos neurônios no neocórtex de mamíferos, enquanto o restante corresponde a excitatórios, neurônios principais glutamatérgicos. Interneurons são altamente diversificada em propriedades eletrofisiológicas, axônio e dendritos e morfologia sináptica alvo 1, e os desequilíbrios em tom excitatório / inibitória são hipoteticamente subjacentes alguns fenótipos de distúrbios neurológicos / neuropsiquiátricos, incluindo autismo, esquizofrenia e epilepsia 2. O objetivo geral do protocolo aqui descrito é o de proporcionar um meio para modificar de forma eficiente geneticamente GABAergic progenitores Interneuron corticais antes do transplante para análise in vivo. Interneurons Cortical GABAergic nascem nas eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE, respectivamente) 3,4, bem como a área pré-óptica 5. Progenitores Interneuron corticais submetidos a migração tangencial de longa distância seguidopela migração radial para alcançar os seus objectivos finais. Após a chegada ao seu destino, estes interneurônios corticais deve integrar corretamente na rede neuronal existente, e cada subgrupo interneuron única contribuirá para circuitos cortical de maneiras específicas. Quatro subgrupos principais podem ser distinguidos por meio de marcadores moleculares: MGE-derivado de somatostatina (SST) + e parvalbumina (PV) + subgrupos, e peptídeo derivado CGE-intestinal vasoactivo (VIP) e Reelin + +; - SST 6 subgrupos. Diferentes subgrupos Interneuron corticais nascem ao longo de diferentes tempos durante o desenvolvimento embrionário na CGE MGE e 7, 8. Estes e outros marcadores Interneuron GABAérgicos corticais foram usadas para gerar linhas de Cre-controlador específico para muitos destes subgrupos 9-11. O transplante de células progenitoras MGE emergiu como uma terapia baseada em células potencial para doenças que podem ser causadas por desequilíbrios tratarem excitação / inibição 12-24. Estes benefícios terapêuticos pode ser devido, em parte, à capacidade única de progenitores MGE (para dispersar, diferenciar e integrar um cérebro hospedeiro), ou potencialmente porque muitos peri-somáticas PV inibidora + células são derivadas do MGE. MGE células também podem ser rapidamente e eficientemente transduzidas com lentivírus antes do transplante 15, permitindo que as células que são geneticamente modificadas in vitro para ser estudada in vivo. A justificativa para o desenvolvimento desta abordagem foi a de superar obstáculos em estudar GABAergic desenvolvimento interneuron cortical e maturação. Em particular, o transplante MGE permitiu aos pesquisadores para estudar o desenvolvimento de células mutantes in vivo, quando o rato mutante forma teriam morrido em um ponto de tempo inicial. Além disso, através da introdução de genes de interesse antes do transplante, os efeitos de genes específicos em um fenótipo mutante pode ser avaliado em um efforma icient. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para transdução de células MGE com lentivírus antes do transplante. Além disso, mostramos como essa técnica pode ser adaptada para expressar um gene de interesse em subgrupos específicos Interneuron a partir de um grupo heterogêneo de precursores Interneuron corticais, usando uma combinação de lentivírus de expressão Cre-dependentes e disponíveis linhas de rato Cre-driver. Além disso, este protocolo introduz técnicas e uma plataforma para pesquisadores para modificar geneticamente GABAergic precursores Interneuron cortical para estudos in vivo de uma forma única. Uma vantagem desta técnica em relação a outros métodos correntes é que as células transplantadas MGE irá dispersar longe do local de injecção. Além disso, ao contrário de injecções virais focais, depois que as células MGE dispersar sua morfologia é mais fácil de avaliar. Esta abordagem pode ser utilizada para estudar o efeito da introdução de genes de interesse em células de tipo selvagem ou mutantes, a introdução de um tipo de célula específicorepórter para avaliar a morfologia, ou, potencialmente, para estudar o efeito dos alelos da doença in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents and equipment for MGE cell transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>REF 309602</td>
			<td colspan="2">BD, Becton Dickinson and company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301/2 gauge needle</td>
			<td>305106</td>
			<td colspan="2">BD, Becton Dickinson and company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision bore to deliver 5 &#181;l (comes with plunger)</td>
			<td>5-000-1005</td>
			<td colspan="2">Drummond scientific company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td colspan="2">Polysciences, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with boomstand **</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital just for mice stereotaxic instrument **</td>
			<td>51725D</td>
			<td colspan="2">Stoelting company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond coated rotary beveler</td>
			<td>n.a.</td>
			<td colspan="2">made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pipette puller</td>
			<td>730</td>
			<td colspan="2">Kopf instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>n.a.</td>
			<td colspan="2">Any drug store or pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Any pipette and tips that can reliaby measure 1 &#181;l of volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">** These are the particular models we use, but many other setups should work</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional Reagents (for making Lentiviruses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm, 0.45 &#181;m filter</td>
			<td>09-719B</td>
			<td colspan="2">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)</td>
			<td>344058</td>
			<td colspan="2">Beckman Coulter&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)</td>
			<td>11668019</td>
			<td colspan="2">Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other commercially available supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol</td>
			<td>12251</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev plasmid encoding Rev</td>
			<td>12253</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G plasmid encoding VSVG</td>
			<td>12259</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-Flex-GFP</td>
			<td>28304</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral-mediated labeling and transplantation of medial ganglionic eminence (mge) cells for in vivo studies

GABAergic interneurons corticais, derivados da medial embrionário e eminências ganglionares caudal (MGE e CGE), são funcionalmente e morfologicamente diverso. Incursões foram feitas na compreensão dos papéis dos diferentes subgrupos Interneuron corticais, no entanto, ainda existem muitos mecanismos a serem trabalhados que podem contribuir para o desenvolvimento e maturação de diferentes tipos de células GABAergic. Além disso, a sinalização GABAérgica alterada pode contribuir para fenótipos de autismo, esquizofrenia e epilepsia. Linhas Cre-driver específico começaram a dividir as funções de subgrupos Interneuron únicas. Apesar dos avanços em modelos de ratos, muitas vezes é difícil de estudar de forma eficiente GABAergic progenitores Interneuron cortical com abordagens moleculares in vivo. Uma técnica importante para estudar a programação autónoma celular destas células é o transplante de células MGE em córtexes hospedeiros. Estas células transplantadas migrar extensivamente, diferenciar, umand funcionalmente integrar. Além disso, as células podem ser eficientemente MGE transduzidas com lentivírus imediatamente antes do transplante, o que permite uma grande variedade de abordagens moleculares. Aqui nós detalhe de um protocolo para a transdução de forma eficiente as células MGE antes do transplante para análise in vivo, utilizando linhas de Cre-driver disponíveis e vectores de expressão Cre-dependentes. Esta abordagem é vantajosa porque combina manipulação genética precisa com a capacidade destas células para dispersar após o transplante, que permite uma maior resolução específica do tipo celular in vivo.

Como as células MGE tem a capacidade única de migrar e integrar, quando transplantadas para um neocórtex anfitrião 16, eles proporcionam um excelente sistema modelo para a manipulação genética antes de estudos in vivo. Aqui, vamos mostrar como se pode isolar o tecido MGE a partir de embriões E13.5 (Figuras 1 e 2), que, em seguida, pode ser transduzidas com lentivírus in vitro ou de forma rápida antes do transplante para estudos in vivo. MGE Labeling via le...

Watch this Scientific Journal Video about Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies at JoVE.com

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

GABAergic progenitores Interneuron cortical dispersar, desenvolver e synaptically integrar em um córtex hospedeiro após o transplante. Estas células podem ser facilmente transduzidas antes do transplante para estudos in vivo de precursores GABAergic geneticamente modificados. Aqui, vamos mostrar técnicas de marcação virais alvo subgrupos Interneuron específicos usando linhas Cre existentes e repórteres Cre-dependentes.

Rotulagem mediada por vírus e transplante de Medial ganglionar Eminence (MGE) Células para<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudos

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

viral-mediated-labeling-transplantation-medial-ganglionic-eminence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

11.4K visualizações.  University of California San Francisco.  GABAergic progenitores Interneuron cortical dispersar, desenvolver e synaptically integrar em um córtex hospedeiro após o transplante. Estas células podem ser facilmente transduzidas antes do transplante para estudos in vivo de precursores GABAergic geneticamente modificados. Aqui, vamos mostrar técnicas de marcação virais alvo subgrupos Interneuron específicos usando linhas Cre existentes e repórteres Cre-dependentes. 

Vídeo: Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Estudos de estrutura e função em células-tronco embrionárias de camundongos usando troca de cassete mediada por recombinase

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Biologia do Desenvolvimento

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Intravenosa e Intra-amniótica no Utero transplante no modelo murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...