Il nostro protocollo consente la diffusione batterica e il monitoraggio degli oneri in un modello sperimentale di sepsi neonatale in tempo reale e la capacità di correlare altri marcatori di malattia con il carico patogeno. Questo protocollo ci consente di analizzare longitudinalmente la sepsi nei singoli topi neonatali, offrendo l'opportunità di osservare e confrontare le dinamiche di infezione e la diffusione batterica in tempo reale. Con questo metodo è possibile eseguire test preclinici di interventi per sepsi neonatale, consentendo il monitoraggio degli effetti del controllo ospite dei batteri.
Inizia posizionando cuccioli abbinati all'età in gruppi di cucciolate ad alta o bassa dose all'interno di un armadio di livello due di biosicurezza. Il terzo o quarto giorno postnatale, registrare i pesi di tutti i cuccioli prima dell'inoculazione. Caricare siringhe per insulina con PBS o l'inoculo E.coli lux ad alta o bassa dose nell'armadio della biosicurezza e posizionare le siringhe caricate sul ghiaccio.
Posizionare il neonato da iniettare su una superficie pulita all'interno dell'armadio di biosicurezza e sollevare la pelle sulla nuca come per scruffare il cucciolo. Inserire l'ago smussato appena sotto la pelle nello spazio creato tra la pelle e il muscolo. Quando l'ago può essere sentito sotto la pelle, iniettare 50 microlitri dell'inoculante rilasciando contemporaneamente la porzione pizzicata della pelle per prevenire il riflusso, quindi rimuovere l'ago lentamente e con cura.
Quando tutti i cuccioli sono stati iniettati nello stesso modo, riportare i cuccioli alle loro dighe. Immediatamente dopo l'iniezione e nei punti di tempo sperimentali appropriati in seguito, posizionare la gabbia con topi neonatali infetti da E.coli lux e diga in una cappa di flusso laminare di livello biosicurezza due e aprire il software nel micro computer CT. Dopo aver inizializzato il sistema e aver atteso che la temperatura dello stadio si blocchi a 37 gradi Celsius e la temperatura ccd si blocchi a -90 gradi Celsius, posizionare fino a quattro cuccioli anestetizzati sulla scatola di imaging nella camera di imaging nella posizione prona.
Chiudere la porta della camera di imaging e selezionare l'opzione di imaging a luminescenza. Selezionare il filtro aperto e successivo e impostare il filtro di eccitazione da bloccare e il filtro di emissione da aprire. Selezionare 500, 520, 560, 580, 600 e 620 nanometri.
Quindi immagini i cuccioli prima di restituirli alla gabbia con la diga con monitoraggio fino al recupero dell'anestesia. All'endpoint sperimentale appropriato, in un armadio di biosicurezza, utilizzare il neonato eutanasiato con 70%etanolo per prevenire la contaminazione e posizionare l'animale sul lato destro. Utilizzare le forcep per afferrare la pelle tra l'addome e la gamba sinistra posteriore e utilizzare forbici chirurgiche a punta fine per fare un'incisione cutanea.
Quindi continuare l'incisione verso la parte posteriore dell'animale fino a quando l'intera milza è esposta. Utilizzare le forcep e le forbici per rimuovere la milza dall'addome e posizionarla nella soluzione appropriata per la sua applicazione a valle. Per ottenere i polmoni, sbucciare completamente la pelle del torace ed entrare alla base dello sterno con le forbici tenute verticalmente, tagliare verso l'alto fino a quando la gabbia toracica non viene divisa.
Utilizzare le forcep per afferrare singolarmente i polmoni destro e sinistro e rimuovere i polmoni dalla cavità toracica. Rimuovere il cuore dal tessuto polmonare con le forbici. Quindi posizionare il polmone nella soluzione appropriata per la sua applicazione a valle.
Per eseguire un saggio di uccisione batterica in vitro, posizionare la milza non infetta in un colino di nylon da 40 micrometri all'interno di una piastra di Petri sterile da 60 millimetri contenente cinque millilitri di PBS integrati con siero bovino fetale al 10% e utilizzare uno stantuffo sterile a tre millilitri per disaggregare il tessuto in una singola sospensione cellulare. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e raccoglierle per centrifugazione. Rimescolare il pellet in un millilitro di tampone dilisi dei globuli rossi per tre o quattro milza.
Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, lavare le milza in PBS e rimescolare il pellet in 250 microlitri di PBS integrati con albumina di siero bovino e due EDTA millimolare per il conteggio. Successivamente, isolare le cellule positive Ly6 B2 con le perline immunomagnetiche appropriate secondo il protocollo del produttore e seminare le cellule positive Ly6 B2 arricchite a una volta 10 alle cinque cellule per 100 microlitri di media completa per densità di pozzo in una piastra nera o bianca da 96 po '. Preparare l'inoculo batterico alla molteplicità desiderata di infezione in un volume finale di 100 microlitri per pozzo e aggiungere 100 microlitri di inoculo batterico o mezzo da solo a ciascun pozzo per un'incubazione di un'ora nell'incubatore di coltura cellulare.
Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo con 200 microlitri di mezzo fresco completo integrato con 100 microgrammi per millilitro di gentamicina per rimuovere eventuali batteri extracellulari rimanenti e riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per altre due ore. Alla fine dell'incubazione e in ogni momento sperimentale successivo, utilizzare un lettore di piastre per misurare la luminescenza in ogni pozzo della piastra di coltura lidded prima di restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare fino alla lettura successiva. Mentre la maggior parte degli animali mostra alti livelli di batteri nel sangue a 24 ore dopo l'infezione, alcuni cuccioli hanno batteri bassi o non rilevabili nel sangue, suggerendo la clearance dell'infezione entro questo momento.
Inoltre, le cellule spleniche positive Ly6 B2 neonatale infettate da E.coli bioluminescente per un'ora prima della rimozione dei batteri extracellulari e del successivo trattamento con gentamicina hanno espresso un alto livello di luminescenza a tre ore che diminuisce nel tempo indicativo di clearance batterico. L'imaging animale vivo dei batteri luminescenti conferma ulteriormente l'aumento della diffusione e della crescita batterica dei cuccioli neonatale nel tempo a 10 e 24 ore dopo l'infezione. L'imaging intravitale in combinazione con la microTC facilita l'identificazione dei focolai di infezione all'interno del cervello, dei polmoni e di altri tessuti periferici.
I polmoni di alcuni topi altamente infetti dimostrano regioni opache coerenti con il consolidamento infiammatorio che co-localizzato a segnali batterici luminescenti. Queste regioni di presunto essudato infiammatorio non sono osservate nei polmoni di controllo non infetti. Un aumento significativo dell'espressione infiammatoria della citochina rispetto ai controlli si osserva anche in gruppi di inoculo bassi e alti, correlando con un notevole ispessimento della parete alveolare, aumento dell'emorragia alveolare e infiltrazione infiammatoria in questi animali.
Le cose più importanti da ricordare sono eseguire una tecnica corretta quando si eseguono le iniezioni e prestare una rigorosa attenzione ai neonati quando si somministra l'anestesia. Utilizzando questa tecnica, possiamo visualizzare la sepsi neonatale in tempo reale per studiare interventi e ospitare terapie dirette volte a migliorare la risposta immunitaria.
