The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. Preparare Reagenti <ol><li> Preparare la soluzione SDS-estrazione: 0.1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glicerolo, EDTA 10 mM e 1% SDS. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C. </li><li> Preparare i reagenti azionari necessari per il gel di poliacrilammide. <ol><li> Preparare 1.5 M Tris-HCl pH 8.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente. </li><li> 0.5 M Tris-HCl pH 6.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 10% SDS. Filtro sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparare soluzioni necessarie per in-gel tripsina digerire ed estrazione del peptide. <ol><li> Preparare 100 mM di bicarbonato di ammonio. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C. </li><li> Preparare 1 scorte M DTT. Sospeso in 100 mM di bicarbonato di ammonio e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare 550 mm scorte iodoacetamide. Sospeso in100 MM bicarbonato di ammonio e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare 100 ng / ml scorte tripsina. Aliquota 60 ml in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di estrazione: 1% acido formico, 2% acetonitrile. </li><li> Preparare la soluzione risospensione: 5% di acetonitrile e 0,1% di acido formico. </li></ol></li></ol> 2. Eseguire cellulare Lysis in Unità Filtro a cartuccia con celle conservati in RNA Stabilizzazione Solution <ol><li> Espellere la soluzione di stabilizzazione RNA dall&#39;unità filtro a cartuccia (1,5 ml) e in una provetta 2 ml con una siringa da 60 ml attaccata all&#39;estremità luer-lock del filtro. </li><li> Centrifugare la provetta 2 ml per 10 minuti a 17.000 xg per far sedimentare i detriti cellulari. Questo viene fatto in modo che il filtro a passaggio 2.3 non ostruisce. </li><li> Trasferire il surnatante in un gruppo filtrante ultracentrifugo 10 K acquisire qualsiasi proteine ​​provenienti da cellule che sono lisate dal congelamento / thaw del campione. Non gettare il pellet. Sarà utilizzato nel passo 2.5. Eseguire centrifugazione dell&#39;unità filtro ultracentrifugo a 3.270 xg per 30 minuti o fino a quando il volume è ridotto a circa 600 ml. </li><li> Sciogliere la punta di una punta di p10 e bloccare il lato non luer-lock dell&#39;unità filtro cartuccia con l&#39;estremità aperta della punta. Questo farà sì che nessun tampone di estrazione e biomassa scappa durante le fasi di 2,5-2,7. </li><li> Sospendere il pellet in 1 ml di soluzione di SDS-estrazione e pipettare nella dell&#39;unità filtro cartuccia originale. Il modo più semplice per pipetta all&#39;interno dell&#39;unità filtro a cartuccia è di impilare una punta p200 su una punta p1000 e utilizzare questa doppia punta per il pipettaggio. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione SDS all&#39;unità filtro a cartuccia in modo che il volume totale è di circa 2 ml e incubare per 10 min a temperatura ambiente durante la rotazione in un fornetto. Inserire 3 laboratorio accartocciato asciuga in fondo a un tubo 50 ml. Parafilm entrambe le estremità dell&#39;unità filtro a cartuccia chiusae mettere l&#39;unità filtrante a cartuccia nel tubo 50 ml. Chiudere il coperchio e mettere il tubo nel forno di ibridazione. </li><li> Dopo 10 min posto il filtro Sterivex su un galleggiante schiuma e fissarlo in posizione con una siringa da 5 ml all&#39;estremità luer-lock. Float e incubare in un 95 ° C bagnomaria per 15 min. </li><li> Sia l&#39;unità filtrante a cartuccia fresco e ruotare a temperatura ambiente per 1 ora (come al punto 2.6). </li><li> Espellere l&#39;SDS lisato soluzione di estrazione / cellule dal filtro con una siringa da 60 ml nella stessa unità filtro ultracentrifugo come prima (passo 2.3). Aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione fresca SDS all&#39;unità filtro a cartuccia e miscelare per 30 sec a mano, quindi espellere nell&#39;unità filtro ultracentrifugo utilizzando la siringa 60 ml. Questo per risciacquare l&#39;unità filtro cartuccia per assicurare tutte le proteine ​​sono state rimosse. </li><li> Eseguire centrifugazione sull&#39;unità filtrante ultracentrifugo per 45 min a 3270 xg o finché il volume nell&#39;unità filtro è inferiore a 600 microlitri. </li><li> Gettare flusso continuo e rabboccare l&#39;unità filtro ultracentrifugo con soluzione di SDS-estrattivo. </li><li> Centrifugare il filtro per altri 45 min a 3270 x g. </li><li> Ripetere i punti 2.11 e 2.12 altre due volte. Assicurarsi che il volume finale del gruppo filtro ultracentrifugo è al massimo 600 microlitri al termine della centrifuga finale. </li><li> A questo punto, dividere il concentrato in due. Una frazione sarà usato per la precipitazione del DNA e l&#39;altra per la precipitazione delle proteine. Nota: La quantità frazionamento dipende dalla quantità di biomassa che viene filtrato e gli usi previsti dei prodotti. Nel nostro caso, abbiamo diviso il concentrato con il 10% verso la precipitazione del DNA e il 90% verso la precipitazione delle proteine. </li></ol> 3. Proteine ​​Precipitazioni <ol><li> Aggiungere 4 volumi di metanolo: acetone (50:50) per un volume di concentrato e vortex per 10 sec. Incubare per una notte a -20 ° C. </li><li> Spin down a 17.000 xg per 30 min. Decantare il surnatantee lasciare che il pellet (può essere invisibile) a secco in un speedvac per 1 ora (o fino a secco). Nota: Non più di asciugare il pellet in quanto ciò potrebbe rendere difficile per sospendere di nuovo. </li><li> Sospendere il pellet in 25 ml di soluzione di SDS-estrazione. Lasciate riposare per un&#39;ora poi risospendere pipettando su e giù. </li><li> Quantificare proteina utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​e le istruzioni del produttore. </li></ol> 4. DNA Precipitazioni <ol><li> Aggiungere la soluzione SDS-estrazione alla frazione concentrato da utilizzare per la precipitazione del DNA finché il segno 500 microlitri. Questo passo è semplicemente quello di aumentare il volume della soluzione, rendendo più facile lavorare con. </li><li> Aggiungere 0,583 volumi di un reagente precipitazione delle proteine ​​(come la proteina MPC reagente precipitazione) e vortex per 10 sec. Si dovrebbe vedere una forma precipitato bianco. Nota: Abbiamo usato anche fenolo: DNA metodi di estrazione del cloroformio, ma è più difficile a causa dei volumi bassi. Abbiamo ottenuto una migliore resa del DNA utilizzando ilMPC proteine ​​Precipitazioni reagente. </li><li> Centrifugare a 17.000 xg e 4 ° C per 10 min. </li><li> Trasferire il surnatante in un&#39;altra provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 0,95 volumi di isopropanolo. Invertire 30-40 volte. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 4 ° C alla velocità massima. </li><li> Decantare con cautela e scartare il surnatante. </li><li> Risciacquare due volte con 750 ml di etanolo al 70%. </li><li> Rimuovere il più etanolo possibile pipettando, quindi lasciare asciugare all&#39;aria. Nota: Non più di asciugare il DNA in quanto ciò potrebbe rendere difficile per sospendere di nuovo. </li><li> Risospendere in 25 pl di tampone TE bassa, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Quantificare il DNA utilizzando un kit test dsDNA e le istruzioni del produttore. Eseguire gel di agarosio (1%) elettroforesi su 3 ml di DNA per verificare la qualità. </li></ol> 5. SDS-PAGE gel di proteine <ol><li> Preparare tampone campione (950 microlitri tampone campione Laemmli e 50 microlitri β-mercaptoetanolo). &lt;/ li&gt; <li> Aggiungere il volume corrispondente per 15 mg di proteine, o un massimo di 20 microlitri di volume uguale di tampone campione e bollire per 4 min. I campioni possono essere conservati a -80 ° C fino a SDS-PAGE può essere eseguita. </li><li> Preparare 10% acrilamide gel risolvere con un gel di acrilammide impilamento 5%. </li><li> Caricare il gel con campioni e 4 ml di una scala di proteine. Attivare il gel a costante 120 V fino a 250 kDa marcatore scala ha appena raggiunto il gel risolvere. </li><li> Colorare il gel con un Coomassie macchia base secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 6. In-gel tripsina Digest e Peptide Estrazione Nota: Tutti i passi da qui fino a 6.10 vengono eseguiti in una cappa di sicurezza biologica per minimizzare la contaminazione. <ol><li> Tagliare il gel in eccesso sotto la soglia dei 10 kDa scala per ogni corsia. Ogni corsia verrà analizzata sulla MS / MS separatamente. Tagliare ogni corsia in 1 mm x 1 mm quadrati per aumentare la superficie e mettere tutti squares dalla corsia in un tubo a bassa legame micro-centrifuga. Ripetere questa operazione per tutte le corsie. (1% di acido acetico può essere utilizzata per impedire il gel si secchi e diventando difficile da tagliare). Nota: Minimizzare la contaminazione è critico in questa fase, quindi affettare gel viene eseguita in una cappa di sicurezza biologica in SDS-PAGE gel stampo di vetro utilizzato per fare il gel. </li><li> De-macchia <ol><li> Pipettare 50 ml di 100 mM di bicarbonato di ammonio in ogni provetta bassa vincolante, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 10 min. </li><li> Pipettare 50 ml di acetonitrile, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Aspirare e scartare 150 ml. </li><li> Ripetere i punti 6.2.1 e 6.2.2. </li><li> Aspirare e scartare 95 microlitri. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol><li> Dispensare 50 microlitri acetonitrile, vicino tappo ed attendere 5 min. Aspirare e scartare 45 microlitri e aspettare 10 min. </li></ol></li><li> Riduzione <ol><li> Pipettare 50 microlitri DTT (10 mM, diluito in 100 mM ammbicarbonato onium), vicino tappo e attendere 30 minuti a 37 ° C. </li></ol></li><li> Alchilazione <ol><li> Dispensare 50 microlitri iodoacetamide (55 mm, diluito in 100 mM di bicarbonato di ammonio), vicino tappo e attendere 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Dispensare 100 ml di acetonitrile, vicino berretto e incubare per 5 minuti a 37 ° C. Aspirare e scartare 195 ml. </li></ol></li><li> lavaggio <ol><li> Dispensare bicarbonato di ammonio 50 microlitri, vicino berretto e incubare per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Pipettare 50 ml di acetonitrile, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 5 min. Aspirare e scartare 120 ml. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol><li> Dispensare 50 microlitri acetonitrile, vicino tappo ed attendere 5 min. Aspirare e scartare 45 microlitri. </li><li> Dispensare 50 ml di acetonitrile, attendere 5 min. </li><li> Aspirare e scartare il 75 microlitri e attendere 5 minuti. </li></ol></li><li> Digestione <ol><li> Dispensare 25-30 ml di 6 ng / mL tripsina (uino tutti i frammenti di gel sono coperti). Chiudere il tappo e attendere 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare per una notte (minimo 4,5 ore) a 37 ° C. </li><li> Lasciate riposare a temperatura ambiente per 30 minuti. </li></ol></li><li> Estrazione e Peptide Transfer <ol><li> Dispensare 30 ml di soluzione di estrazione e coprire con il coperchio per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Aspirare 30 ml e dispensare il volume aspirato in un nuovo tubo a bassa legante marcato. </li><li> Dispensare 12 ml di soluzione di estrazione e 12 ml di acetonitrile nella provetta originale (con il gel). Chiudere il tappo e incubare per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Aspirare 15 ml e deposito nel nuovo tubo. </li><li> Ripetere i passaggi (6.9.3 e 6.9.4). </li></ol></li><li> Mettere nuovi tubi in un SpeedVac fino a secco. </li><li> Risospendere in 50 ml di soluzione di risospensione. Vortex sul medio per 10 minuti per risospendere. </li><li> Soluzione peptide pipetta in entrambi nano / fiale LC o piastre a 96 pozzetti adatti per nano / LCLavoro MS / MS. </li></ol>

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H., Olsen, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).</li><li>Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+-+a+guide+from+sampling+to+data+analysis.">Metagenomics - a guide from sampling to data analysis.</a> Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).</li><li>Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGAN+analysis+of+metagenomic+data.">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li><li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Conservazione del campione è fondamentale per gli studi metaproteomic e lavoro precedente ha dimostrato che una soluzione di stabilizzazione RNA è un buffer di archiviazione utile per conservare le cellule prima dell&#39;estrazione delle proteine ​​28. Idealmente, i campioni dovrebbero essere conservati in situ di negare cambiamenti nell&#39;espressione delle proteine ​​durante la movimentazione 33,34. Infatti, in situ sono state sviluppate tecnologie di campionamento e ...

I microrganismi sono onnipresenti e svolgono ruoli essenziali nel cicli biogeochimici della Terra 1. Attualmente, ci sono numerosi approcci molecolari disponibili per caratterizzare la struttura comunità microbica e funzione. Più comune è l&#39;analisi del gene 16S rRNA sequenze PCR-amplificato dal DNA ambientale 2-4. Uno svantaggio di analisi del gene 16S rRNA è che fornisce solo informazioni sull&#39;identità filogenetica e struttura della comunità, con poche informazioni sulla funzione metabolica. Al contrario, approcci come metagenomica, metatranscriptomics e metaproteomica forniscono informazioni sulla struttura delle comunità e il metabolismo. Metagenomica o l&#39;analisi del contenuto gene di un assemblaggio di organismi, fornisce informazioni sulla struttura e potenzialità funzionali della comunità 5 - 8. Anche se potente, questo potenziale funzionale potrebbe non corrispondere al metabolicaattività degli organismi. Genotipo di un organismo è rappresentata dai suoi geni, ognuno dei quali può essere trascritto RNA e in seguito tradotti alla proteina, causando un fenotipo. Così, per aiutare nella comprensione della attività funzionale microbica in un ambiente, l&#39;analisi post-genomica deve essere eseguita 9. Metatranscriptomics, o l&#39;analisi dei trascritti di RNA è utile perché rivela quali geni sono trascritti in un determinato ambiente. Tuttavia, i livelli di mRNA non sempre corrispondono ai livelli di proteina corrispondente a causa di regolazione traduzionale, RNA emivita, e il fatto che più copie della proteina possono essere generati per ogni mRNA 10. Per questi motivi metaproteomica è ormai riconosciuta come un importante strumento per microbiologia ambientale. Metaproteomic comune analizza utilizzare un approccio di proteomica fucile da caccia dove la serie completa nei pressi di proteine ​​in un campione complesso sono purificati e analizzati allo stesso tempo, di solito attraverso itdigestione enzimatico in peptidi e analisi su uno spettrometro di massa. Spettrometria di massa tandem successivo (MS / MS) &quot;peptide fingerprinting&quot; è utilizzato per determinare la sequenza di peptidi e proteine ​​di origine potenziale da database di proteine ​​ricerca (per una rassegna vedi 11). Lavoro proteomica ha fatto molta strada negli ultimi 25 anni grazie all&#39;aumento di genomica disponibilità dei dati e l&#39;aumento della sensibilità e la precisione di spettrometri di massa che consentano l&#39;identificazione di proteine ​​ad alto rendimento e la quantificazione 11,12. Poiché le proteine ​​sono il prodotto finale di espressione genica, i dati metaproteomic può aiutare a determinare quali organismi sono attivi in ​​un determinato ambiente e quali proteine ​​stanno esprimendo. Questo è vantaggioso quando si cerca di determinare come un particolare insieme di variabili ambientali influenzerà il fenotipo di un organismo o di una comunità. All&#39;inizio, gli studi metaproteomic basate su MS MS / nell&#39;oceano sono stati usati per identificare le proteine ​​specifiche in miratalignaggi microbici, con il primo studio incentrato sulla luce guidato protonica pompa proteorodopsina in SAR11 batteri marini 13. Più di recente, le analisi comparative metaproteomic hanno chiarito pattern di espressione proteica differenziali tra le comunità complesse. Gli esempi includono l&#39;identificazione di variazioni temporali nel metabolismo del litorale nord-occidentale dell&#39;Oceano Atlantico 14 o la Penisola Antartica 5. Altri studi hanno descritto variazioni dei pattern di espressione proteica attraverso scale spaziali, ad esempio, lungo un transetto geografica da un oceano bassa nutrienti gyre ad un sistema upwelling costiero altamente produttivo 15. Per ulteriori recensioni di metaproteomica si consiglia Schneider et al. (2010) 9 e Williams et al. (2014) 16. Proteomica mirate sono stati anche impiegati negli ultimi anni per quantificare l&#39;espressione di specifiche vie metaboliche nell&#39;ambiente 17,18. There sono tre fasi principali nell&#39;analisi metaproteomic. La prima fase è la preparazione del campione, che comprende la raccolta del campione, la lisi cellulare e la concentrazione di proteine. Raccolta dei campioni in microbiologia marina spesso comporta la filtrazione di acqua marina attraverso un pre-filtro per rimuovere le cellule eucariotiche grandi, particelle e batteri particelle-associata, seguita da filtrazione per la cattura di cellule microbiche vivere liberi, comunemente con l&#39;uso di una cartuccia di 0,22 micron unità filtro 19,20. Questi filtri sono incased in un cilindro di plastica e una lisi cellulare e protocollo di estrazione proteina che può essere effettuata all&#39;interno del gruppo filtro sarebbe uno strumento prezioso. Una volta ottenuta la biomassa, le cellule devono essere lisate per consentire l&#39;estrazione delle proteine. Diversi metodi possono essere impiegati, compresi guanidina-HCl 21 lisi e sodio dodecil solfato (SDS) metodi basati lisi. Anche se i detersivi come SDS sono molto efficienti a distruggere le membrane e solubilizzando molti tipi di proteine, Concentrations partire da 0,1% a valle può interferire con la digestione delle proteine ​​e MS analisi 22. Di grande preoccupazione è gli effetti negativi della SDS su tripsina efficienza digestione, potere risolutivo della retromarcia cromatografia liquida fase e soppressione ionica o l&#39;accumulo all&#39;interno della sorgente di ioni 23. La seconda fase è frazionamento e analisi, in cui le proteine ​​vengono sottoposti a digestione enzimatica seguita da analisi LC MS / MS, conseguente am / z modello frammentazione che può essere utilizzata per determinare la sequenza amminoacidica primaria del peptide triptico iniziale. Vari metodi di digestione può essere eseguita a seconda delle tipologie di detergenti utilizzati, nonché il workflow spettrometria di massa a valle. Nel nostro protocollo, 1-D elettroforesi PAGE seguita dalla rimozione di SDS dal gel viene utilizzato per eliminare eventuali contaminazioni detergente. L&#39;analisi delle proteine ​​che sono difficili da solubilizzare, come le proteine ​​di membrana, richiede l&#39;uso di alta concenzioni di SDS o altri detergenti. Questo porta a problemi di compatibilità con elettroforesi SDS-gel. Se l&#39;obiettivo di uno studio richiede la solubilizzazione di questi difficile da solubilizzare le proteine, il sistema tubo-gel può essere usato 22,24. Il metodo del tubo-gel incorpora proteine ​​all&#39;interno della matrice gel senza l&#39;uso di elettroforesi. Successivamente detergenti utilizzati per la solubilizzazione vengono rimossi prima di digestione delle proteine. La terza fase è l&#39;analisi bioinformatica. In questa fase i dati peptidici MS / MS vengono ricercati con un database di sequenze nucleotidiche tradotti per determinare quali sono presenti nel campione peptidi e proteine. L&#39;identificazione di peptidi dipende database viene ricercato contro. Dati metaproteomic marini sono comunemente cercati nei database costituiti da genomi di riferimento, dati metagenomiche come il set di dati Global Ocean Sampling 25, così come cellulari amplificati genomi singoli da li incoltoneages 26,27. L&#39;identificazione delle proteine ​​può essere aumentato anche l&#39;inclusione di sequenze metagenomiche dallo stesso campione come dati metaproteomic stato derivato 5. Qui forniamo un protocollo per la generazione di peptidi adatti per l&#39;analisi MS MS / da biomassa microbica raccolti per filtrazione e memorizzati in una soluzione di stabilizzazione RNA. Il protocollo qui descritto permette di DNA e proteine ​​per essere isolati dallo stesso campione in modo che tutte le fasi che portano alla proteina e precipitazioni DNA sono identici. Dal punto di vista pratico, meno filtrazione è necessaria poiché solo filtro è necessario per proteine ​​e estrazione del DNA. Vorremmo anche riconoscere che questo protocollo è stato creato attraverso la combinazione, l&#39;adattamento e la modifica di due protocolli precedentemente pubblicati. I passi lisi cellulare sono adattati da Saito et al. (2011) 28 e la tripsina in-gel digerire componente è adattato da Shevchenko et al. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

A dimostrazione, abbiamo eseguito il protocollo su due campioni di acqua di mare prelevati dalla superficie e la clorofilla massima del mare costiera nel nord del Canada. Mentre in mare, 6-7 L di acqua di mare è stato passato attraverso un 3 micron GF / D prefiltro, quindi le cellule microbiche sono state raccolte su un filtro di 0,22 micron unità cartuccia seguendo il protocollo di Walsh et al. 20. Le cellule sono state immediatamente memorizzati in una soluzione di stabilizzatore RNA fino al proc...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per l&#39;analisi basata su spettrometria di massa tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

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Research

JoVE Journal

Environment

8.7K Views.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

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Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Caratterizzazione e applicazione di passivi Campionatori per il monitoraggio dei pesticidi in acqua

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Ricerca

Ambiente

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a transverse vertical incision on the top of the skull with a hand or electrical saw may damage the otolith if not performed correctly. Sturgeons (Acipenseridae) are one family in particular that have a very large and thick skull. A new laboratory method entering the brain cavity from the ventral side of the fish to expose the otoliths was easier than other otolith extraction methods found in the literature. Methods reviewed in the literature are designed for the field and are more efficient at processing large quantities of fish quickly. However, this new technique was designed to be more suited for a laboratory setting when time is not pressing and successful extraction from each specimen is critical. The success of finding and removing otoliths using this technique is very high and does not compromise the structure in any manner. This alternative technique is applicable to other similar fish species for extracting the otoliths.

The goal of the protocol is to show an effective method to extract the otoliths from sturgeon carcasses.

Metodo alternativo di rimozione otoliti da Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Estrazione e l&#39;analisi delle microbica fosfolipidi acidi grassi nei terreni

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive species known to redox regulate biological processes in health and disease. Pre-clinical and clinical evidence points to beneficial effects of plasma treatment in the healing of chronic ulcer of the skin. Other emerging topics, such as plasma cancer treatment, are receiving increasing attention. Plasma medical research requires interdisciplinary expertise in physics, chemistry, and biomedicine. One goal of plasma research is to characterize plasma-treated cells in a variety of specific applications. This includes, for example, cell count and viability, cellular oxidation, mitochondrial activity, cytotoxicity and mode of cell death, cell cycle analysis, cell surface marker expression, and cytokine release. This study describes the essential equipment and workflows required for such research in plasma biomedicine. It describes the proper operation of an atmospheric pressure argon plasma jet, specifically monitoring its basic emission spectra and feed gas settings to modulate reactive species output. Using a high-precision xyz-table and computer software, the jet is hovered in millisecond-precision over the cavities of 96-well plates in micrometer-precision for maximal reproducibility. Downstream assays for liquid analysis of redox-active molecules are shown, and target cells are plasma-treated. Specifically, melanoma cells are analyzed in an efficient sequence of different consecutive assays but using the same cells: measurement of metabolic activity, total cell area, and surface marker expression of calreticulin, a molecule important for the immunogenic cell death of cancer cells. These assays retrieve content-rich biological information about plasma effects from a single plate. Altogether, this study describes the essential steps and protocols for plasma medical research.

A high-throughput cold physical plasma treatment protocol of liquids and cells is shown. It involves setting up different feed gas compositions for plasma ignition, measuring the plasma&#39;s emission spectra, and the subsequent analysis of liquids and cellular activity after plasma treatment.

Ricerca di base in medicina al Plasma - un approccio di Throughput da liquidi a celle

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Caratterizzazione di biofilm acquatici con citometria a flusso

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolamento ed analisi di comunità microbiche nel suolo, rizosfera e radici negli esperimenti di erba perenne

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identificazione- e specie chimica di Polyfluorinated con un flusso di lavoro combinato mirati e Screening di mirati spettrometria di massa ad alta risoluzione

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Una guida alla concentrazione dell'analisi di risposta di frequenza alternata delle celle a combustibile

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...