Questo protocollo è molto significativo perché rappresenta il flusso di lavoro all'avanguardia per l'analisi globale della metilazione dell'arginina proteica mediante spettrometria di massa. Questo è l'unico metodo per identificare e profilare la proteina R-metilata con una risoluzione di stile singola che non è ottenibile con altre tecniche biochimiche. Se accoppiato con l'uso di inibitori PRMT, molti dei quali sono in studi clinici e farmaci antitumorali, questo protocollo consente un'analisi approfondita del loro meccanismo d'azione.
Per iniziare, eseguire la riduzione del gruppo tiolo delle proteine utilizzando una soluzione madre di DTT disciolta in acqua ultrapura ad una concentrazione finale di 4,5 millimolari e lasciare andare la reazione per 30 minuti a 55 gradi Celsius. Eseguire l'alchilazione del gruppo tiolo delle proteine aggiungendo iodoacetamide ad una concentrazione di 10 millimolari e incubando per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Per verificare l'efficienza della proteolisi, conservare un'aliquota di estratto proteico per la successiva analisi su SDS-PAGE Coomassie-stained gel e confrontarlo con una quantità corrispondente di campione dopo la digestione.
Diluire l'estratto proteico rimanente con quattro volumi di HEPES 20 millimolari a pH 8,0 per raggiungere una concentrazione finale di urea di due molari. Dividere il campione in due parti, quindi aggiungere tripsina modificata di grado sequenziale a una e LysargiNase proteasi all'altra. Lasciare i campioni durante la notte a 37 gradi Celsius in un ThermoMixer a 600 rotazioni al minuto per consentire la digestione enzimatica.
Per ogni gradiente cromatografico, raccogliere tutte le frazioni in una piastra profonda da 96 pozzetti. Raggruppare le frazioni raccolte prima dell'inizio del gradiente in un'unica frazione denominata pre. Concatenare le 60 frazioni del gradiente cromatografico liquido a fase inversa ad alto pH raggruppandole in modo non contiguo in 14 frazioni finali.
Per ottenere una concatenazione non contigua, raggruppare le frazioni di fase invertita ad alto pH come descritto nel manoscritto testuale. Raggruppare le frazioni raccolte dopo la sfumatura in una frazione univoca denominata post. Eseguire l'arricchimento sequenziale di immuno-affinità del peptide modificato separatamente per i due campioni dalle digestioni della tripsina e della LysargiNase.
Diluire la purificazione concentrata di immunoaffinità 10X o il tampone IAP 10 volte. Centrifugare i peptidi liofilizzati a 2.000 G per cinque minuti per far girare i peptidi sul fondo del tubo. Risospendere i peptidi con 250 microlitri di tampone IAP diluito per tubo da 15 millilitri e trasferirli in un tubo a basso legame da 1,5 millilitri.
Utilizzare una cartina tornasole per verificare che il pH sia superiore a sei. Tenere una piccola aliquota di ogni frazione come input per la successiva analisi MS. Dividere ogni frazione in due parti per eseguire l'arricchimento immunologico di peptidi asimmetricamente dimetilati, o ADMA, e simmetricamente dimetilati, o SDMA, in parallelo.
Preparare tre flaconcini degli anticorpi anti-pan R-metilati selezionati coniugati a perle di agarosio della proteina A per 10 milligrammi dell'estratto proteico iniziale. Preparare la giusta quantità di anticorpi coniugati alle perle di agarosio centrifugando ogni flaconcino a 2.000 G per 30 secondi e rimuovendo il tampone dalle perle. Lavare le perline tre volte con un millilitro di 1X PBS centrifugandole a 2.000 G per 30 secondi.
Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 40 microlitri 1X PBS per ogni fiala, raggrupparle e poi infine dividerle equamente in 16 frazioni. Aggiungere 250 microlitri di tampone 1X IAP a ciascun tubo e mescolare invertendo. Quindi incubare i tubi su una ruota rotante per due ore a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, centrifugare i tubi da 1,5 millilitri contenenti peptidi e perline coniugate con anticorpi R-metile a 2.000 G per 30 secondi per pellettare le perle e trasferire il flusso da ciascuna frazione in un tubo pulito a basso legame da 1,5 millilitri. Aggiungere le sfere al flowthrough coniugato agli anticorpi contro la metilazione R-mono e ripetere la risospensione in PBS, l'incubazione con tampone IAP e la centrifugazione. Durante l'incubazione dei campioni peptidici con perle di monometilizzazione o MMA, lavare le frazioni precedentemente immunoprecipitate con anti-ADMA e SDMA con tampone IAP da 250 microlitri due volte e scartare il surnatante dopo ogni lavaggio.
Quindi lavare con acqua di grado LC-MS tre volte. Eluire i peptidi SDMA o ADMA arricchiti di affinità dalle perle di agarosio aggiungendo 50 microlitri di 0,15 TFA a ciascuna provetta. Lasciare questa soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente, capovolgendo i tubi ogni due o tre minuti.
Trasferire la prima eluizione in tubi puliti da 1,5 millilitri a bassa legatura e ripetere l'eluizione con 50 microlitri di 0,15 TFA. Raggruppare le due frazioni di eluizione in un tubo. Ripetere questo processo per i peptidi R-mono-metilati che sono stati incubati con le perle anticorpali anti-MMA.
Dopo aver miscelato le cellule marcate leggere e pesanti, le proteine sono state estratte e sottoposte a digestione mediante tripsina e LysargiNase. Un gel colorato con SDS-PAGE Coomassie è stato utilizzato per verificare l'efficiente digestione enzimatica delle proteine totali nei peptidi. È stata valutata l'efficienza della fase di purificazione eseguita dalla colonna C18 Sep-Pak, confermando l'assenza di peptidi nel flowthrough della colonna C18 e nel primo e secondo lavaggio, nonché la loro presenza attesa nell'eluente.
Sono stati valutati la corretta incorporazione di MET4 nel canale pesante e la corretta miscelazione pesante o leggera. Il cromatogramma del frazionamento offline della cromatografia liquida a fase inversa ad alto pH dei peptidi e la successiva concatenazione non contigua delle frazioni sono mostrati qui. I peptidi sono stati rilevati da UV a 250 nanometri, mentre le proteine potenzialmente non digerite sono state valutate da UV a 280 nanometri. Sono stati ottenuti gli spettri MS completi dei peptidi che rappresentano una vera annotazione positiva del peptide metilico.
Le differenze da M a Z osservate tra i tre picchi sono coerenti con la presenza di residui metilati enzimaticamente. Sono stati ottenuti gli spettri MS completi dei peptidi che rappresentano l'annotazione di peptidi metilici falsi positivi. Le differenze da M a Z osservate tra il peptide metilato leggero e la sua controparte pesante punitiva si discostano dal valore atteso di 0,0312.
Il flusso di lavoro del protocollo è nel complesso lineare, ma ci sono alcuni passaggi che richiedono particolare attenzione. Ad esempio, la separazione cromatografica IPH con concatenazione di frazioni non contigue, nonché la configurazione IP. Lo stesso protocollo può essere accoppiato alla quantificazione standard SILAC o label-free per profilare le dinamiche di metilazione dell'arginina in risposta a una varietà di perturbazioni.
Questo protocollo apre la strada alla caratterizzazione dell'estensione e della dinamica della metilazione delle proteine in diversi tipi cellulari e sistemi modello a supporto di tutti gli aspetti della ricerca di base e traslazionale focalizzata sui PRMT.
