Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. Sintesi di Iridium (III) Complesso <ol><li> Pesare 53,6 mg (50 mmol) di [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 e sciogliere in 5 ml di cloruro di metilene. Aggiungi questa soluzione in un beuta da ml 50 dotato di ancoretta. </li><li> Pesare 26,2 mg (100 mmol) di AgOTf e sciogliere in 5 ml di metanolo. </li><li> Aggiungere il AgOTf dissolto al [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 soluzione e mescolare per 1 ora. Nota: un impasto color crema dovrebbe comportare. </li><li> Dopo 1 ora, filtrare la sospensione attraverso gel di silice in un bicchierino fiala di 25 x 95 mm ed evaporare solvente residuo mediante un evaporatore rotativo (5-10 minuti). </li><li> Una volta che la maggior parte del solvente viene rimosso, verificare che un residuo oleoso giallo rimane nel flaconcino. Per questo residuo, aggiungere 1 ml di metanolo di ri-sciogliere il prodotto e lyophilize 1-2 giorni per rendere il prodotto solido giallo. </li><li> Caratterizzare la Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + prodotto (IR1) da H &lt;sup&gt; 1 NMR (in CDCl 3), ESI e UV-Vis come descritto in precedenza. 23 </li></ol> 2. Interazioni di Ir1 con vari amminoacidi <ol><li> Preparare una soluzione 2 mM di Ir1 in metanolo (MW 537,10 g / mol). Vortex per garantire la completa dissoluzione del solido. </li><li> Preparare 100 micron soluzioni delle seguenti aminoacidi e biomolecole in HEPES Buffered Saline (HEPES HBS, 100 mm, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val. </li><li> Pipettare 100 ml di ogni amminoacido in una piastra da 96 pozzetti neri. Aggiungere 100 ml di HBS alla piastra per servire come bianco. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di soluzione 2 Ir1 mM ad ogni campione e agitare la piastra su un agitatore per 10 minuti. </li><li> Dopo 10 min, acquisire gli spettri di emissione dei campioni utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti (365 ex / em 400-700). <ol><li> Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento. </li><li> Impostare la nuova experiment leggere una scansione di fluorescenza con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365 nm e una larghezza della fessura di 9 nm con l&#39;ottica nella posizione superiore. </li><li> Leggi l&#39;emissione 300-700 nm con un passo di 5 nm. </li><li> Esportare i dati per l&#39;analisi dei dati. </li></ol></li><li> Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine l&#39;emissione con un Transilluminatore UV. </li></ol> 3. Titolazione di Ir1 con BNT-II <ol><li> Preparare una soluzione madre 1 mM di BNT-II (MW 8233,6 g / mol) in HBS e una soluzione 2 mM di Ir1 in metanolo. </li><li> Dalla soluzione di riserva, preparare 1 ml di 100 mM BNT-II in HBS. Vortex la provetta per assicurarsi il campione viene miscelato. </li><li> Serialmente diluire il 100 mM BNT-II della metà in HBS ad una concentrazione finale di 1,56 mM BNT-II. </li><li> Aggiungere 100 ml di ogni diluizione, in triplice copia, con HBS che serve come un vuoto, ai pozzetti di una piastra ben 96. Per ogni campione, aggiungere 2,5 ml di 2 Ir1 mm. </li><li> Shake la piastra per 10 minuti su un agitatore. </li><li> Dopo aver agitato, leggere l&#39;intensità di emissione a 510 nm (eccitazione a 365 nm) utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. <ol><li> Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento. </li><li> Impostare il nuovo esperimento di leggere un endpoint di fluorescenza con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365 nm ed emissione lunghezza d&#39;onda di 510 nm. Impostare la larghezza della fessura per entrambe le lunghezze d&#39;onda a 9nm, con l&#39;ottica nella posizione superiore. </li><li> Leggere la piastra ed esportare i dati per l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine la titolazione usando un transilluminatore UV. </li></ol> 4. in tempo reale Kinetic analisi del sistema Ir1 / BNT-II Utilizzando Biolayer Interferometry <ol><li> Aggiungere 200 ml di tampone cinetico (KB; 1x tampone fosfato con 0,02% Tween-20) a 8 pozzetti nella prima colonna di una piastra a 96 pozzetti nera e inserire la piastra nel sensore di plasticatitolare. Trasferire accuratamente 8 Ni (II) biosensori NTA alla prima colonna nel supporto di plastica in modo che le punte sono sospesi nei pozzetti di tampone. Posizionare il supporto di plastica nella parte sinistra dello strumento interferometria. </li><li> Preparare un 2 ml di una soluzione allo 0,5 micron di BNT-II in KB. </li><li> Preparare 500 ml di una soluzione al 10 micron di Ir1 in KB, e in serie diluire metà in giù a 0,156 micron di KB. </li><li> Per una nuova nera 96 ​​pozzetti, pipetta 200 ml di KB a tutti 8 pozzetti nella colonna A e C. </li><li> Nello stesso piatto, pipettare 200 ml di soluzione di 0.5μM BNT-II ai pozzetti nella colonna B. </li><li> Pipettare 200 ml di ogni diluizione di Ir1 in colonna D, a partire KB come il vuoto in D1 bene. Aggiungere le diluizioni in modo che i pozzi aumentano in concentrazione Ir1 lungo la colonna. </li><li> Inserire questa piastra nello strumento a destra della piastra contenente i sensori pre-bagnatura. </li><li> Nel software biolayer interferometria, ha istituito un Kinet baseesperimento ic definendo le punte piatto, di analisi, e dei sensori. <ol><li> Per definire la piastra, selezionare una colonna sullo schermo, fare clic destro e scegliere la definizione appropriata per i pozzi. Selezionare &quot;Buffer&quot; per le colonne A e C, &quot;Load&quot; per la colonna B, e &quot;Campione&quot; per la colonna D. </li><li> Definire il test nella scheda successiva, aggiungendo le seguenti operazioni (Fare clic su &quot;Aggiungi&quot;): equilibrazione (su ordinazione), 60 sec; Caricamento in corso, 120 sec; Baseline, 60 sec; Associazione, 120 sec; e dissociazione, 300 sec. Selezionare il passo Equilibration e fare doppio clic su colonna A. Ripetere l&#39;operazione per Loading (colonna B), Baseline (colonna C), Association (colonna D), e la dissociazione (colonna C). Selezionare i sensori Ni (II) NTA. </li><li> Spostare alla scheda successiva e confermare che i sensori sono nella colonna A sul supporto del sensore in plastica. </li><li> Confermare l&#39;esperimento è descritto correttamente, inserire un nome di file, in modo che &quot;esperimento ritardo&quot; è selezionata, e premere &quot;Go&quot;. Nota: A causa della natura automatizzata dello strumento, una volta che l&#39;esperimento cinetica è delineato, si verificherà la procedura come programmato. </li></ol></li><li> Una volta che la corsa cinetica è completa, elaborare i dati nel software di elaborazione disponibile. <ol><li> Fare doppio clic sulla cartella con il nome del file di interesse nella parte inferiore del pannello di sinistra. Quindi, fare doppio clic sulla cartella corrispondente alla voce &quot;Cinetica&quot; nella parte superiore del pannello. Passare alla scheda Elaborazione. </li><li> Selezionare la casella Sottrazione a sinistra per aprire la schermata di selezione del sensore. Fare clic destro sul bene A4 e modificare il tipo di bene di riferimento Well. </li><li> Seleziona la casella accanto a Allinea asse Y, e assicurarsi che il passo selezionato è Baseline. Specificare l&#39;intervallo di tempo per essere gli ultimi cinque secondi della linea di base (circa 55-60 secondi). </li><li> Selezionare la casella relativa correzione Inter-passo e selezionare Allinea a dissociazione. Assicurarsi che la casella Savitzky-Golay filtro viene controllato e premere il tasto di processo &quot;Dati! ̶1; </li><li> Passare alla scheda Analisi. Assicurarsi che &quot;Associazione e dissociazione&quot; è la selezione per i passaggi per analizzare e che il modello è di 1: 1. Selezionare un locale, in forma completa e premere &quot;Curve Fit!&quot; </li><li> Evidenziare tutte le curve nella tabella e fare clic destro per impostare tutte le curve a un colore. Avanti, selezionare un fit (Full) globale, raggruppati per colore e Rmax scollegato dal sensore. Premere &quot;Curve Fit!&quot; Per ottenere i dati cinetici globali. </li></ol></li></ol> 5.-tallone Rilevazione di BNT-II e rcHRP-II con Ir1 <ol><li> Preparare 1 ml ciascuna di una soluzione 1 mM di BNT-II e rcHRP-II in HBS con Tween (HBST; HBS con 0,025% Tween 20). </li><li> Serialmente diluire ogni proteina della metà in HBST ad una concentrazione finale di 15,6 nM. </li><li> Dispensare 100 ml di ogni diluizione, in triplice copia, in una piastra a 96 pozzetti bianco, con le diluizioni in ordine dal più basso al più alto concentrazione di una colonna. </li><li> Pipettare 10 ml di 50 micron Ni (II) NTA particelle magnetiche agarosio in ogni diluizione bene. <ol><li> Vortex la provetta contenente le particelle magnetiche dopo ogni pipettaggio per garantire le particelle rimangono sospese. </li></ol></li><li> Porre la piastra su un agitatore per 15 minuti per incubare i campioni con le particelle. </li><li> Dopo questo periodo di incubazione, posizionare la piastra su un magnete piastra a 96 pozzetti e attendere 30 sec per le particelle di tirare dalla soluzione. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, tirare fuori il campione originale e scartare come rifiuti. Rimuovere la piastra dal magnete. </li><li> Aggiungere 200 ml di HBST in ogni pozzetto usando la pipetta multicanale. Pompa il buffer su e giù diverse volte per lavare le particelle magnetiche. </li><li> Posizionare la piastra posteriore sul magnete e attendere 30 secondi per le particelle di tirare dalla soluzione. </li><li> Utilizzando la pipetta multicanale, tirare fuori i 200 ml di tampone e scartare come rifiuti. Rimuovere la piastra dal magnete. </li><li> Ripetere i punti 5.8 through 5.10 due volte per completare tre lavaggi delle particelle. </li><li> Aggiungere 100 ml di HBST ad ogni pozzetto contenenti particelle magnetiche seguiti da 2,5 ml di 2 Ir1 mm. </li><li> Incubare le particelle con Ir1 su un agitatore per 1 ora. </li><li> Dopo 1 ora, leggere l&#39;intensità di emissione a 510 nm (eccitazione a 365 nm) utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. <ol><li> Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento. </li><li> Impostare il nuovo esperimento di leggere un endpoint di fluorescenza con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365 nm ed emissione lunghezza d&#39;onda di 510 nm. Impostare la larghezza della fenditura per entrambe le lunghezze d&#39;onda di 9 nm, con l&#39;ottica nella posizione superiore. </li><li> Leggere la piastra ed esportare i dati per l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine la titolazione mediante una Transilluminatore UV. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Come strumenti diagnostici basati su microparticelle vengono alla ribalta della tecnologia diagnostica moderna, l&#39;individuazione di biomolecole bersaglio direttamente sulla superficie della particella è un grande vantaggio. Metodi di rilevamento molecolari tradizionali, come ELISA e PCR, sono vantaggiosi, in quanto possono raggiungere molto bassi limiti di rilevazione 25. Tuttavia, questi test richiedono ampi reagenti e protocolli lunghi. Questo test è stato progettato per simulare le interazioni di tipo ELISA a sandwich senza il tempo ei requisiti reagenti (Figura 5). Inoltre, il costo della sonda Ir1 per campione è stato stimato a circa un centesimo, mentre il costo di anticorpi per un tipico ELISA è $ 0,20-0,30 per campione. Poiché i metodi sopra descritti si basano su una sonda iridio ciclometallati per il rilevamento del biomarker malarica, questa sonda non sarebbe suscettibile di modi di guasto comune ad altri metodi di rilevamento (es. Fluoroforo quenching e la degradazione degli anticorpi / enzima). Istidina è unico nelle sue caratteristiche di legame metallo. Il lavoro descritto sfrutta questo fenomeno sostituendo gli anticorpi in un tipico panino ELISA con contenenti metalli complessi. Ni (II) NTA cattura rcHRP-II sulla superficie della particella e Ir1 segnala la presenza della proteina. La fase più critica nel saggio sta permettendo le particelle magnetiche per mescolare con il campione e la sonda. In una piastra a 96 pozzetti ELISA, biomolecole e reagenti raggiungono l&#39;equilibrio con la superficie bidimensionale del fondo del pozzo. Particelle magnetiche hanno la tendenza a stabilirsi dalla soluzione per il loro nucleo di ferro-ossido denso, che ridurrebbe i siti di legame disponibili. Così, le particelle devono essere miscelati durante il tempo di saggio per garantire la massima vincolante. Nel progettare un reagente per la diagnosi di malattia, bisogna tenere presente forma di campione del paziente come pure la concentrazione fisiologica del biomarker. Permalaria, la concentrazione di pf HRP-II nel sangue di un paziente può variare da basso a alto picomolare nanomolare. Mentre questo saggio è clinicamente rilevante per i livelli più alti di infezione, il limite di rilevamento deve essere migliorata al fine di individuare i pazienti asintomatici con basso picomolare circolante pf HRP-II. Nei metodi descritti sopra, la &quot;switch-on&quot; segnale generato da Ir1 si verifica in presenza di istidina. Mentre il biomarker malarica è ricca di istidina, altre proteine ​​del siero, come albumina di siero umano e istidina ricca glicoproteina, risulterebbe in una risposta di segnale con la sonda. Ciò a sua volta portare a diagnosi di falsi positivi. Questo rende la cattura della proteina sulla superficie della particella un passo vantaggioso, in quanto la proteina di interesse può essere rapidamente estratto da un campione clinico. Inoltre, la progettazione di una sonda bifunzionale, che le coppie un ricco peptide istidina ad un elemento di riconoscimento molecolare robusta (es. Aptamer), Potrebbe aggiungere un altro strato di specificità del test. Il peptide dovrebbe essere caricato con iridio prima dell&#39;accoppiamento al aptamer. In tale disegno, la sonda stabile Ir1 può ancora essere utilizzata mentre il raggiungimento dell&#39;obiettivo specificità con aptamer. Ciò consentirebbe l&#39;applicazione della sonda per rilevare nativa HRP-II in una matrice complessa (es. Plasma o sangue intero) e ridurre gli effetti vincolanti non specifici. Al fine di migliorare ulteriormente il segnale di test diagnostici rapidi, il dosaggio potrebbe essere incorporato in un sistema electrochemiluminescent (ECL), dove pf HRP-II può essere rilevata sulla RDTs come un visualizzatore 26 elettrochimica. Questa sonda generazione iridio successivo sarebbe migliorare notevolmente la nostra on-bead ELISA per la rilevazione di biomarcatori di malattia.

Etichettatura colorimetrica e fluorescenti è un metodo importante per l&#39;individuazione e la localizzazione di molecole biochimiche e dei processi 1,2. I marcatori fluorescenti più comuni sono a basso peso molecolare, coloranti organici 3,4, ma queste molecole non hanno sempre proprietà ottiche ideali. Coloranti fluorescenti sono inclini a photobleaching, spesso hanno piccoli spostamenti Stokes, e può avere sovrapposizioni di eccitazione e spettri di emissione. Etichettatura colorimetrico è spesso raggiunto con l&#39;uso di etichette enzimatiche, che hanno un segnale amplificato utile immunodosaggio quantificazione 5,6. Questi enzimi hanno anche i loro svantaggi, tra cui fotosensibilità, condizioni di reazione, e la shelf life breve substrato. Queste proprietà tendono a richiedere saggi immunologici e metodi di etichettatura di proteine ​​deve essere fatto in condizioni ben controllate utilizzano reagenti costosi. Complessi di metalli di transizione emissivi sono stati esplorati come un approccio di etichettatura alternativa for rilevamento biochimica. In particolare, ciclometallati Ir (III) è stata studiata nel contesto di diodi luminosi organici (OLED) di rilevamento 7-9 ossigeno 10, Catalisi 11, e proteine ​​/ cella colorazione 12-14. Alta fotostabilità ed efficienza quantica rendono questa classe di sonde un buon candidato per il rilevamento di biomolecole 15,16. In precedenza era emerso che ciclometallati Ir (III), nella forma [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, irreversibilmente legano istidina e suscitare una risposta del segnale blu-verde 12,17. Questi complessi sono non emissive nello stato solvento, ma quando istidina sposta le molecole di solvente e si lega al centro metallico, rilasciano un segnale fosforescente intenso dopo irradiazione onde lunghe UV. Questo segnale si verifica solo dopo sostituzione del legante, ed è il risultato di un elettrone tripletto relax allo stato fondamentale attraverso l&#39;attivazione di trasferimento di carica metallo legante (3 MLCT) e trasferimento al centro ligando (3 LC) percorsi 8,15. Questi complessi possono potenzialmente essere usati come sonde di rilevamento per le proteine ​​ricche di istidina. Proteine ​​ricche di istidina e dei loro livelli di regolazione sono importanti in molte malattie, tra cui la cirrosi epatica, cancro e disordini thrombic. 18 Plasmodium falciparum istidina Rich Protein II (pfHRP-II), in particolare, è un biomarcatore ben validato per l&#39;infezione parassita della malaria. Questa proteina è 67 kDa e contiene il 34% istidina, per lo più all&#39;interno di caratteristici AHHAHHAAD ripetendo motivi 19. Queste ripetizioni istidina possono legare ioni metallici liberi 19 e 20 eme complessi nel sangue dell&#39;ospite. pfHRP-II è comunemente rilevato in ambienti con scarsa risorsa utilizzando immunocromatografici test di diagnosi rapida (RDTs), ma questi test sono spesso imprecisi a causa delle condizioni del campione, bassa concentrazione di biomarker, standard di produzione poveri e la degradazione degli anticorpi 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; sonde fosforescenti a base di metallo, come il ciclometallati Ir (III) di cui sopra sono opzioni interessanti per la rilevazione di pfHRP-II a causa della loro legame selettivo di istidina e le loro proprietà stabili e di emissione efficiente. In questo lavoro, l&#39;uso di [Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2] + (IR1) per rilevare BNT-II, un peptide mimica ramificata di pfHRP-II viene esplorata 22. Cinetica di questa interazione sono stati monitorati in tempo reale utilizzando le tecniche di interferometria biolayer. Il dosaggio è stato anche adattato per un on-tallone formato ELISA-tipo, dove sono stati raggiunti i limiti nanomolari di rilevamento. Questo test detiene vantaggi rispetto ELISA tradizionali perché può essere eseguito in meno di 2 ore con i reagenti senza anticorpi, invece del 4-5 hr e reagenti biologici richiesti con ELISA tipici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>658383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver trifluoromethanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNT-II peptide</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant HRPII</td>
			<td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td>
			<td>AGPF-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar white polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grenier black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA magnetic agarose particles</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>36111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Biotech Transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FBDLT-88</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

iridium(iii) luminescent probe for detection of the malarial protein biomarker histidine rich protein-ii

Questo lavoro descrive la sintesi di un non-emissivi, ciclometallati Ir (III), Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (IR1), che provoca una rapida, segnale fosforescenti longeva quando coordinate per un histidine- contenente proteina immobilizzata sulla superficie di una particella magnetica. Sintesi di Ir1, in alte rese, è completo O / N e prevede la separazione del genitore ciclometallati Ir (III) dimero cloro-ponte in due equivalenti del complesso solvatato. Per confermare la specificità, diversi aminoacidi sono stati sondati per l&#39;attività di coordinamento quando aggiunto alla sonda sintetizzato, e solo istidina suscitato un segnale di risposta. Utilizzando BNT-II, un peptide mimica ramificato del biomarker malarica Istidina Rich Protein II (pfHRP-II), la sonda di iridio è stata convalidata come strumento per il rilevamento HRP-II. Effetti tempra sono stati notati nella titolazione BNT-II / Ir1 rispetto alla L-istidina / Ir1, ma questi sono stati attribuiti al sterico e triPlet tempra Stato. Biolayer interferometria stata utilizzata per determinare la cinetica in tempo reale di interazione di Ir1 con BNT-II. Una volta che il sistema è stato ottimizzato, il limite di rilevazione di rcHRP-II utilizzando la sonda è risultato essere 12,8 nM in soluzione. Quando questa proteina era immobilizzato sulla superficie di una particella magnetica agarosio 50 micron, il limite di rilevazione era 14,5 nM. La risposta forte segnale di questa sonda inorganico, nonché la flessibilità di impiego in soluzione o immobilizzato su una superficie, possono prestarsi verso una varietà di applicazioni, da uso diagnostico all&#39;imaging.

Come mostrato in figura 1, la sintesi del Ir1 solvento complesso splitting coinvolto del ponte cloruro nelle dimero genitore per precipitazione del cloruro sotto forma di AgCl insolubile e associazione di molecole d&#39;acqua al centro metallico. La formazione di Ir1 stata confermata da H 1 NMR e ESI. Inoltre, le bande UV-visibile caratteristici di legante metallo trasferimento di carica e π-π transizioni * sono stati assegnati allo spettro, convalidando ulteriormente la formazione di Ir1. Questo solvatato presenta complessi nessun personaggio emissivo quando eccitato a 365 nm. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Figura 1:. Sintesi e caratterizzazione di Ir1 reazione ponte Cloruro scissione Dichlorotetrakis (2- (2-piridinil) fenil) diiridium (III) per creare il complesso aquo Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 </sub&gt; + (IR1). Dopo aggiunta di L-His al complesso aquo in tampone acquoso, il segnale luminescente è acceso. Una volta che il complesso è stato sintetizzato e caratterizzato, la selettività amminoacido è stato analizzato come descritto in precedenza utilizzando un iridio simile analogico 17. Figura 2A mostra che solo istidina suscitato una risposta segnale a 510 nm, quando eccitato a 365 nm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Figura 2: aminoacidi Selettività e titolazione di Ir1 con istidina Rich peptidi (A) Interazione di 200 micron di vari amminoacidi (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, la sua) con 50 micron. IR1 in HBS. Scansioni spettrali sono state prese 400-700 nm a una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365 nm in un nero 96 pozzetti. Segnale in unità di fluorescenza relativa (RFU) da tutti gli aminoacidi baggiunto che oltre istidina (tratteggiata traccia nera) è stato trascurabile. Le concentrazioni (B) nanomolari di BNT-II (▪) e rcHRP-II (♦) è stata titolata con Ir1 in HBS. Le ricche peptidi istidina sono state incubate con la sonda per 15 min in soluzione prima di leggere l&#39;emissione a 510 nm dopo l&#39;eccitazione con luce 365 nm. Limite di rilevazione è stato calcolato come il valore di x quando y = 3σ vuoto. Questo &quot;interruttore on-&quot; della fosforescenza della sonda di iridio si verifica perché lo stato eccitato di singoletto (1 MLCT / 1 LC) del Ir (III) Bioconjugate subisce incrocio intersistema per la tripletta stato eccitato (3 MLCT), quando istidina è coordinato al centro metallico. Questa sonda è stato applicato a BNT-II un peptide mimica del biomarcatore malaria Plasmodium falciparum istidina Rich Protein II (pf HRP-II). In una titolazione di BNT-II con Ir1, una risposta di segnale dipendente dalla concentrazione è stato osservato ( <strong&gt; Figura 2B). Ricombinante HRP-II (rcHRP-II) espone anche una risposta simile in soluzione. I limiti di rilevamento di BNT-II e rcHRP-II in soluzione erano 54.8 nm e 12,8 nM rispettivamente. Utilizzando tecniche biolayer interferometria, il K D di Ir1 legame BNT-II immobilizzato su una superficie di Ni (II) NTA è risultato essere 2,05 mM (Figura 3). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Figura 3: tempo reale Kinetic Analisi Ir1 con BNT-II Biolayer interferometria per analisi cinetica di varie concentrazioni di Ir1 vincolanti per BNT-II sulla superficie di un sensore di vetro (II) NTA Ni.. Dopo equilibrare i sensori in KB (regione A), i sensori sono caricati con 0,5 mM BNT-II (Region B). Una volta che il peptide è caricato sui sensori, una linea di base è stabilito (Region C) prima di misurare l&#39;associazione Ir1 al BNT-II (Regione D). Dopoun periodo di associazione, i sensori sono posti di nuovo in KB per misurare la dissociazione (Regione E). L&#39;intero processo di analisi cinetica richiede meno di 30 min. Durante la transizione da un saggio basato soluzione su una piattaforma particella magnetica, la complessità della particella nel sistema doveva essere preso in considerazione. Si sapeva da precedenti lavori, che queste particelle si legano in modo efficiente il pf malaria biomarcatore HRP-II. 24 tavole Fluorescent Black funzionato bene per il saggio soluzione descritto sopra, ma piatti bianchi erano più adatto per la piattaforma on-particelle di rilevamento, come si è visto in Figura 4A. In una piastra bianca, la luce viene riflessa nel campione, consentendo così di migliorare assorbanza per il Ir1 legata alla superficie della particella. Nel test on-particella, il limite di rilevazione di rcHRP-II è stato determinato in 14,5 nM (Figura 4B). Il limite di rilevazione per rcHRP-II in soluzione e-tallone erano statiscamente la stessa sulla base di un t-test non appaiati (p = 0,731). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Figura 4:. On-bead Rilevamento BNT-II e HRP-II (A) tra il segnale rilevato dal Ir1 vincolato al BNT-II sulla superficie di 50 micron Ni particelle di agarosio (II) NTA magnetici in un nero 96- pozzetti (linea continua) rispetto ad una piastra a 96 pozzetti bianco (linea tratteggiata). Le particelle erano eccitati con 365 nm di luce, e l&#39;emissione è stata misurata a 510 nm. (B) Titolazione di rcHRP-II immobilizzato sulle particelle magnetiche e rilevato utilizzando Ir1. Limite di rilevazione è stato calcolato come value di x quando y = 3σ vuoto. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Figura 5: Rappresentazione schematica del rilevamento in tallone di rcHRP-II con Ir1 schema generale di HRP-II legame alla superficie di Ni (II) NTA particelle e marcato con Ir1.. Le particelle vengono incubati con una ricca peptide istidina per 15 min. Dopo questo periodo di incubazione, le particelle vengono lavate con HBST utilizzando un magnete, per tirare le particelle dalla soluzione. Infine, le particelle di peptide legato vengono incubate con Ir1 per 1 ora prima di leggere l&#39;emissione a 510 nm dopo l&#39;eccitazione con luce 365 nm.

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IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Iridium (III) luminescente sonda per il rilevamento della proteina malarica Biomarker istidina Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

iridiumiii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein-biomarker

Research

JoVE Journal

Chemistry

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

9.0K Views.  Vanderbilt University. Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

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LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

LabVIEW a comando nanolitri osmometro Novel per le indagini Protein Ice rilegatura

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Ricerca

Chimica

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Esame quantitativa e qualitativa delle interazioni particella-particella colloidale Uso Probe Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zempl&#233;n.

Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

Sintesi di indoxyl-glicosidi per il rilevamento di glicosidasi Attività

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

Colore Spot Test come strumento presuntivo per la rilevazione rapida di Cathinones sintetico

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

Collezione di respiro dai bambini per la scoperta di Biomarker di malattia

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

Preparazione e applicazione di un nuovo biosensore batterico per il rilevamento presuntivo di residui di arma da fuoco

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...