Name: simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays at JoVE.com

The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Nota: Realizzazione del dispositivo microfluidico non è necessario per questo test, come goccioline di questo protocollo possono essere formati con i responsabili gocciolina commerciali esistenti 23,29. 1. Effettuare il Droplet formano dispositivo a microfluidi <ol><li> Preparare stampo master per i canali con il protocollo SU-8 master Fabrication delineato in precedenza 31, ma con un modello di maschera generatore gocciolina 32. </li><li> Realizzare dispositivi in PDMS utilizzando le tecniche della litografia soffice 32,33. </li></ol> 2. Preparare miscela di reazione per Bulk Droplet lettura Nota: Il protocollo può essere utilizzato per quantificare gli acidi nucleici utilizzando molti tipi di reazioni di amplificazione. Come esempio, i reagenti necessari per MDA di diverse concentrazioni di DNA Lambda sono dati. Dettagli dei reagenti sono elencati nella tabella dei reagenti specifici. La distribuzione del modello nelle goccioline dipende sufficient miscelazione del campione. <ol><li> Ottenere o polimerasi Purificare Phi29 DNA. <ol><li> Purificare Phi29 come descritto in precedenza 7, o acquistare da fornitori. Il Phi29 utilizzato per esperimenti mostrati stato purificato. </li></ol></li><li> Preparare 10 ml di denaturazione tampone, comprensivi di 65 KOH mM, 1.65 mM EDTA, e DTT 14 mm. </li><li> Preparare 10 ml di tampone di neutralizzazione, comprensivi di HCl 65 mM, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, e 9 Tris-Cl mM pH 8.0. </li><li> Preparare due standard, uno nessun controllo template (NTC), come l&#39;acqua priva di nucleasi, e una alta concentrazione di modello (circa 4 pg / ml DNA Lambda). Denaturare 3.3 ml di ogni campione con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Placare ciascuno con 3,3 ml di neutralizzazione Buffer. </li><li> Denaturare 3.3 ml di modello di interessi con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Placare con 3.3 mldi neutralizzazione Buffer. </li><li> Preparare 11 ml di miscela maestro per campione sul ghiaccio. La miscela di maestro di reazione 2x MDA è composto da 2x DNA a doppia elica (dsDNA) tintura legame, tintura di riferimento 2x qPCR, 50 micron oligo randomizzato, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 4.8 dNTP mM, acqua priva di nucleasi , e 40 mg polimerasi / ml Phi29 DNA. Aggiungere DNA polimerasi Phi29 ultimo a garantire la polimerasi non incontrare livelli di pH molto superiore o inferiore 7.5.Mix bene. </li><li> Opzionale: Per un minor numero di falsi positivi, esporre master mix con la luce UV prima di formare goccioline 34. <ol><li> Preparare 10 ml di pre-miscela per campione in 0,5 ml o 1,5 ml tubo trasparente su ghiaccio. La pre-mix è composto da 55 micron oligo randomizzato, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 5,3 mM dNTP, e l&#39;acqua priva di nucleasi. </li><li> Porre il tubo in acqua su ghiaccio, come descritto 34 ed esporre alla luce UV (254 nm) a un accuDose cumulati di 5,7 J / cm 2. </li><li> Aggiungere colorante dsDNA vincolante a 1x, riferimento tintura a 1x, e Phi29 a 40 mg / ml nel pre-miscela. Mescolare bene. </li></ol></li><li> Combina 10 ml di template denaturato o standard e di 10 ml di miscela master. Mescolare bene. </li></ol> 3. Droplet Formazione Nota: Goccioline possono essere molto sensibili all&#39;elettricità statica e sforzo di taglio. Rimuovere i vestiti che possono causare elettricità statica, e statica del corpo prima di formare goccioline. Maniglia tubi di emulsione dalla sommità del tubo, per quanto dall&#39;emulsione possibile. Emulsioni pipette molto lentamente, preferibilmente con una punta larga foro pipetta. Per la dispensazione da un puntale, vedere l&#39;emulsione sul lato della punta per determinare la velocità di pipettaggio. <ol><li> Goccioline modulo. Per gli esperimenti mostrati, il dispositivo microfluidico presenta un ingresso e due insenature olio acquose con una giunzione a flusso focalizzazione per generare goccioline. Utilizzare due SyriPompe ESN per controllare le portate di 55 ml di olio con un tensioattivo e 20 pl di miscela di reazione attraverso il chip microfluidico per generare 20.000 1 goccioline nl. </li><li> Nota: E &#39;possibile produrre goccioline con molti tipi di olio con tensioattivo, ma la composizione influisce notevolmente stabilità gocciolina a temperature elevate e nel tempo. Una combinazione possibile è olio fluorurato HFE 7500 con un tensioattivo anionico 19,35. </li><li> Produrre goccioline in qualsiasi formato con qualsiasi metodo 13,36, ma la variabilità dimensioni della popolazione gocciolina influenzerà la fluorescenza massa, e quindi la precisione del dosaggio. Per esperimenti mostrati, goccioline erano monodisperse con un volume di 1 nl. </li><li> Raccogli tutte le goccioline e olio in provette PCR. Per ciascun campione, un&#39;aliquota di 30 ml di olio in provette per PCR freschi con tappi ottici e trasferire 20 ml di goccioline sopra dell&#39;olio. I volumi consistenti assicurano il saggio è come accurare il più possibile. </li><li> Chiudi tubo tappi ermeticamente, come tappi sciolti permetterà l&#39;olio di evaporare. </li></ol> 4. isotermica Amplificazione <ol><li> Utilizzando un termociclatore PCR, qPCR termociclatore, o piastra, incubare i campioni a 30 ° C per 7 ore, e inattivare per 1 min a 75 ° C. I tubi di goccioline possono essere lasciati in frigorifero coperto con un foglio per alcune ore a questo punto. </li></ol> 5. Acquisizione dati e analisi <ol><li> Subito dopo l&#39;inattivazione reazione, misurare i livelli di fluorescenza di coloranti per tutti i campioni che utilizzano il termociclatore qPCR. Impostazioni del filtro ottimale dipenderà tintura di eccitazione e spettri di emissione. Per questo esempio, utilizzare il 492 nm-516 nm filtro impostato per la tintura dsDNA vincolante, e il filtro nm 585 nm-610 impostato per la tintura di riferimento. Altre tecniche di misura fluorescenti possono essere utilizzati per quantificare la fluorescenza. </li><li> Per ciascun campione, dividere l&#39;intensità di fluorescenza del colorante dsDNA vincolante byl&#39;intensità di fluorescenza del colorante di riferimento. Sottrarre la fluorescenza di fondo, o la fluorescenza normalizzata del controllo NTC, da tutti i campioni. </li><li> Creare una curva standard lineare utilizzando le misure di fluorescenza corrette dalle norme. Lo standard NTC rappresenta la fluorescenza per un campione con goccioline fluorescenti 0% (&quot;tutto negativo&quot;), e la misurazione di fluorescenza di alta concentrazione modello è la fluorescenza atteso per un campione con goccioline fluorescenti 100% (&quot;tutti positivi&quot;). Utilizzando la curva standard corrispondente, prevedere i rapporti intermedi di goccioline positivi e negativi in ​​base alla loro fluorescenza bulk. </li></ol> 6. Produrre Droplets per Principio Proof-of-Misure <ol><li> Fai fluorescenti (positive) le goccioline: Preparare una miscela di reazione PCR costituita da 0,1 ng DNA Lambda, colorante 1x dsDNA vincolante, colorante riferimento 1x, 1,5 unità Taq DNA polimerasi, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTP, e 0,5 mM primers. Thermocycle La miscela 30 volte (95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 1 minuto), quindi formare goccioline come descritto sopra. </li><li> Rendere non fluorescenti gocce (negativo): Preparare una miscela di reazione di PCR che consiste di colorante 1x dsDNA vincolante, tintura di riferimento 1x, 1,5 unità Taq DNA polimerasi, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTP, e 0,5 micron primer. Thermocycle La miscela 30 volte (95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 1 minuto), quindi formano goccioline. </li><li> Formare rapporti goccioline premiscelati <ol><li> Distribuire 20 ml di olio fluorurato in tubi qPCR, coprire con un cappuccio ottica per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Pipettare delicatamente 10 ml di goccioline ben mescolato in positivi desiderati: rapporti negativi sopra dell&#39;olio. Nei risultati mostrati, positivi: rapporti gocciolina negativi erano 1 (tutti positivi), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, e 0 (tutto negative). </li></ol></li><li> Misurare i livelli di colorante di fluorescenza per tutti i campioni utilizzando il termociclatore qPCR. Per questo protocollo, utilizzare il 492 nm-516 nm filtro impostato per la tintura dsDNA vincolante, e il filtro nm 585 nm-610 impostato per la tintura di riferimento. <ol><li> Normalizzare dsDNA vincolante fluorescenza colorante con riferimento colorante fluorescente. Ulteriori normalizzare la fluorescenza del &quot;tutto positivo&quot; campione. </li></ol></li><li> Creare una curva standard lineare utilizzando le misure di fluorescenza normalizzati dai &quot;tutti positivi&quot; e &quot;negativi&quot; tutti i campioni. Utilizzando la curva standard corrispondente, prevedere i rapporti intermedi di goccioline positivi e negativi in ​​base alla loro fluorescenza bulk. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento per ciascun rapporto (n = 3) con la formazione di goccioline indipendente e miscelazione per ogni replica. </li></ol> 7. La prova di principio MDA Experiment <ol><li> Misurare la concentrazione di soluzione di DNA Lambda con una specificatrophotometer. <ol><li> Calcolare la concentrazione modello necessario per medie molecole 10 template per goccia. Per questo protocollo, assumono volumi di goccioline sono 1 nl e 1 ng di DNA Lambda contiene circa 1,9 x 10 7 copie. Pertanto, 10 modelli per ogni gocciolina saranno 10 copie per nl, o 526 fg DNA Lambda per microlitri. Il modello sarà diluito ~ 6x quando si formano goccioline, quindi la concentrazione iniziale più alto modello sarà 3,2 pg / ml. </li></ol></li><li> In serie diluire il DNA Lambda di 3,2 pg / ml con tampone di denaturazione e volume uguale neutralizzazione Buffer. Per un fattore di diluizione di 0,1, unire campione di 10 microlitri con 45 ml di tampone di denaturazione e incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere 45 lL di neutralizzazione tampone per placare. </li><li> Ulteriori diluire il campione come descritto al punto 7.2 per rendere il resto dei campioni per l&#39;esperimento. Le concentrazioni modello iniziale nelle reazioni indicate erano 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3.2 fg, e 1,6 fg per microlitro. Nota: Le concentrazioni modello finali dopo mastermix Inoltre erano 526 fg, 52.6 fg, 26.3 fg, 5.26 fg, 2.63 fg, 526 ag, e 263 ag per microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 e attesi copie Lambda per gocciolina, rispettivamente. </li><li> Generare e analizzare le goccioline di ogni campione come descritto nei passaggi 2.5-5.3. </li><li> Acquisire le immagini mostrate fluorescenza (Figura 2,3) utilizzando una fotocamera digitale montata a un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 10x a temperatura ambiente. Acquisire dodici campi di vista per ogni campione. Immagini di fluorescenza Correggere un&#39;immagine di sfondo ottenuta con uno scivolo a fluorescenza. </li><li> Utilizzare una camera di contenuto per l&#39;imaging 37 come l&#39;olio di emulsione evapora rapidamente. </li><li> Analizzare singole intensità gocciolina utilizzando una macro ImageJ (file di codice supplementare). <ol><li> Scegliere un&#39;intensità di fluorescenza soglia che meglio separa le goccioline non fluorescenti in NImmagini TC delle gocce fluorescenti nelle immagini ad elevata concentrazione di template. Per ciascun campione sconosciuto, calcolare la frazione di goccioline con una intensità di fluorescenza di sopra della soglia. </li></ol></li></ol> 8. Le reazioni alla rinfusa PCR e MDA <ol><li> Preparare reazione PCR. <ol><li> Serialmente diluire DNA templato con un fattore di diluizione di 0,1. Per ogni diluizione, unire 10 ml di modello con 45 ml di tampone di denaturazione e incubare a temperatura ambiente per 3 min. Unire la diluizione con 45 ml di neutralizzazione Buffer. </li><li> Preparare 20 ml di PCR mastermix per campione. La miscela di reazione maestro 1.1x PCR è costituito da 60 unità / microlitri DNA polimerasi Taq, 11 mm Tris-HCl, 55mm KCl, 1.65 mM MgCl 2, 0,22 mM dNTP, tintura, 1.1x tintura di riferimento, e 550 nm 1.1x dsDNA vincolante ogni primer. </li><li> Unire 2 ml di modelli diluiti e 20 ml di Mastermix. Nota: Le concentrazioni del modello finale in tegli Pcr reazioni mostrate erano 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, e 0 g di DNA lambda per microlitro, e sono stati eseguiti in triplicato. </li><li> Reazione Thermocycle PCR in macchina qPCR con il seguente programma. Eseguire 40 cicli di 95 ° C per 30 sec, 57 ° C per 20 sec, 72 ° C per 30 sec prima 2 min a 72 ° C per 2 min e mantenimento a 4 ° C. </li><li> Normalizzare dsDNA legame colorante fluorescente con colorante fluorescente di riferimento prima di ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Preparare reazione MDA. <ol><li> Diluire i campioni come descritto al punto 8.1.1. </li><li> Preparare 11 ml di miscela maestro per campione sul ghiaccio. La miscela di maestro di reazione 2x MDA si compone di tintura 2x dsDNA vincolante, tintura di riferimento 2x, 50 micron oligo randomizzato, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 4.8 dNTP mM, acqua priva di nucleasi, e 40 mg / ml Phi29 polimerasi del DNA. </li><li> Aggiungere la DNA polimerasi Phi29 a 40 mcg / ml durare per garantire la polimerasi dOES non incontrare livelli di pH molto superiore o inferiore a 7,5. Mescolare bene. </li><li> Denaturare 3.3 ml di modello diluito con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere 3.3 ml di neutralizzazione Buffer. </li><li> Combinare 10 ml di modello denaturato e 10 ml di miscela master. Mescolare bene. </li><li> Eseguire reazione MDA in macchina qPCR con il seguente programma. </li><li> Tenere a 30 ° C per 4 ore, misurare la fluorescenza ogni 7,5 min. </li><li> Inattivare a 75 ° C per 1 min. </li><li> Normalizzare dsDNA vincolante fluorescenza colorante con riferimento colorante fluorescente. Ulteriori normalizzare per la fluorescenza massima per ogni campione. </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

Saggi digitali sono potenti metodi che consentono il rilevamento di cellule rare e conteggio dei singoli di molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali non sono ancora applicati routinariamente nei laboratori di analisi, in parte a causa del costo di attrezzature specializzate associati ai metodi disponibili in commercio. Qui si descrive un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura analogico semplificata utilizzando un real-time quantitativa macchina PCR standard. Questo met...

Saggi digitali per la quantificazione degli acidi nucleici (PCR digitale) 1-4 e la base ordine (sequencing) sono fortemente incidono le scienze della vita e la medicina. Saggi digitali forniscono quantificazione dei conteggi molecolari su scala assoluta (non relativo a un controllo), fornendo l&#39;alta sensibilità, consentendo facili confronti di tutti gli esperimenti, e, soprattutto, permette la costruzione di grandi banche dati contenenti dati comparabili 5 (Tabella 1). Negli ultimi 15 anni, tutto l&#39;amplificazione del genoma (WGA) è emersa accanto PCR come uno strumento generale per l&#39;amplificazione degli acidi nucleici. Come PCR, WGA è utile per le applicazioni analitiche e preparative amplificando elementi minuto di campionamento fino a un livello che può essere facilmente individuata o utilizzati per le successive analisi, come il sequenziamento di base. A differenza di PCR, WGA non è specifico per un particolare locus DNA, piuttosto che permette l&#39;amplificazione di tutte le sequenze del campione, tra le sequenze sconosciute.Questa differenza fondamentale tra PCR e WGA rende i metodi complementari tra loro e dà luogo a diversi problemi nella loro applicazione. L&#39;alto rendimento di reazioni WGA 6 consente l&#39;amplificazione di routine di DNA genomico da molecole singole 7, celle singole 8 e altri campioni a bassa biomassa 9 per la quantificazione e ulteriori analisi. Le sfide principali associate alla WGA chimica sono la sua estrema sensibilità ai contaminanti e l&#39;amplificazione irregolare attraverso singole molecole modello 6. Tuttavia, WGA sta guadagnando popolarità come il sequenziamento di singole cellule è emerso come il &quot;killer application&quot; della tecnologia WGA 10, e il modello di quantificazione da WGA è importante in molti campi di applicazione 7. Strumentazione per il digitale quantificazione di acidi nucleici è stata precedentemente descritta in una varietà di con valvola e senza valvole forma microfluidicats 11-14, tra saggi basati gocciolina-15,16 (Tabella 2). Tuttavia, i sistemi microfluidici commerciali per l&#39;analisi digitale richiedono attrezzature specializzate per la configurazione di reazione e la rilevazione dei prodotti 17. Microfluidica personalizzati valvolati sono flessibili, ma richiedono precisione microfabbricazione e sistemi di controllo pneumatici 18. Mentre è relativamente semplice da fare monodisperse micro-goccioline di emulsione a base-saggi digitali 19,20, lettura digitale è tecnicamente gravoso, che richiede sia su larga scala di immagini a grande campo (simile alle famose tecnologie di sequenziamento di prossima generazione) o 21,22 ad alta velocità del flusso basato sul rilevamento delle gocce 23-25. Idealmente, un saggio digitale sarebbe semplice dal set-up di lettura, riducendo la necessità di strumentazione complessa e consentendo un gran numero di campioni da leggere rapidamente. Qui si descrive un metodo semplificato per la lettura dei saggi goccioline digitali che utilizza un convenzionale PCR in tempo reale iNstrument per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-. Mentre il nuovo approccio può essere applicato a PCR digitali, è particolarmente vantaggioso per le analisi WGA digitali che analogici dosaggi di amplificazione in tempo reale (che danno risultati eccellenti per PCR) sono problematici. WGA è comunemente applicato a campioni con molecole modello eterogenee in sequenza, lunghezza, e il contenuto di base. Queste diverse molecole modello vengono amplificati a tassi differenti 6, rendendo necessario l&#39;uso di un riferimento (&quot;standard&quot;) campione con caratteristiche corrispondenti. Spesso, tale standard è disponibile, o le caratteristiche dei campioni in ingresso sono sconosciute. L&#39;eterogeneità del materiale in ingresso e la proprietà lunghezza-dipendente delle farmacie WGA 26 inoltre complicare l&#39;interpretazione dei risultati creando ambiguità quanto viene quantificato - la massa di ingresso, il numero di molecole di ingresso, una combinazione dei due, o nessuno. Finalmente, la sequenza non specificità rende quantitativo spostamento amplificazione multipla (MDA) più sensibili alla contaminazione di PCR quantitativa in quanto le molecole contaminanti di qualsiasi sequenza hanno un potenziale di interferire. Saggi digitali microfluidica affrontare la contaminazione separando le molecole di modello e di ridurre i volumi di reazione in modo tale che un minor numero di agenti inquinanti vengono campionati. Qui usiamo un popolare metodo di WGA isotermico, MDA 27. Da segnalare, diversi altri chimiche WGA tra cui PicoPlex e MALBAC 28 dipendono in modo cruciale passi iniziali di spostamento isotermico filo. Passi isotermici aggravano la sfida di applicare analisi real-time quantitativa analogici per WGA. WGA può essere né impossibilitato durante l&#39;installazione, con conseguente indesiderato variabile pre-amplificazione, né discretizzato (&quot;ciclato&quot;) in un modo in cui la replica di molecole eterogenee può essere guidato a completamento e fermato prima del ciclo successivo come PCR 11 </sup&gt; (Figura 1). Un formato digitale per test WGA accoglie tipiche procedure di impostazione reazione dovuta alla segregazione di ogni molecola per il conteggio a livello di endpoint del test (in modo pre-amplificazione non influenza il risultato) di lettura originale significa accuratezza sarebbe in gran parte indipendente di variazione in termini di efficienza di amplificazione. Il dosaggio dipende goccioline nell&#39;olio con volumi uniformi, come il livello del segnale per droplet alla endpoint dosaggio dipenderà dal volume delle gocce, e non vogliamo la coerenza dei risultati dipendono da una media attraverso una distribuzione di dimensioni delle gocce. Fare goccioline monodisperse ora è una procedura standard (circa 3.500 documenti gocciolina monodisperse sono stati pubblicati dal 2013), ma richiede strumentazione microfluidica 25. In realtà, più di sei aziende hanno sviluppato prodotti commerciali indipendenti che si basano sulla produzione di tali goccioline, e chip microfluidici-gocciolina fare sonocommercialmente disponibile 23,29. Per questo studio, abbiamo utilizzato dispositivi microfluidici personalizzato autoprodotti (vedi Protocol). Siringa Pompe per guidare il flusso attraverso i dispositivi sono anche disponibili in commercio, ma in alternativa, può essere sostituito con una singola siringa monouso per flusso guidato-vuoto per ridurre i costi 30.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Dye</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>Heated to 50 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C and quenched on ice prior to dilution</td></tr><tr><td>Randomized MDA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-NNNNN*N-3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&amp;rsquo; and 5&amp;rsquo;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>UltraPure Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)</td></tr><tr><td>ROX reference dye</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR optical strip caps</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (25 micromolar each)</td><td>Agilent Technologies</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Barrier pipette tips</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad oil for evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Saggi digitali sono potenti metodi che permettono il rilevamento di cellule rare e il conteggio delle singole molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali sono ancora abitualmente applicata, a causa del costo e attrezzature specifiche associati ai metodi disponibili in commercio. Qui vi presentiamo un metodo semplificato per la lettura di saggi gocciolina digitali utilizzando uno strumento di PCR in tempo reale convenzionale per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-. Abbiamo caratterizzare le prestazioni del test lettura bulk utilizzando miscele gocciolina sintetici e digitale dosaggio gocciolina multiple displacement amplification (MDA). Quantitative MDA particolare beneficia di un formato di reazione digitale, ma il nostro nuovo metodo si applica a qualsiasi dosaggio digitale. Per i protocolli di analisi digitali affermati come la PCR digitale, questo metodo serve ad accelerare e semplificare test di lettura. La nostra metodologia di massa lettura porta i vantaggi di partitionesaggi d senza la necessità di strumentazione lettura specializzata. I principali limiti del metodo di lettura bulk sono ridotte gamma dinamica rispetto piattaforme gocciolina di conteggio e la necessità di un campione standard, anche se i requisiti di questo standard sono meno rigorosi per un esperimento in tempo reale convenzionale. Quantitative intero amplificazione del genoma (WGA) viene utilizzato per verificare contaminanti nei reazioni WGA ed è il modo più sensibile per rilevare la presenza di frammenti di DNA con sequenze sconosciute, dando il metodo grande promessa in diverse aree applicative, tra cui il controllo farmaceutico di qualità e astrobiologia.

Mentre letture di massa convenzionale / in tempo reale possono essere utilizzati sia per la PCR quantitativa e saggi WGA quantitativi (figura 1), analisi quantitative digitali forniscono vantaggi (Tabella 1). Nel metodo descritto, andremo a leggere saggi digitali in formato micro-goccia con una semplice misura endpoint bulk (Figura 2). Anche se questo metodo è ampiamente applicabile, ci si concentra sulla quantitativa WGA (MDA) perché questo metodo presenta sfide part...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in potentially heterogeneous specimens. Nucleic acids can be detected via several established approaches, including analytical methods that are spectrophotometric (e.g., A260), fluorometric (e.g., binding of fluorescent dyes), or colorimetric (nucleoside-specific chromogenic chemical reactions).1 Though it cannot readily distinguish RNA from DNA, the A260/A280 ratio is commonly employed, as it offers a simple and rapid2 assessment of the relative content of nucleic acid, which absorbs predominantly near 260 nm and protein, which absorbs primarily near 280 nm. Ratios &lt; 0.8 are taken as indicative of 'pure' protein specimens, while pure nucleic acid (NA) is characterized by ratios &gt; 1.53.
However, there are scenarios in which the protein/NA content cannot be as clearly or reliably inferred from simple uv-vis spectrophotometric measurements. For instance, (i) samples may contain one or more proteins which are relatively devoid of the aromatic amino acids responsible for absorption at &asymp;280 nm (Trp, Tyr, Phe), as is the case with some small RNA-binding proteins, and (ii) samples can exhibit intermediate A260/A280 ratios (~0.8 &lt; ~1.5), where the protein/NA content is far less clear and may even reflect some high-affinity association between the protein and NA components. For such scenarios, we describe herein a suite of colorimetric assays to rapidly distinguish RNA, DNA, and reducing sugars in a potentially mixed sample of biomolecules. The methods rely on the differential sensitivity of pentoses and other carbohydrates to Benedict's, Bial's (orcinol), and Dische's (diphenylamine) reagents; the streamlined protocols can be completed in a matter of minutes, without any additional steps of having to isolate the components. The assays can be performed in parallel to differentiate between RNA and DNA, as well as indicate the presence of free reducing sugars such as glucose, fructose, and ribose (Figure 1).

A suite of colorimetric assays is described for rapidly distinguishing protein, RNA, DNA, and reducing sugars in potentially heterogeneous biomolecular samples.

Rapid test colorimetrici per distinguere qualitativamente RNA e del DNA nei campioni Biomolecolari

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

Ricerca

Chimica

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Genetica

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioingegneria

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Biologia

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo standardizzato per la quantificazione del genoma virale mediante PCR digitale con goccioline

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of AAV genome copy number in vector preparations is essential for bioprocess optimization and dosage calculation in both preclinical and clinical studies of AAV-based gene therapy products. Currently, a consensus protocol for AAV viral genome titration is lacking. Here, we present a digital droplet PCR (dd_PCR) protocol for the quantification of viral genomes in purified vector samples. Samples are treated with DNase I to eliminate unpackaged contaminant DNA. DNase-treated samples are then mixed with an appropriate primer-probe set (designed according to the target AAV genome) and PCR reagents, and then loaded into a droplet generator. The prepared droplets are transferred into a PCR plate, where PCR amplification is performed and analyzed. The viral genome titer is calculated based on the concentration (copies/&#181;L), accounting for sample dilutions. A successful measurement shows a clear separation of the positive and negative droplet clouds, has at least 10,000 accepted droplets, shows a value between 10 copies/&#181;L and 10,000 copies/&#181;L, and has a coefficient of variation (CV) between repeats lower than 20%. Reliable viral genome titration will aid in the development of safe and effective AAV-based gene therapy products.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ottimizzazione del metodo PCR digitale con goccioline per un'accurata quantificazione del genoma virale adeno-associato

Precise quantification of adeno-associated virus (AAV) vector genome copies is critical, but a standardized protocol has yet to be established. This protocol describes a validated method for preparing purified AAV samples and conducting digital droplet polymerase chain reaction (dd_PCR) to reliably quantify the viral genome titer.

Quantificazione dei genomi virali adeno-associati in campioni di vettori purificati mediante reazione a catena della polimerasi a goccioline digitali

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 water-in-oil droplets, and the PCR occurs in the individual droplets. The dd-PCR has several advantages over conventional real-time qPCR, including increased accuracy in detecting low-abundance targets, omitting reference genes for quantification, eliminating technical replicates for samples, and showing high resilience to inhibitors in the samples. Recently, dd-PCR has become one of the most popular methods for accurately quantifying target DNA or RNA for gene expression analysis and diagnostics. Circular RNAs (circRNAs) are a large family of recently discovered covalently closed RNA molecules lacking 5' and 3' ends. They have been shown to regulate gene expression by acting as sponges for RNA-binding proteins and microRNAs. Furthermore, circRNAs are secreted into body fluids, and their resistance to exonucleases makes them serve as biomarkers for disease diagnosis. This article aims to show how to perform divergent primer design, RNA extraction, cDNA synthesis, and dd-PCR analysis to accurately quantify specific circular RNA (circRNA) levels in cells. In conclusion, we demonstrate the precise quantification of circRNAs using dd-PCR.

This protocol describes the detailed method of digital droplet PCR (dd-PCR) for precise quantification of circular RNA (circRNA) levels in cells using divergent primers.

Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

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NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Quantificazione dei genomi virali adeno-associati in campioni di vettori purificati mediante reazione a catena della polimerasi a goccioline digitali

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