dd-PCR è un metodo altamente sensibile e accurato per la quantificazione assoluta del DNA o RNA bersaglio. È stato utilizzato per la diagnosi di malattie in cui altri metodi convenzionali non riescono a dare risultati accurati. dd-PCR è la tecnica più sensibile per rilevare molecole di acido nucleico molto basse e abbondanti.
A differenza della PCR quantitativa, la dd-PCR non richiede alcun controllo genico per la quantificazione. Grazie alla sua sensibilità e accuratezza, la dd-PCR può essere utilizzata come strumento per la diagnostica molecolare e la ricerca che coinvolge molecole di RNA a bassa abbondanza come micro RNA e RNA circolari. Prima di utilizzare dd-PCR, si dovrebbe eseguire RT-PCR o RT-qPCR per confermare che i primer stanno amplificando i loro geni bersaglio senza alcuna amplificazione PCR non specifica.
Per iniziare, preparare una sequenza modello di PCR di 200 nucleotidi di lunghezza unendo gli ultimi 100 nucleotidi della lunghezza totale della sequenza di RNA circolare ai primi 100 nucleotidi della sequenza di RNA circolare. Utilizzare la sequenza di modelli per primer, progettata dallo strumento web Primer 3. Prendi un piatto di 10 centimetri contenente circa 5 milioni di cellule di mioblasti C2C12 proliferanti e un miotubo C2C12 differenziato di quattro giorni per l'isolamento dell'RNA.
Lavare le celle con 10 millilitri di 1X PBS tre volte e scartare il PBS usando una pipetta. Aggiungere un millilitro di reagente di isolamento dell'RNA e lisare le cellule mediante pipettaggio vigoroso. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio e vortice per 15 secondi.
Centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 12.000 G.Prendere 400 microlitri dello strato acquoso superiore, caricarlo su una colonna di silice e centrifugare per un minuto a 12.000 G a temperatura ambiente. Prendi il flusso attraverso un nuovo tubo e aggiungi 600 microlitri di etanolo al 100%. Aggiungere 20 microlitri di perle di silice magnetica e posizionare il tubo su un termomixer, impostato a 25 gradi Celsius e 1.200 RPM per cinque minuti.
Quindi, posizionare il tubo su un supporto magnetico per 30 secondi o fino a quando la soluzione diventa chiara. Risospendere le sfere di silice magnetica in 500 microlitri di tampone di lavaggio contenente il 90% di etanolo. Dopo aver posizionato il tubo sul supporto magnetico per 30 secondi, lasciare che le perline si depositino verso il magnete e scartare il tampone usando una pipetta.
Asciugare all'aria il tubo a 50 gradi Celsius per tre minuti su un termomiscelatore, mantenendo il coperchio aperto. Aggiungere 20 microlitri di acqua priva di nucleasi e risospendere le perle. Raccogliere l'RNA disciolto in una nuova provetta per la valutazione della quantità e della qualità utilizzando uno spettrofotometro.
Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e prendere un microgrammo di RNA per la sintesi del cDNA. Mescolare un microgrammo di RNA totale con un microlitro di miscela dNTP, quattro microlitri di tampone 5X di trascrittasi inversa, due microlitri di primer casuale 10X trascrittasi inversa, 0,25 microlitri di enzima trascrittasi inversa e 0,5 microlitri di inibitore della RNasi. Portare il volume a 20 microlitri utilizzando acqua priva di nucleasi.
Posizionare il tubo a 25 gradi Celsius per 10 minuti, seguito da 50 gradi Celsius per un'ora. Quindi posizionare il tubo a 85 gradi Celsius per cinque minuti per inattivare l'enzima. Impostare la reazione PCR di 22 microlitri in provette o strisce PCR da 0,2 millilitri, insieme a un tubo di controllo negativo e tubi di controllo non modello.
Aggiungere 11 microlitri di miscela master dd-PCR, 5,5 microlitri di miscela di primer circolare RNA-specifica per avanti e inverso di una concentrazione micromolare e 5,5 microlitri di acqua priva di nucleasi per impostare i tubi di reazione NTC. Allo stesso modo, per impostare le provette di reazione, aggiungere 11 microlitri di miscela master dd-PCR, 5,5 microlitri di miscela di primer circolare specifica per RNA diretta e inversa di una concentrazione micromolare e 5,5 microlitri di cDNA. Per la generazione di gocce, trasferire 20 microlitri della miscela PCR da provette PCR da 0,2 millilitri ai pozzetti del campione della cartuccia del generatore di gocce.
Aggiungere 70 microlitri di olio per la generazione di goccioline ai pozzetti dell'olio della cartuccia del generatore di goccioline con attenzione, utilizzando una pipetta. Coprire la cartuccia del generatore di gocce con una guarnizione di gomma e posizionarla nella macchina del generatore di gocce per ottenere la miscela di gocce d'olio campione, generata nei pozzetti delle gocce della cartuccia. Per l'amplificazione PCR, trasferire 40 microlitri della miscela di gocce d'olio campione dai pozzetti delle goccioline della cartuccia del generatore di gocce a una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta.
Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti con il sigillante in alluminio. Posizionarlo nel blocco macchina sigillatrice a piastre, preriscaldato a 180 gradi Celsius, e fare clic sul sigillo per sigillare la piastra PCR. Quindi, posizionare la piastra nel termociclatore dd-PCR e impostare la temperatura del coperchio su 105 gradi Celsius e una velocità di rampa su due gradi Celsius al secondo.
Una volta terminata la PCR, posizionare la piastra sulla macchina contagocce dd-PCR con il supporto della piastra nella posizione corretta per il conteggio delle goccioline. Aprire il software di analisi delle gocce e impostare l'esecuzione fornendo l'input delle informazioni di esempio. Fare clic sul pulsante Analizza per analizzare i dati dopo il completamento della lettura del droplet.
Quindi, fai clic sul pulsante Ampiezza 1D per visualizzare le goccioline positive e negative. Per separare le goccioline positive dalle goccioline negative, inserire una linea di soglia comune per tutti i campioni con lo stesso target. Fare clic sul pulsante di esportazione per esportare i dati circolari RNA conteggia come file csv.
I dati esportati mostrano il numero di RNA circolari presenti in ciascun campione. Calcolare manualmente il numero di RNA circolari in ciascun campione per nanogrammo di RNA considerando la quantità totale di cDNA utilizzata in ciascuna reazione. L'analisi dei dati con il software QuantaSoft è mostrata qui.
Tutti i campioni tranne MT1 hanno mostrato più di 12.000 conteggi di goccioline. Poiché il conteggio totale delle goccioline era basso in MT1, questo campione non è stato considerato per l'analisi finale dei dati. È interessante notare che c'era una chiara differenza nel modello di espressione di Circ B e C2 nella condizione differenziata del miotubo a quattro giorni rispetto alle cellule dei mioblasti.
L'analisi dell'abbondanza di Circ B e C2 in termini di numero di copie, ha indicato che le tre repliche dei mioblasti C2C12 avevano 76,8, 67 e 46 copie per nanogrammo di RNA, mentre i due campioni di miotubo avevano 558 e 610 copie per nanogrammo di RNA. I dati nel grafico a barre rappresentano la deviazione standard media più meno di due o tre repliche biologiche. ddPCR è uno dei metodi più avanzati per misurare l'accurata espressione differenziale dell'RNA circolare bersaglio.
Questo metodo sarà uno strumento essenziale per accelerare la ricerca sull'RNA circolare e le industrie diagnostiche nel prossimo anno.
