Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Science Foundation sovvenzione MCB-0718846 e della Difesa Advanced Research Projects Agency Contratto N66001-12-C-4020 (per JDB). LAM è stato finanziato da una borsa di studio post-dottorato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada. La pubblicazione di questo articolo è sponsorizzato da Roche.

1. Preparare lievito DNA genomico (gDNA) <ol><li> Preparare uno stock di lievito Lysis Buffer 9 contenente 50 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Come iniziare Uso dei materiali ~ 2 x 10 6 cellule, che corrisponde in genere a ~ 100 ml di cultura satura per i ceppi di laboratorio del 10 BY4741 sfondo. Cellule coltivate devono essere raccolte mediante centrifugazione a 1000 xg per 3 min a temperatura ambiente in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungere 200 ml di lievito Lysis Buffer e risospendere il pellet cellulare pipettando. </li><li> Aggiungere ~ 300 microlitri di acido lavato perle di vetro tale che il livello di perline è di circa 1 mm al di sotto del livello della sospensione cellulare. </li><li> In una cappa aspirante aggiungere 200 ml di fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (25: 24: 1). Tappare la provetta per microcentrifuga e accertarsi che non perle sono bloccati tra il tappo e il tubo come questo si tradurrà in perdite durante l&#39;agitazione(Passo 1.6). Invertire 3 volte per mescolare e verificare il tappo è sigillata. </li><li> Agitare la provetta per 10 min a temperatura ambiente utilizzando un mixer da banco come un Eppendorf 5432. </li><li> Centrifugare a 20.800 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Trasferimento 75 ml di fase acquosa in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 1 ml di etanolo al 100%. Invertire 10 volte per mescolare. </li><li> Pellet il DNA mediante centrifugazione a 20.800 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, senza staccare il pellet di DNA. Lavare il pellet con 500 ml di etanolo al 70%. </li><li> Centrifugare a 20.800 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, senza staccare il pellet di DNA e aria asciugare il pellet con il tappo microcentrifuga aperto fino eccesso di etanolo evaporato, che di solito è di circa 10 min. </li><li> Risospendere il pellet di DNA in 75 ml di 10mM Tris pH 7.4 e agitare per miscelare. Conservare il campione a -20 ° C tempo indeterminato. Misurare la concentrazione di DNA nel campione utilizzando unBenchtop fluorimetro quali qubit, che distingue DNA da RNA. Assicurarsi che la concentrazione finale di gDNA è ~ 1-2 ng / ml. </li><li> Preparare una diluizione 1:10 di DNA genomico con acqua e agitare per miscelare. </li><li> Aliquotare 30 ml di gDNA diluito nel pozzetto di una piastra appropriata fonte che è compatibile con un dosatore acustica nanoscala (passaggio 3). Se si utilizza un Labcyte Echo 550, utilizzare una piastra in polipropilene 384 bene (targa 384PP). NOTA: quando sigillato appropriatamente questo piatto può essere conservato per almeno un mese a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparare ed erogazione qPCR Master Mix in un piatto multiwell 1.536 <ol><li> Preparare 850 ml di qPCR master mix, come LightCycler 1536 DNA Verde Maestro, in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e agitare per miscelare. Centrifugare il master mix qPCR per 2 min a 20.800 xg a temperatura ambiente per eliminare eventuali bolle. I componenti della miscela master qPCR richiesto per una singola 1.536 piastra multipozzetto sono come seguonos: <ol><li> Combina 170 ml di master mix enzima (metropolitana di Green Master 1, 5x concentrato), 42,5 ml di SYBR (Verde Maestro Provetta 4, 20x concentrata) e 637,5 ml di acqua. </li></ol></li><li> Dispensare 500 nl / bene in un piatto di 1.536 pozzetti utilizzando un distributore di rinfuse liquide, come l&#39;Arte Robbins Cobra. (Si noti che i passaggi 2.2.1-2.2.4 si riferiscono specificamente al Cobra.) <ol><li> Creare un programma di erogazione con le seguenti impostazioni: classe liquido, acqua; il volume aspirato, 800 ml; erogare il volume, 500 nl; lavare il tempo, 20 sec. Nelle impostazioni di erogazione, verificare la velocità di erogazione è impostato al 49,6 mm / sec, l&#39;offset di erogazione è di 0,25 mm, liquido aspirato eccesso verrà erogata indietro nella fonte bene. </li><li> Posizionare il tubo microcentrifuga contenente la master mix qPCR in pozzetto A1 del titolare provetta per microcentrifuga, che si trova in posizione di ponte 1. Tagliare il tappo della provetta per microcentrifuga o semplicemente lasciarla aperta. Impostare il &#39;Aspirare bene&#39; per A1 modificando il AspiratImpostazioni e. </li><li> Eseguire una fase di lavaggio prima di erogare qPCR master mix per primo de-selezionando l&#39;aspirare e dispensare fasi del programma creato nel passo 2.2.2 e premendo &#39;run&#39;. Una volta completato, riselezionare la aspirare e dispensare passaggi prima di eseguire il programma completo per erogare qPCR master mix. Se il Cobra è stato inattivo per meno di 10 minuti la fase iniziale di lavaggio, che serve per innescare il sistema, non è necessaria. </li><li> Hit &#39;run&#39; di dispensare qPCR Master Mix per ogni bene. </li></ol></li><li> Raccogliere il master mix qPCR in fondo a ogni bene da breve centrifugazione del 1536 piastra di pozzetti (30 sec con una bassa velocità PCR piatto ogiva). </li></ol> 3. Dispensare Template DNA e Primer nel 1.536 pozzetti Piastra <ol><li> Erogare 5 nl di gDNA diluito (passo 1.3) nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto 1536 utilizzando un sistema di trasferimento di liquido acustico, come l&#39;Echo 550. <ol><li> Per il Echo 550, utilizzare il software Piastra Reformat o, in alternativa fornire un foglio di calcolo Excel personalizzato per programmare il trasferimento. Assicurarsi che la sorgente selezionata bene per il gDNA nel programma corrisponde alla fonte ben in cui si è fisicamente erogato il gDNA (passo 1,3). Scegliere la targhetta fonte &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, che indica il liquido nella piastra 384PP è un buffer senza tensioattivi. </li></ol></li><li> Erogare 10 nl di primer, pre-miscelati in avanti e inversa ad una concentrazione finale di 50 mM ciascuno, nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto 1536 utilizzando un sistema di trasferimento di liquido acustico, come l&#39;Eco 550. <ol><li> Per il sistema di trasferimento di liquido, utilizzare il software Piastra Reformat o, in alternativa fornire un foglio di calcolo Excel personalizzato per programmare il trasferimento. NOTA: Qui è possibile erogare primers tale che il layout sulla piastra multipozzetto 1.536 corrisponde all&#39;ordine cromosomico dei primer per cui è facile per ispezionare visivamente i risultati in tempo reale PCRsuccessivamente (fase 6). </li><li> Premiscelare i primer in una piastra che è compatibile con l&#39;erogatore liquido acustica. Per l&#39;Eco 550, utilizzare una piastra Labcyte 384LDV (volume morto) e scegliere il tipo di piatto di origine &#39;384LDV_AQ_B&#39; durante la programmazione l&#39;Eco per indicare il liquido è un semplice tampone senza proteine. </li></ol></li></ol> 4. Seal e Centrifuga 1536 pozzetti Piastra <ol><li> Utilizzando un sistema sigillante micropiastre come il Plateloc Microplate Sealer termica, sigillare immediatamente la piastra multipozzetto 1.536 utilizzando otticamente chiaro sigillo che è compatibile con lo strumento termosaldatrice. Non toccare la superficie della guarnizione per evitare delle macchie. <ol><li> Se si utilizza il Plateloc termica Microplate Sealer, utilizzare le seguenti impostazioni: sigillare tempo 2,0 sec, temperatura di saldatura 162 ° C, la pressione dell&#39;aria 82 psi. Questo strumento prende ~ 5 min a scaldarsi e quindi deve essere attivata in anticipo. </li><li> Se si utilizza il Plateloc micropiastre termico sigillante, un adapter deve essere utilizzato per aumentare l&#39;altezza del 1536 piastra multipozzetto sulla scena dello strumento per garantire una buona tenuta. NOTA: Anche se è preferibile acquistare un piattello per il Plateloc micropiastre termico sigillante, una soluzione alternativa è quella di inserire quattro ~ 2 mm di spessore rondelle standard disponibili in qualsiasi negozio di ferramenta negli angoli per aumentare l&#39;altezza della piastra pozzetti 1.536. </li></ol></li><li> Centrifugare immediatamente la piastra multipozzetto sigillato 1.536 a 2.000 xg per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere tutti i reagenti sul fondo di ciascun pozzetto. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Programma uno strumento 1.536 qPCR, come il LightCycler 1536, con un protocollo di amplificazione due fasi seguita da una analisi della curva di fusione. Utilizzando il software LightCycler 1.536 istituito un programma come segue: <ol><li> Pre-incubazione: 95 ° C, 1 min di attesa, velocità di rampa 4,8 ° C / sec, nessun acquisto. </li><li> Two Step Amplificazione: 30 cicli di [95 ° C, nessuna attesa,rampa tasso 4,8 ° C / sec, nessuna acquisizione; 64 ° C, 30 sec attesa, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, singola acquisizione]. </li><li> Melt curva: 95 ° C, 10 sec, velocità di rampa 4,8 ° C / sec, nessuna acquisizione; 60 ° C, 1 min, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, senza acquisizione; 97 ° C, velocità di rampa di 0,1 ° C / sec, 5 acquisizioni / ° C (continuo). </li><li> Raffreddare: 40 ° C, 30 sec, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, senza acquisizione. </li></ol></li><li> Impostare il formato di rilevamento di &#39;Green intercalando Dye&#39; nella scheda Run Definizione. </li><li> Impostare il controllo di pipettaggio di &#39;Master Control&#39; nella scheda Run Definizione. Questa funzione serve come controllo interno e rileva la presenza di qPCR master mix in ciascun pozzetto della piastra multipozzetto 1.536, che è utile identificare putativi falsi negativi. </li><li> Inserire la piastra di 1.536 pozzetti preparato in passi 2-4 nello strumento 1.536 qPCR ed eseguire il programma. </li></ol> Analisi 6. Dati <ol><li> Perform ispezione visiva dei dati all&#39;interno del software qPCR. NOTA: Il software 1.536 permette la visualizzazione sia amplificazione e fondere curve, così come una mappa di calore che mostra la chiamata (positivo, negativo, non valida, N / A, figura 2), il valore del punto di attraversamento (scorrevole scala colori per positiva o grigio per negativo; Figura 3), o una fluorescenza endpoint (EPF) valore (scalare colore). </li><li> Esportare dati dal software 1.536 sotto forma di un file txt (tabella dei risultati) o un file .xml sia con i dati grezzi o dati calcolati per l&#39;elaborazione offline dallo strumento. NOTA: Il proprietario punto di attraversamento automatizzato (Cp) algoritmo chiamando integrato nel software 1.536 prende in considerazione la forma e la pendenza della curva di amplificazione durante la determinazione / chiamate valore negativo e Cp positive con fiducia alta, a volumi di reazione microlitro basso sub con relativamente basso valori di fluorescenza. </li><li> Se il DNA LightCycler Verde Maestro era usod per qPCR, verificare che tutti i pozzetti superato il &#39;controllo master&#39;. Un fail indica il bene non ha ricevuto qPCR master mix e il punto di dati mancanti dovrebbe essere considerata un potenziale falso negativo. Verificare che tutti i pozzetti superato il &#39;controllo master&#39;. Un fail indica il bene non ha ricevuto Mastermix DNA e considerare il punto di dati mancanti un potenziale falso negativo. </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, JAM e JDB hanno nulla da rivelare. RC e AL sono impiegati da Roche Life Science, Stati Uniti e ha lavorato sullo sviluppo della applicazione con LAM come parte di una prova di principio dell&#39;esperimento.

Incorporazione di tempo reale di rilevamento PCR nel test di genotipizzazione PCRTag è uno sviluppo importante per il progetto Sc2.0 in quanto consente un throughput significativamente più alto. Il flusso di lavoro precedente specificato di 2,5 microlitri reazioni in 384 piatti ben PCR, 1,5 ore di runtime cicli termici, elettroforesi gel, e annotazione manuale del gel. Il flusso di lavoro qui presentato, chiamata analisi qPCRTag, supera diversi grandi colli di bottiglia. In primo luogo, una corsa qPCRTag condensa 4 x 384 pozzetti in un singolo esperimento che può essere elaborato, dall&#39;inizio alla fine (targa impostare più il tempo di esecuzione), in circa un&#39;ora. E &#39;significativo notare che il costo dei reagenti per pozzetto per l&#39;analisi qPCRTag è alla pari con l&#39;approccio basato gel agarosio rendimento inferiore. Tuttavia, eludendo elettroforesi su gel e annotazione manuale, il flusso di lavoro qPCRTag permette notevoli risparmi di tempo e manodopera, che sono i principali vantaggi. È importante sottolineare che il flusso di lavoro qPCRTag è enramente compatibile con l&#39;automazione. Una preoccupazione principale con l&#39;uso della rilevazione in tempo reale come uscita del test PCRTag è il tasso di falsi positivi e falsi negativi. Poiché i primers PCRTag non sono stati originariamente progettati per l&#39;utilizzo in tempo reale PCR, si prevede che non tutte le coppie di primer sarà appropriato per l&#39;uso con questa uscita. A tal fine è importante per convalidare la funzione e la specificità di tutte le coppie di primer PCRTag escludere il sottoinsieme che non funzionano nel reale test basato sul tempo davanti. Per esempio, cromosoma 3 PCRTag falsi positivi e negativi sono by-e-grandi riproducibile in tempo reale di dati PCR (figure 2 e 3), e questi possono essere esclusi da ulteriori analisi. Inoltre, coppie di primer noti per fallire (valutato mediante elettroforesi su gel e riportati nelle figure S6 e S7 di Annaluru et al. 1) può anche essere esclusa. Questo è facilmente realizzabile semplicemente excluding le coppie di primer difettosi durante la configurazione del protocollo di trasferimento acustico. Come la maggior parte saggi ad alto rendimento, abbiamo intenzione di utilizzare il rilevamento PCRTag tempo reale come schermo primario per identificare trasformanti che meritano ulteriore convalida valle. Successivamente, il gold standard per lo screening secondario rimarrà analisi PCRTag con elettroforesi su gel come la lettura. Al di là l&#39;applicazione dell&#39;analisi PCRTag per Sc2.0, combinando sistemi di manipolazione su scala nanometrica liquido state-of-the-art, con un throughput elevato tempo reale tecnologia PCR consente analisi rapide e automatizzato e ha il potenziale per influenzare molti campi. Ad esempio, questo flusso di lavoro potrebbe essere applicata ad alto throughput screening biblioteca, la diagnosi delle malattie infettive, l&#39;analisi microbioma e all&#39;avanguardia di editing genoma approcci di tentare di modificare simultaneamente loci multipli.

Sc2.0, o il Progetto Genoma lievito sintetico ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), ha fissato l&#39;obiettivo di progettare e costruire un genoma eucariote completamente sintetico. Utilizzando la sequenza del genoma estremamente curata di Saccharomyces cerevisiae 3 come punto di partenza, ciascuno dei cromosomi lineari sedici è stato ri-progettato per soddisfare una serie di principi di progettazione che specificano mantenersi in forma delle cellule, migliorando la stabilità del genoma, e aumentando la flessibilità genetica. Ad esempio, gli elementi destabilizzanti come ripetizioni vengono cancellati dal cromosomi Sc2.0. Tutte le istanze di codoni di stop TAG sono ri-codificati per TAA a &#39;liberare&#39; un codone nel ceppo finale per l&#39;introduzione di un amminoacido non geneticamente codificato. Inoltre un sistema di evoluzione inducibile, Scramble, consentito dal sistema Cre-lox, permette la capacità senza precedenti di generare genomi derivati ​​con nuove strutture 4. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Un altro importante elemento di design nel genoma Sc2.0 è l&#39;introduzione di PCRTags, che servono come filigrane DNA per attivare il rilevamento di sintetico e selvaggio tipo DNA. PCRTags sono brevi segmenti ri-codificati in ORF sui cromosomi sintetici; mentre le sequenze PCRTag differiscono a livello di DNA tra i cromosomi tipo sintetico e selvatici, le proteine ​​codificate sono identici in sequenza aminoacidica e, quindi, presumibilmente, funzione. Sequenze PCRTag sono specificamente progettati come Primer siti di legame per facilitare l&#39;amplificazione selettiva (Figura 1A). Disegno PCRTag viene effettuata utilizzando l&#39;algoritmo &#39;più diversa&#39; in GeneDesign 5,6, cedevole ricodificati sequenze sintetiche che sono tipicamente ~ 60% diversa dalle sequenze native (minimo 33%) con temperature di fusione tra 58 ° C e 60 ° C e amplicon lunghezze tra 200-500 coppie di basi 2. Ricodifica non è consentito ai primi 100 bp di ciascuna ORF, come queste regioni sono noti perhanno preferenze particolari in termini di utilizzo codone 7. Insieme, queste regole di progettazione favoriscono alte prestazioni di quasi tutti i PCRTags sotto un unico insieme di condizioni di PCR quale tipo PCRTag coppie di primer di sintesi e selvaggi legano esclusivamente e amplificano DNA sintetico e nativo, rispettivamente (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figura 1:. PCRTag schema (A) PCRTags sono sequenze all&#39;interno di lettura aperta (ORF) dei geni sui cromosomi Sc2.0 ri-codificati. (B) sintetico (SYN) e wild type (WT) primer PCRTag legano esclusivamente e amplificano tipo sintetico e selvaggio DNA genomico (gDNA), rispettivamente. Qui è l&#39;analisi di un segmento ~ 30 kb del braccio sinistro del cromosoma sei, prova tredici PCRTag coppie di primer utilizzando sia WT o semi-synVIL2 gDNA come modello. In molti casi un singolo ORF codifica più PCRTag. Presenza / assenza di ampliconi PCRTag viene valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Ampliconi PCRTag variano nel formato da 200 bp a 500 bp. Le specie più veloce migrano nella parte inferiore dei pannelli sono dimeri di primer. Analisi PCRTag ha dimostrato di essere uno strumento importante per l&#39;assemblaggio di cromosomi Sc2.0. In un tipico esperimento 30-50 kb di DNA sintetico, che codifica 20-30 PCRTags, si trasforma in cellule di lievito per sostituire il corrispondente tipo selvaggio 1,2,8 DNA. Analisi PCRTag viene poi utilizzato per identificare trasformanti che codificano PCRTags sintetici ma non selvaggio di tipo abbracciano quel segmento di DNA, o cosiddetti &quot;vincenti&quot;. Di solito è necessario testare più trasformanti per identificare &quot;vincitori&quot;, così la produttività e costi di analisi PCRTag sono considerazioni importanti. Attualmente due cromosomi Sc2.0 sono stati completati (synIII 1 e synIXR 2), che rappresentano meno del 10% del genoma Sc2.0, although più della metà dei rimanenti cromosomi sono attualmente in fase di sintesi e l&#39;assemblaggio. La scala di analisi PCRTag necessaria per questo progetto sta rapidamente superando la possibilità di eseguire i gel e manualmente segnare la presenza di DNA sintetico e l&#39;assenza di selvaggio tipo DNA. Per migliorare il throughput del test PCRTag abbiamo sviluppato un flusso di lavoro mediante PCR in tempo reale per aggirare l&#39;uso di gel di agarosio. Il flusso di lavoro si avvale di un distributore di rinfuse liquide distribuire qPCR mastermix in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 1.536, un distributore di liquido acustico nanoscala per trasferire DNA stampo e primer, e un termociclatore 1.536 qPCR, che ci permette di miniaturizzare le reazioni di 500 nl e massimizzare il throughput. Inoltre l&#39;analisi può essere automatizzata. Questo tipo di protocollo di genotipizzazione high throughput dovrebbe essere generalizzabili a qualsiasi progetto che richiede analisi di molti cloni di loci multipli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

Il Progetto Genoma lievito sintetico (Sc2.0) mira a costruire 16 cromosomi del lievito di design e riunire in un&#39;unica cellula di lievito. Ad oggi un cromosoma sintetico, synIII 1, e un braccio cromosoma sintetico, synIXR 2, sono stati costruiti e la loro funzione in vivo convalidato in assenza della corrispondente specie selvatiche cromosomi. Una caratteristica importante disegno di cromosomi Sc2.0 è l&#39;introduzione di PCRTags, che sono brevi sequenze ri-codificato all&#39;interno di lettura aperta (ORF) che consentono la differenziazione dei cromosomi sintetici dai loro omologhi di tipo selvatico. PCRTag primers ricottura selettivamente per entrambi i cromosomi di tipo sintetiche o selvatici e la presenza / assenza di ogni tipo di DNA può essere verificato utilizzando un semplice test PCR. La lettura standard del dosaggio PCRTag è valutare la presenza / assenza di ampliconi mediante elettroforesi su gel di agarosio. Tuttavia, con una densità media PCRTag amplicone di uno per 1.5 kb e agenome dimensione del ~ 12 Mb, il genoma Sc2.0 completato codificherà circa 8.000 PCRTags. Per migliorare il throughput, abbiamo sviluppato un saggio di rilevamento basato su PCR in tempo reale per PCRTag genotipizzazione che chiamiamo analisi qPCRTag. Il flusso di lavoro specifica di 500 reazioni nl in un piatto multipozzetto 1.536, che ci permette di testare fino a 768 PCRTags con entrambe le coppie di primer tipo sintetico e selvatici in un singolo esperimento.

Abbiamo testato sintetico e selvaggio tipo cromosoma 3 PCRTag coppie di primer 1 con il lievito DNA genomico (gDNA) estratto da quattro diversi ceppi. Cromosoma 3 ha 186 PCRTag coppie di primer che si estendono la lunghezza del cromosoma (synIII è ~ 270 kb e selvaggio tipo cromosomiche 3 è ~ 315 kb). Per testare ciascuno dei quattro ceppi con entrambe le serie di primer, abbiamo diviso la piastra multipozzetto in quattro quadranti, uno per ogni tipo di gDNA, assegnando primers sintetici PCRTag alla metà superiore di ogni quadrante e tipo selvaggio per la metà inferiore. Il DNA genomico è stato estratto dai ceppi di lievito, due dei quali codificano wild type cromosoma 3 (wild type, synIXR 2), mentre i restanti due codifica cromosoma sintetico 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR master mix è stato erogato in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 1.536 con un dosatore di massa, seguito da gDNA e PCRTag primer utilizzando le Echo 550. primer sono stati schierati in modo identicoogni quadrante della piastra di pozzetti per un facile confronto visivo. La piastra pozzetti è stato poi termosaldato con guarnizione otticamente chiaro e sottoposto ad real time PCR. In questo esperimento qPCRTag abbiamo osservato, per la maggior parte, di amplificazione come previsto, per cui primers sintetici esclusivamente amplificate DNA sintetico e viceversa (figure 2 e 3). Tuttavia, abbiamo anche osservato diverse deviazioni dal modello previsto, suggerendo falsi negativi e falsi positivi nel dataset. In questo esperimento, la centralina è stata rilevata nel 100% dei pozzi, indicando il dosatore bulk erogato successo mastermix in ogni pozzetto della piastra (dati non mostrati). Questo esclude un potenziale fonte di falsi negativi. Inoltre, alcuni dei cromosomi 3 PCRTags sono noti a fallire (indicato nelle figure S6 e S7 di Annaluru et al. 1), di cui almeno 2 SYN e 1 WTcoppie di primer; quindi questi pozzi possono essere ignorati in ogni quadrante. Veri falsi negativi potrebbero derivare da una mancanza di trasferimento di template gDNA o primer, però nella nostra esperienza, data la corretta taratura della Echo 550, così come la preparazione di gDNA e primer come descritto, questo non è stato un importante fonte di errore. Nel complesso in questo esperimento il tasso di falsi negativi è stato estremamente basso per primer WT con modello WT (~ 2%), anche se leggermente superiore per i primer SYN con SYN DNA (~ 8%). I falsi positivi, il rilevamento di segnali in pozzi dove primers SYN sono mescolati con WT gDNA (e viceversa), possono derivare da amplificazione croce o dimeri di primer. Infatti, dimeri di primer sono spesso visibili mediante elettroforesi su gel (Figura 1B) e rappresentano una fonte di errore ragionevole. Per l&#39;applicazione della qPCR, l&#39;esame delle curve di fusione può essere utile per determinare se diverse specie, come dimeri di primer, possono contribuire a un segnale. Inoltre, performing un esperimento di controllo per cui primer sono dispensati in assenza del DNA stampo può aiutare a identificare primer con una propensione a dimerize. Amplificazione trasversale può essere osservata mediante elettroforesi su gel, in particolare se troppi cicli di PCR vengono eseguite o se la temperatura di ricottura è troppo bassa. Si è cercato di ridurre il numero di falsi positivi dovuta all&#39;amplificazione croce ottimizzando entrambi questi parametri per il protocollo qPCRTag. Infine, esaminando i valori valico (Cp) per ciascun bene può aiutare a identificare primer che non sono adatti al rilevamento basato su tempo reale (figura 3, per esempio, BB22, FB22, BB46, Fb46). Nel complesso in questo esperimento il tasso di falsi positivi è stato basso per primer SYN con modello WT (~ 5%) e superiore per primer WT con template SYN (~ 10%). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figura 2: Piastra mappa di calore visualizzazione presenza / abinvito indicationi per un esperimento qPCRTag. Quattro diversi tipi di DNA genomico (quadranti separati da linee bianche solide) sono stati sottoposti ad analisi PCRTag usando sintetica (SYN) e wild type (WT) cromosoma 3 primer PCRTag (tratteggiate linee bianche per separare SYN (top ) e WT (inferiore) in ogni quadrante). WT e synIXR gDNA codificano selvaggio tipo cromosoma 3, cedendo l&#39;amplificazione con primer WT PCRTag. SynIII e synIII synIXR gDNA codificano cromosoma sintetico 3, cedendo l&#39;amplificazione con primer SYN PCRTag. Primer sono disposte in base al loro posizionamento cromosomica da sinistra a destra e posizionate in modo identico nei quattro quadranti per il confronto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figura 3: di calore a piastremappa mostrando valico (Cp) valore per un esperimento qPCRTag. Questo è lo stesso insieme di dati, come in figura 2 e il layout di piastra è quindi identica. N / A si riferisce a &#39;nessuna amplificazione&#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analisi dell&#39;espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-throughput per l&#39;analisi Saccarificazione materiali lignocellulosici

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

A PCR-based metodo di genotipizzazione di distinguere tra le varietà selvatiche di tipo ornamentale e di Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un saggio di legame High Throughput MHC II per l&#39;analisi quantitativa dei peptidi epitopi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...