Gli autori desiderano ringraziare il sostegno della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF -NRFF2011-01 e NRF2015NRF-POC0001-19), il Consiglio Nazionale delle Ricerche Medical (NMRC / CBRG / 0005/2012), e Nanyang Technological University di NJC

1. Formazione di Supportato doppio strato lipidico su un supporto solido idrofilo <ol><li> Preparare le soluzioni di lipidi azionari di 10 mg / ml di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) e 1 mg / ml di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamina rodamina B sulfonile) (Rh-PE) sciogliendo rispettive polveri lipidi (opportunamente pesati preventivamente con bilancio di massa analitico) in soluzione isopropanolo. </li><li> Diluire e mescolare le soluzioni madre in isopropanolo al fine di preparare la miscela lipidica desiderata alla concentrazione finale. Per microscopia a fluorescenza e FRAP esperimenti, 0,5 wt% Rh-PE dovrebbe essere incluso nella miscela lipidica. </li><li> Iniettare la miscela lipidica in isopropanolo nel canale microfluidico fino a riempirlo. </li><li> Incubare la miscela lipidico sulla superficie del vetro per circa 10 min. </li><li> Gradualmente sostituire la soluzione lipidica con acqua o soluzione tampone con una pompa peristaltica ad una portata molto bassa(10-50 ml / min). In alternativa, sostituire la miscela lipidica pipettando ripetuta. </li><li> Risciacquare il canale accuratamente con tampone in eccesso al fine di rimuovere l&#39;isopropanolo residuo. </li></ol> 2. La formazione di membrane supportate colesterolo arricchita Nota: La superficie solida (SiO 2) supporta la fusione delle vescicole, ma la composizione della membrana (colesterolo alto) inibisce la fusione delle vescicole perché vescicole colesterolo alto hanno arricchito la piegatura di rigidità 30. <ol><li> Preparare una soluzione madre contenente 10 mg / ml DOPC lipidi, 10 mg / ml di colesterolo, e 1 mg / ml Rh-PE dapprima sciogliendo le rispettive polveri in isopropanolo. </li><li> Ripetere i passaggi 1,2-1,6 utilizzando le soluzioni madre previste al punto 2.1. </li></ol> 3. fluidità di membrana Assay <ol><li> Immergere il vetrino in una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) (1%) per 10 min. </li><li> Lavare i vetrini con acqua deionizzata e risciacquare ingegnoh etanolo. </li><li> Blow-secco diapositive utilizzando una leggera corrente di azoto. </li><li> Esporre i vetrini a plasma di ossigeno per 30 sec alla massima potenza a radiofrequenza nella camera di plasma di ossigeno. </li><li> Rimuovere lo strato protettivo del fondo commerciale camera di microfluidica (Figura 1A), utilizzando una pinzetta e fissare il vetrino sul lato adesivo della camera (Figura 1B). </li><li> Assemblare i connettori e tubi nelle posizioni di ingresso e uscita della camera e posizionare il canale microfluidico sul palco microscopio (Figura 1C). </li><li> Formare un doppio strato lipidico fluorescenza marcata supportato nel canale microfluidico [ripetere il passaggio 1 utilizzando la composizione lipidica desiderata (ad esempio, 0,5 mg / ml DOPC) compresa 0,5 wt% Rh-PE in solvente organico]. </li><li> Individuare il piano doppio strato con un obiettivo ad immersione 60X (NA 1.49) al fine di catturare le immagini. </li><li> Prendete due immagini pre-candeggina, poi foto-candeggina 301; m di larghezza punto circolare con un raggio laser mW 532 nm, 100. Prima photobleaching, scaldare il laser fino a quando la sua intensità è diventato stabile. Subito dopo photobleaching, catturare una serie di immagini ogni 1 sec per 2 min per seguire la ripresa in intensità di fluorescenza nel punto sbiancato. </li></ol> 4. Colesterolo Quantificazione Assay <ol><li> Esporre il cristallo di quarzo chip del sensore biossido di silicio rivestito al plasma di ossigeno per 30 sec alla massima potenza a radiofrequenza nella camera di plasma di ossigeno. Rimuovere il chip dalla camera e immediatamente montare il chip nella camera di misura. </li><li> Prima esperimento, prima acquisire la frequenza e la dissipazione del chip sensore in aria al fine di garantire un montaggio corretto. <ol><li> Per lo strumento Q-Sense E1 o E4 QCM-D commerciale, eseguire il software Q-Soft e fare clic su &quot;Acquisizione&quot; e selezionare &quot;Setup di misura&quot;. </li><li> Nella nuova finestra che appare, controlla il 3, 5, 7, 9, 11 e 13 toni e quindi scegliere Trova ed eseguire al fine di verificare gli spettri di risonanza. Impostare la temperatura a 24 ° C. Se una o più frequenze di risonanza non sono d&#39;accordo con i valori attesi, controllare il chip di montaggio e ri-eseguire questo passaggio fino al raggiungimento di un accordo. </li></ol></li><li> Avviare la pompa peristaltica e portata della soluzione tampone (10 mM Tris, NaCl 150 mM, pH 7,5) nella camera di misura ad una portata di 100 l / min. </li><li> Nel programma software, fare clic &quot;Acquisizione&quot; e selezionare &quot;Restart di misura&quot; al fine di registrare i segnali di dissipazione di frequenza di risonanza e di energia. Ripetere questa operazione fino ad ottenere una linea di base stabile per gli spostamenti di frequenza e di dissipazione. Nota: Per i passaggi di seguito, ci sarà di frequenza e dissipazione turni aggiuntivi che possono essere registrati in funzione del tempo. </li><li> Iniettare isopropanolo (senza lipidi) per 10 minuti. </li><li> Iniettare la miscela di DOPC lipidi / colesterolo alrapporto molare desiderato con una concentrazione di lipidi totale di 0,5 mg / ml in isopropanolo per 10 min. </li><li> Iniettare buffer per 20 min ad una portata di 100 l / min. </li><li> Iniettare una soluzione di 1-metil mM β-ciclodestrina (MβCD) preparato in tampone (portata 100 l / min) fino a quando il segnale di frequenza raggiunge un valore stabile. </li><li> Misurare i relativi spostamenti di frequenza positivo che è causato dalla fase di trattamento MβCD e calcolare la massa dei lipidi e del colesterolo DOPC convertendo i valori Af cho e Af DOPC ai valori di massa utilizzando l&#39;equazione di Sauerbrey [Δm = - (C / n) × Af, dove C = 17,7 ng / cm 2, n: armonico]. </li><li> Calcolare la frazione molare di colesterolo nel SLB, tenendo conto dei pesi molecolari di DOPC lipidi (786,1 g / mol) e colesterolo (386.6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

In questo lavoro, un protocollo solvente cambio è presentato in cui lipidi in alcool (isopropanolo, etanolo, o n-propanolo) vengono incubati con un supporto solido e quindi l&#39;alcool viene sostituito gradualmente, con una soluzione tampone acquosa al fine di guidare una serie delle transizioni di fase alla fine la produzione di lamellare trifase doppi strati lipidici 24. E &#39;dimostrato che il metodo consente la produzione di bistrati lipidici supportati su superfici quali oro, che è intrattabile al metodo fusione delle vescicole. Un intervallo di concentrazione lipidica ottimale (0,1 - 0,5 mg / ml) è stato determinato per la formazione completa in doppio strato formati sperimentali serie testati finora. A concentrazioni di lipidi di sotto di 0,1 mg / ml, discreti, macchie microscopiche di doppi strati formata. D&#39;altra parte, a concentrazioni superiori a 0,1 mg / ml e inferiore a 0,5 mg / ml, un doppio strato completo ed uniforme è formato. A concentrazioni lipidiche sopra di questo range, un doppio strato liquido era ancora formato come verificato mediante analisi FRAP, tuttavia, microscopia a fluorescenza rivela la presenza di strutture lipidiche aggiuntivi superiore del doppio strato. Sorprendentemente, la morfologia di queste strutture lipidiche supplementari, come determinato mediante analisi QCM-D, dipendeva l&#39;alcool che è stato utilizzato durante la fase di incubazione. Nel caso dell&#39;etanolo, relativamente elevate Δ turni F e D Δ assomigliano alla firma QCM-D ottenuto per uno strato vescicole adsorbito. Quando è stato invece utilizzato isopropanolo o n-propanolo, il Δ f era leggermente superiore al valore previsto per un doppio strato (finale Δ f tra -30 a -40 Hz), mentre il Δ D era sensibilmente superiore. Tali risposte QCM-D sono attese per strutture lipidiche estesi (ad esempio, micelle vermiformi) sporgenti verso l&#39;esterno dalla superficie della membrana (come visibile al microscopio a fluorescenza in alcuni casi). Il tasso di cambio solvente è un altro parametro importante, che può essere critico, especbuona resa quando si utilizzano concentrazioni di lipidi inferiore (ad esempio, 0,1 mg / ml). Rapido scambio solvente bassa concentrazione di lipidi può portare alla formazione di doppi strati incompleti. Nella camera di misura standard utilizzato per le misure QCM-D in questo documento (Q-Sense E4 camera di misura), portata di circa 100 ml / min, sono adatti per la formazione di doppio strato altamente riproducibile completa. Per celle di flusso con altre geometrie e di volume, la portata ottimale può variare e deve essere determinato empiricamente sulla base dei passi suggeriti qui. Oltre a formare bistrati lipidici supportati su superfici intrattabile a fusione della vescicola, il SALB può essere impiegato per aggirare la necessità di vescicole lipidiche che possono rompersi, aprendo così la porta alla fabbricazione di membrane supportate con composizioni complesse. Come esempio illustrativo composizione, sono stati esaminati miscele lipidiche con un&#39;elevata frazione di colesterolo. Il colesterolo è una componente importante di mammalian membrane cellulari, e la sua frazione possono avvicinarsi 45-50 moli% della composizione dei lipidi di membrana (ad esempio, negli eritrociti). Così, anche un semplice modello di un doppio strato lipidico che rappresenta una membrana cellulare umana dovrebbe includere colesterolo. Mentre vescicole fusione potrebbe essere usato per fabbricare bistrati lipidici fluidici contenenti solo il 10-15% di colesterolo, il metodo consente SALB formazione di bistrati lipidici fluidici contenenti elevate frazioni di colesterolo (fino a 57% in moli, come quantificato mediante misure QCM-D) 36. Tuttavia, quando il livello di colesterolo è ulteriormente elevata (fino a 63% in moli), domini striati figura 37 sono stati osservati. I domini coesistenti erano liquido, ricordano quelli osservati nella regione β nel diagramma di fase del colesterolo / fosfolipidi monostrato all&#39;interfaccia aria-acqua. In generale, il metodo SALB è dimostrato di essere un metodo semplice ed efficace per formare bistrati lipidici supportati, in particolare in casi al di là del campo di applicazione del metodo di fusione delle vescicole convenzionale. Finora, la tecnica e la microscopia a fluorescenza QCM-D sono stati utilizzati principalmente per caratterizzare i doppi strati lipidici supportati formati con il metodo SALB. Guardando al futuro, una vasta gamma di misure analitiche tecniche di superficie sensibile, tra cui risonanza plasmonica di superficie (SPR) 38, microscopia a forza atomica (AFM) 39,40, trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa 41, a raggi X 42 e neutroni riflettività 43 può, essere utilizzato per caratterizzare ulteriormente e studiare configurazioni semplici e complesse doppio strato preparano con il metodo SALB. Queste capacità emergenti aprono la porta ad un maggior numero di scienziati che possono esplorare le membrane cellulari artificiali, approfittando di un protocollo sperimentale semplice e robusto.

Il solido supportato doppio strato lipidico 1 (SLB) è una piattaforma versatile che conserva le caratteristiche di base di biomembrane quali lo spessore doppio strato, bidimensionale diffusività lipidi, e la possibilità di ospitare biomolecole associate alla membrana. A causa della complessità delle membrane cellulari naturali, questa semplice piattaforma ha dimostrato di funzionare come una piattaforma efficiente per studi in vitro di processi a membrana correlati come la formazione zattera 2, proteina legante 3, virus e particelle simili a virus di legame 4,5 , e la segnalazione a 6 celle. Formata in prossimità di un supporto solido, la piattaforma SLB è compatibile con una serie di misure tecniche di superficie sensibile come la microscopia a riflessione interna totale (TIRF), cristallo di quarzo microbilancia-dissipazione (QCM-D), e spettroscopia di impedenza. Diversi metodi sono stati sviluppati per la produzione di diversi tipi di SLB, compreso bolla d&#39;ariacrollo 7 e dip-pen nanolitografia 8 per macchie di lipidi submicron dimensioni,-spin coating 9 per gli stack doppio strato e Langmuir-Blodgett (LB) 10 e la fusione delle vescicole (VF) 11 per full-spanning, rivestimenti singolo doppio strato lipidico. Il metodo consiste VF dell&#39;adsorbimento di piccole vescicole unilamellari ad un supporto solido e la successiva rottura spontanea e fusione per formare un doppio strato lipidico continuo. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, rottura delle vescicole spontanea è limitata principalmente ai materiali a base di silicio, quali biossido di silicio, vetro, e mica. Inoltre, la rottura delle vescicole non avviene spontaneamente per vescicole lipidiche di composizioni complesse come quelle contenenti alte frazioni di colesterolo o lipidi carichi negativamente. A seconda del sistema, la rottura delle vescicole può essere indotta da ulteriormente adattando le condizioni sperimentali quali temperatura 12, soluzione pH 13, e 14 salinità, shock osmotico 15 </sup&gt; o di pressione 16, o l&#39;aggiunta di ioni bivalenti come Ca2 + 17. In alternativa, la membrana attiva AH peptide può essere introdotto per destabilizzare uno strato di vescicole adsorbite, che porta alla rottura della vescicola e formazione bistrato su una serie di superfici 18-22. Inoltre, la formazione di doppio strato di successo richiede la preparazione di una popolazione ben controllata di piccole vescicole unilamellari che può richiedere molto tempo e difficile da realizzare per certe composizioni membrana. Pertanto, nonostante la sua elevata efficienza in casi ottimali (ad esempio, dopo ampia congelamento-scongelamento pretrattamento di vescicole 23), l&#39;applicazione generale fusione della vescicola è limitata dalla portata di substrati adatti e composizioni membrana. Il metodo 24-28 assistita solvente doppio strato lipidico (SALB) è una tecnica di fabbricazione alternativa che non richiede vescicole lipidiche. Il metodo si basa sulla deposizione omolecole lipidiche f SU UN superficie solida, in presenza di un solvente organico miscibile acqua seguita da graduale scambio di questo solvente con una soluzione tampone acquoso al fine di innescare la formazione di SLB. Durante la fase solvente di cambio, la miscela ternaria di lipidi, solvente organico e acqua subisce una transizione di fase serie con crescente frazione acquosa, che porta alla formazione di strutture lamellari di fase nella soluzione di massa e una SLB sul substrato solido. È importante sottolineare che questo percorso autoassemblaggio bypassa la necessità per la rottura delle vescicole, che è di solito il fattore limitante per la trasformazione di vescicole adsorbite in un SLB. Il protocollo è applicabile ad un&#39;ampia varietà di superfici e biossido di silicio, ossido di alluminio, cromo, ossido di indio-stagno, e oro. In questo documento e nel video allegato, un confronto tra la deposizione di lipidi dal SALB e metodi vescicole fusione è presentato. In particolare, l&#39;influenza dei parametri sperimentali, compresa la concentrazione di lipidi, Portata, e la scelta del solvente organico miscibile in acqua, sulla qualità del doppio strato costituito dal metodo SALB sono discussi. Caratterizzazione analitica dei fabbricati SLB è eseguita dal QCM-D, microscopia a fluorescenza, e recupero di fluorescenza dopo photobleaching tecniche (FRAP). Monitoraggio QCM-D è una tecnica di misurazione massa superficiale-sensibile, che, dal momento che il lavoro pionieristico svolto da Keller e Kasemo 29, è stato ampiamente utilizzato per studiare quantitativamente formazione doppio strato. Microscopia a fluorescenza permette l&#39;ispezione della membrana omogeneità e la visualizzazione dei domini di membrana. La tecnica FRAP è uno strumento standard per determinare la mobilità laterale di molecole lipidiche in una SLB, che è una proprietà essenziale delle membrane fluidici. La prima parte di questo studio prevede l&#39;analisi QCM-D del SALB e metodi di fusione delle vescicole applicata per tentare formazione doppio strato di diossido di silicio e oro. Nella seconda parte,preparazione e caratterizzazione di membrane supportate contenenti una gamma di concentrazioni di colesterolo con il metodo SALB sono dimostrati ei risultati sono confrontati con quelli ottenuti con il metodo di fusione delle vescicole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

Al fine di simulare le membrane delle cellule, il doppio strato lipidico supportato (SLB) è una piattaforma interessante che permette nelle indagini vitro dei processi a membrana legati mentre conferendo biocompatibilità e biofunzionalità a substrati solidi. L&#39;adsorbimento spontanea e la rottura di vescicole fosfolipidiche è il metodo più comunemente utilizzato per formare SLB. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, la fusione delle vescicole (VF) è limitato ad un solo sottoinsieme di composizioni lipidiche e supporti solidi. Qui, si descrive una procedura generale a fase unica definito il metodo di formazione assistita solvente doppio strato lipidico (SALB) per formare SLB che non richiede vescicole. Il metodo SALB comporta la deposizione di molecole lipidiche su una superficie solida, in presenza di solventi organici miscibili con acqua (ad esempio, isopropanolo) e successiva solventi scambio con soluzione tampone acquosa al fine di innescare la formazione di SLB. La fase solvente scambio continuo consente l&#39;applicazione dellaMetodo in una configurazione a flusso adatto per la formazione di monitoraggio doppio strato e successive modifiche utilizzando una vasta gamma di biosensori superficie sensibile. Il metodo può essere usato SALB per fabbricare SLB su un&#39;ampia gamma di superfici solide idrofili, compresi quelli che sono intrattabili di fusione della vescicola. Inoltre, consente la fabbricazione di SLB composto da composizioni lipidiche, che non possono essere preparate con il metodo fusione delle vescicole. Qui, mettiamo a confronto i risultati ottenuti con i metodi di fusione delle vescicole SALB e convenzionali su due superfici idrofile illustrativo, biossido di silicio e oro. Per ottimizzare le condizioni sperimentali per la preparazione di bistrati alta qualità preparati tramite il metodo SALB, l&#39;effetto di vari parametri, tra cui il tipo di solvente organico nella fase di deposizione, il tasso di cambio solvente e la concentrazione di lipidi è discusso con risoluzione dei problemi . La formazione di membrane supportate contenenti elevate frazioni di colesterolo è anche demonitrattato con il metodo SALB, evidenziando le capacità tecniche della tecnica SALB per una vasta gamma di configurazioni di membrana.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Presentiamo un protocollo sperimentale per formare un doppio strato lipidico supportato su substrati solidi senza utilizzare vescicole lipidiche. Si dimostra un metodo di uno stadio per formare un doppio strato lipidico di diossido di silicio e oro così come membrane supportate con dominio colesterolo arricchita per varie applicazioni biologiche.

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.6K Views.  Nanyang Technological University.  Presentiamo un protocollo sperimentale per formare un doppio strato lipidico supportato su substrati solidi senza utilizzare vescicole lipidiche. Si dimostra un metodo di uno stadio per formare un doppio strato lipidico di diossido di silicio e oro così come membrane supportate con dominio colesterolo arricchita per varie applicazioni biologiche. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

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Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimerici Microneedle Array Fabrication per Fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Un metodo semplice e scalabile di fabbricazione per dispositivi elettronici organici sui tessili

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Fabbricazione di scaffold decellularizzati matrice della cartilagine-derivato

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...