Le membrane cellulari sono molto affollate a causa della presenza di proteine e zuccheri incorporati. Dimostriamo l'imaging di singole molecole su doppi strati lipidici sintetici affollati supportati. Questa piattaforma è utile per studiare l'effetto dell'affollamento sulle reazioni biomolecolari di membrana, a livello molecolare.
Il protocollo spiega l'analisi del legame, della diffusione e dell'assemblaggio di biomolecole di membrana. Il successo dell'esperimento dipende da una pulizia rigorosa del substrato, evitando danni al doppio strato e mantenendo un elevato rapporto segnale/rumore nell'imaging a singola molecola. A dimostrare la procedura con me ci sono Aditya Upasani e Vishwesh Haricharan Rai, studenti laureati del laboratorio.
Iniziare posizionando il vetrino acrilico trattato al plasma su carta velina pulita. Staccare il nastro biadesivo tagliato al laser e incollarlo al vetrino. Utilizzando una punta per pipetta, appiattire il nastro per evitare perdite da un canale all'altro.
Chiudere la camera posizionando il vetrino di copertura trattato al plasma sul vetrino nastrato. Utilizzando una punta per pipetta, premere delicatamente la linguetta di copertura sulle regioni con nastro adesivo per rendere il canale impermeabile. Se si utilizzano vetrini sigillare i bordi con resina epossidica.
Conservare le camere di imaging microfluidico preparate per una o due settimane in condizioni essiccate. Prendere una fiala di vetro pre-pulita con la soluzione di Piranha e aggiungere la soluzione di cloroformio di POPC e DOPE-PEG (2000) alla frazione mole desiderata di lipidi PEG 2000 per ottenere la concentrazione lipidica finale di tre millimolari, dopo aver aggiunto il tampone. Allo stesso modo possono essere preparate altre composizioni di membrana di lipidi.
Quindi, asciugare il cloroformio dalla fiala usando un leggero flusso di azoto con un piccolo vortice in modo che i lipidi desiderati siano uniformemente rivestiti sulla superficie del flaconcino. Rimuovere il cloroformio residuo mantenendo il flaconcino in un essiccatore sottovuoto per un'ora. Quindi aggiungere un millilitro di PBS alla fiala e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione durante la notte, vortice delicatamente il flaconcino per uno o due minuti fino a quando la soluzione diventa torbida e lattiginosa. Ora trasferisci 100 microlitri di questa soluzione in una piccola provetta da centrifuga da 500 microlitri. Per generare piccole vescicole unilamellari da 50 a 100 nanometri di diametro sonicare la soluzione per circa un'ora in un sonicatore da bagno.
Alla fine della sonicazione la soluzione diventerà chiara, se la soluzione è ancora torbida, sonicare per altri 30 minuti. Quindi aggiungere cloruro di calcio alle vescicole sonicate ad una concentrazione finale di 30 millimolari nella soluzione lipidica. Tagliare una punta di micro pipetta per iniettare la soluzione campione in modo che si adatti perfettamente al foro.
Mescolare la soluzione lipidica e iniettarla attraverso uno dei fori nella camera di imaging. Pulire la soluzione in eccesso che esce dalla camera dall'uscita con tessuto pulito per prevenire la contaminazione dei canali adiacenti. Preparare una camera umidificante posizionando un fazzoletto bagnato all'estremità di una provetta da centrifuga da 50 millilitri.
Posizionare la slitta nel tubo e chiudere il tappo del tubo. Posare il tubo lateralmente e lasciare questo gruppo in una camera umidificata per 90 minuti, preferibilmente in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Lavare accuratamente la camera con una quantità abbondante di tampone PBS, evitando che bolle d'aria entrino nella camera durante il lavaggio, poiché ciò può generare difetti nella membrana.
Prima di condurre qualsiasi esperimento sulla mobilità e l'assemblaggio, allineare il microscopio TIRF preparando un campione di perline fluorescenti e aggiungendole nel canale microfluidico a basse concentrazioni in modo tale che le macchie fluorescenti delle singole perle non si sovrappongano nelle immagini. Innanzitutto, visualizza le perle in modalità epifluorescenza. Mentre l'illuminazione è in modalità epifluorescenza, spostare lo specchio M5 seduto su uno stadio di traslazione in modo tale che il raggio che esce dall'obiettivo si pieghi fino a raggiungere la configurazione della riflessione interna totale.
Per verificare se l'illuminazione TIR è stata raggiunta, controllare che solo le sfere sulla superficie siano visibili quando il campo evanescente TIR illumina il campione di perline e non si osservino sfere fluttuanti libere lontano dalla superficie. All'inizio dell'esperimento, impostare la potenza del laser sul piano focale posteriore dell'obiettivo da cinque a 10 milliwatt per prevenire la fotodistruzione dei fluorofori. Mantenere il vetrino sul palco del microscopio e concentrarsi prima sulla membrana nuda, piccole tracce di impurità nelle membrane lipidiche sono sufficienti per visualizzare la membrana.
Iniettare il campione utilizzando una micropipetta nella camera di imaging rivestita PEG SLB. Per misurare la cinetica di legame di una singola molecola, utilizzare una pompa a siringa per far fluire le biomolecole marcate attraverso i fori di ingresso nella camera microfluidica a una portata da 50 a 500 microlitri al minuto. Per registrare 5.000 fotogrammi da 25 a 50 fotogrammi al secondo, impostare i parametri di acquisizione del filmato richiesti.
Avviare l'acquisizione di filmati e acquisire più di 5.000 fotogrammi sotto flusso continuo dalla pompa a siringa fino a quando non vi è un ulteriore aumento della comparsa di nuovi punti sulla superficie della membrana e analizzare la cinetica di legame come descritto nel manoscritto. Per il tracciamento di singole particelle, aggiungere le biomolecole marcate a basse concentrazioni al canale utilizzando una micro pipetta. Per garantire l'alta fedeltà delle tracce recuperate dai set di dati, ottimizzare la concentrazione a una densità inferiore a 0,1 particelle per micrometro quadrato, in modo che le singole particelle raramente si incrocino.
Se necessario, incubare la camera in un ambiente umidificante e lavare con il tampone prima dell'imaging. Per l'analisi della traiettoria di singole particelle, acquisisci da 200 a 500 fotogrammi da 10 a 100 fotogrammi al secondo e mantieni l'obiettivo focalizzato sul piano a doppio strato con una deriva minima dello stadio durante l'acquisizione dell'immagine. Per misurare le subunità, aggiungere la concentrazione pertinente di biomolecole marcate alla camera di imaging microfluidico e incubare il vetrino in una camera umidificante alla temperatura desiderata per il tempo richiesto.
Prima dell'imaging, lavare la camera di imaging con un tampone. Posizionare il vetrino su un microscopio e regolare la messa a fuoco per visualizzare le molecole etichettate. Impostare la potenza del laser a un livello in cui lo sbiancamento del fluoroforo avviene gradualmente.
Idealmente per ogni complesso assemblato controllare la potenza del laser per mantenere la velocità di passo dello sbiancamento della foto tra 10 e 20 fotogrammi come descritto nel manoscritto e acquisire le immagini fino a quando tutte le molecole sono completamente sbiancate foto. Eseguire una misurazione dell'assemblaggio dipendente dal tempo avviando l'acquisizione del filmato non appena il campione viene introdotto nella camera e acquisendo nuove pellicole di sbiancamento fotografico a intervalli di tempo fissi dopo il legame della membrana da diversi segmenti del PEG SLB. Il legame della citolisina A alle membrane lipidiche con cinque mole per cento DOPE-PEG (2000) ha mostrato una maggiore densità delle particelle e raggiunto la saturazione.
Una funzione di decadimento esponenziale adatta alle particelle legate fornisce la costante di tempo per il legame della membrana della citolisina A. Senza alcun polimero PEG nella membrana, la maggior parte dei traccianti mostrava una diffusione limitata sulle SLB. Piccoli livelli di PEG 2000 nel doppio strato della membrana si allontanavano dalla superficie sottostante, consentendo alle molecole traccianti di diffondersi senza vincoli superficiali.
Tuttavia, si osserva un confinamento estremo ad un'alta concentrazione di PEG nella membrana a doppio strato. La distribuzione ISD2 per la diffusione del tracciante del DNA lipofilo in due diverse membrane lipidiche PEG 2000 ha mostrato una ridotta mobilità ad alte concentrazioni di PEG. Dopo l'incubazione sull'affollata membrana lipidica a doppio strato, la citolisina A ha mostrato molte fasi distinte di sbiancamento fotografico, suggerendo la formazione di vari intermedi di assemblaggio.
Dopo aver corretto l'efficienza dell'etichettatura, la distribuzione finale degli oligomeri ha mostrato la specie dodecamerica della citolisina A come struttura dominante. L'assemblaggio del legame proteico di membrana e altre reazioni devono essere condotte in ambienti appropriati di affollamento della membrana. È necessario prestare attenzione alla pulizia della camera di imaging, evitando di interrompere il doppio strato e impostando il microscopio TIRF.
