Vorremmo ringraziare le seguenti persone per il loro contributo a questo progetto: Kakali Sarkar, PhD, Joani Christensen, BS, Kate Buretta, BS, Nance Yuan, BS, William Lehao, MD, Johanna GRAHAMMER, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada MD, Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, Sami Khalifian, BS, Mao Qi, MD, e Angelo Leto Barone MD, VCA Laboratorio, Dipartimento di Chirurgia Plastica e Ricostruttiva, Johns Hopkins University School of Medicine, Janis Taube, MD, Mark Fischer, MD, Dipartimento di Dermatologia e Patologia, Johns Hopkins University School of Medicine, Sue Eller, Chirurgia Mini-invasiva Training Center, Johns Hopkins University School di Medicina e Cheng-Hung Lin, MD Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwan. Fonte di finanziamento: Armed Forces Institute of Regenerative Medicine (DoD W81XWH-08-2-0032)

In questa pubblicazione video, sono state effettuate tutte le procedure di polizia in base ad un protocollo animali approvato dalla Institutional Animal Care ed uso commissione Johns Hopkins University (IACUC). 1. Pianificazione preoperatoria <ol><li> Utilizziamo MHC-definito MGH inbred suina in miniatura (15-20 kg) nei nostri studi traslazionali per allotrapianto arto in cui un donatore maschio fornisce arti per due destinatari di sesso femminile (Figura 1). Prima dell&#39;intervento, animali donatori e riceventi sottoposti a valutazione clinica approfondita da un veterinario. </li><li> Per ridurre al minimo l&#39;anestesia e tempo di ischemia, procedure donatori e riceventi sono condotte simultaneamente su tre tavoli operatori in una grande sala operatoria animale dedicata. Il lavoro di squadra e il coordinamento tra i team chirurgici, nonché il personale veterinario sono fondamentali per il successo globale di questa procedura. Il piano chirurgico è discusso con il team veterinario in un incontro formale 1-2 Settimane prima del giorno dell&#39;intervento. </li><li> Un catetere venoso centrale tunnel (7 ve doppio lume Hickman catetere) viene inserito in una vena giugulare esterna o interna di ciascun animale ricevente prima del trapianto di monitorare i livelli farmaco immunosoppressivo e somministrazione endovenosa di immunosoppressiva e / o farmaci immunomodulatori. Questi cateteri sono posti sotto visione diretta attraverso una tecnica cut-down venosa e tunneling posteriore per uscire in alto sul collo dorsale e fissata con monofilamento suture assorbibili e avvolgere bendaggio adesivo intorno al collo. </li><li> Tenere gli animali NPO (nessun cibo solido, ma sono autorizzati ad acqua lib) almeno 12 ore prima dell&#39;intervento chirurgico. </li><li> Il giorno della chirurgia, animali sedare con ketamina 20 mg / kg e xilazina 2 mg / kg IM. </li><li> Inserire un tubo endotracheale di dimensioni adeguate e collegarlo alla macchina per anestesia e ventilazione (mantenuta su isoflurane 0.5-3%) </li><li> Inserire un catetere endovenoso in una vena marginale dell&#39;orecchio e amministrarepeso basa 0,9% soluzione salina durante tutta la procedura. </li><li> Somministrare analgesia pre-emptive (buprenorfina 0,02 mg / kg IV). </li><li> Somministrare profilassi antibiotica (cefazolina 20-25 mg / kg IV) prima della incisione iniziale per il donatore e animali recipienti. </li><li> Utilizzare una tecnica sterile in tutte le procedure sia per i beneficiari e donatori. Ciò include l&#39;uso di strumenti autoclavato o gas sterilizzati, maschere, cappellini testa, camici chirurgici sterili e guanti sterili. Radere l&#39;area di incisione con un clipper e disinfettare con alternanza di soluzione Betadine e alcool. </li></ol> Monitoraggio intraoperatorio: <ol><li> Dopo l&#39;induzione e l&#39;intubazione, mantenere l&#39;anestesia con una miscela di inalazione 0,5-3% isoflurano in ossigeno. </li><li> Monitorare la frequenza cardiaca, pulsossimetria, ECG, end-tidal CO 2 e temperatura rettale continuo e registrare ogni 15 min. </li><li> Prevenire l&#39;ipotermia con una calda coperta ad aria forzata Bair Hugger. </li></ol><ol><li> Posto l&#39;animale donatore in posizione supina sul tavolo operatorio e drappeggio in modo sterile. </li><li> Utilizzare rosso vicino-infrarosso laser angiografia per identificare le navi perforanti per la pelle antero-mediale. Iniettare indocianina verde a circa 0,06 mg / kg diluiti in 2-5 ml di soluzione fisiologica attraverso l&#39;accesso vascolare periferica. Circa 10 secondi più tardi, eseguire 30 sec-2 min di registrazioni vicino infrarosso. Utilizzare il video da queste registrazioni per identificare perforanti. Sulla base perforanti, contrassegnare un&#39;area della pelle (circa 100 cm 2) per il monitoraggio. </li><li> Utilizzare un bisturi per fare una incisione cutanea inguinale in continuità con marcature per l&#39;paddle pelle (Figura 2). </li><li> Identificare vasi femorali e isolarli distalmente al livello dei rami suprageniculate e prossimalmente al livello del legamento inguinale. </li><li> Sezionare la cute e del tessuto sottocutaneo, mentre preserving zona della pala pelle. Suturare i bordi della pelle sottostante muscoli per evitare la contrazione durante la raccolta lembo. </li><li> Eseguire una osteotomia appena sopra il tarso utilizzando una sega alternativo (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA). </li><li> Dividere i muscoli della coscia prossimale utilizzando elettrocauterizzazione. </li><li> Dividere il femore a metà albero lasciando un lembo osteomyocutaneous su un peduncolo vascolare. Il lembo contiene la pagaia pelle, muscoli della coscia sottostanti, ginocchio, femore distale e della tibia prossimale che comprende intatta midollo osseo vascolarizzato con le sue caratteristiche immunologiche uniche. </li><li> Utilizzare cera ossea per ottenere l&#39;emostasi negli ambienti osseo. Osso smussare gli angoli utilizzando ronjeurs in preparazione per il destinatario. </li><li> Mantenere l&#39;innesto perfuso sul suo peduncolo vascolare fino vasi femorali del destinatario vengono preparati (Figura 3). </li><li> Una volta che la dissezione destinatario è completa, legare i donatori vasi femorali come prossimale possibile unnd infondere l&#39;innesto con istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK, Custodiol, Newtown PA) prima del trapianto. NOTA: L&#39;arto donatore viene trapiantato sul lato controlaterale del destinatario ovvero l&#39;arto donatore sinistra per il lato destro del destinatario e l&#39;arto donatore destra per il lato sinistro del destinatario). </li><li> Euthanize il maiale donatore subito dopo la raccolta la seconda parte posteriore con 100 mg / kg IV sodio pentobarbital. La morte è confermata dal personale veterinario al protocollo stabilito. </li></ol> 4. Procedura destinatario (Hind Limb allotrapianto) <ol><li> Avviare l&#39;induzione e l&#39;intubazione destinatario immediatamente dopo l&#39;incisione donatore iniziale per consentire la preparazione di vasi riceventi mentre l&#39;arto donatore viene raccolto. Questo elimina il tempo di attesa inutili e riduce il tempo di anestesia totale per il donatore e riceventi. </li><li> Posizionare la supina animale con una rotazione di 30 ° sul lato operativo da destinare all&#39;assegnazioneL&#39;esposizione w del lato dorsolaterale. </li><li> Effettuare una incisione inguinale ed esporre i vasi femorali; isolarli distalmente al livello dei rami suprageniculate e prossimalmente al livello del legamento inguinale. </li><li> Creare una tasca sottocutanea dall&#39;inguine alla parete addominale dorsolateral del kit di innesto (figura 4). </li><li> Legare le navi cedenti e lavare l&#39;innesto con HTK. </li><li> Eseguire l&#39;inserto innesto in maniera invertita: Hanno la paletta pelle rivolta verso dorsolaterale per consentire il monitoraggio facile immunitario in posizione eretta e le estremità tagliate dei vasi femorali fronte caudale per consentire end-to-end anastomosi vascolari senza alcuna tensione sui vasi ( Figura 5). </li><li> Se disponibile, utilizzare un dispositivo di aggancio vascolare (Synovis, St Paul MN) per anastomosi venose (formato 2.5-3.5 è adatto per 10-20 kg animali). Ciò riduce significativamente il tempo di ischemia rispetto ai metodi convenzionali. </li><li> Eseguire anast arteriosaomoses utilizzando una tecnica di sutura convenzionale con 9-0 sutura (Synovis, St Paul MN) </li><li> Dopo pervietà vascolare è confermata, fissare l&#39;innesto in posizione con suture 3-0 PDS (Figura 5). I muscoli dell&#39;innesto sono suturate ai muscoli della parete addominale. I muscoli innesto non devono essere suturati i muscoli della coscia destinatari poiché può essere deleterio con i movimenti intorno alla gabbia. </li><li> Estrinsecare la paletta pelle sul lato dorsolaterale per il monitoraggio immunitario (Figura 6) e suturare alla pelle adiacente utilizzando 3-0 Vicryl suture sottocutanee e 4-0 monofilamento suture assorbibili pelle interrotti. </li><li> Chiudere la pelle dell&#39;inguine a strati con 3-0 punti di sutura Vicryl sottocutanei e 4-0 monofilamenti assorbibili suture cutanee interrotti. </li><li> Posizionare un cerotto 50-100 mcg / hr fentanil per l&#39;analgesia post-operatoria. </li><li> Dopo il trapianto allogenico arti posteriori, rispedire l&#39;animale verso la sua penna, una volta sveglio e respirare comodamente sul proprio.</li>
</ol>

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	<li>Barth, R. N., Rodriguez, E. D., Mundinger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+bone+marrow-based+immunosuppression+inhibits+rejection+of+vascularized+composite+allografts+in+nonhuman+primates.">Vascularized bone marrow-based immunosuppression inhibits rejection of vascularized composite allografts in nonhuman primates.</a> Am. J. Transplant. 11 (7), 1407-1416 (2011).</li><li>Brandacher, G., Gorantla, V. S., Schneeberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand/Forearm+transplantation+using+a+novel+cell-based+immunomodulatory+protocol-experience+with+five+patients.">Hand/Forearm transplantation using a novel cell-based immunomodulatory protocol-experience with five patients.</a> Am. J. Transplant. 11, 190 (2011).</li><li>Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+basic+and+translational+research+in+reconstructive+transplantation.">Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation.</a> Birth Defects Res. C Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).</li><li>Brandacher, G., Lee, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand+transplantation.">Hand transplantation.</a> Hand Clin. 27, xiii-xiv (2011).</li><li>Hettiaratchy, S., Mendely, E., Randolph, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+composite+tissue+allografts+across+a+major+histocompatibility+barrier+in+miniature+swine.">Tolerance to composite tissue allografts across a major histocompatibility barrier in miniature swine.</a> Transplantation. 27, 514-521 (2004).</li><li>Ibrahim, Z., Busch, J., Awwad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+physiologic+compatibilities+and+incompatibilities+between+human+and+porcine+organ+systems.">Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems.</a> Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2005).</li><li>Kirk, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+bridge:+large+animal+models+in+translational+transplantation+research.">Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research.</a> Immunol. Rev. 19, 176-196 (2003).</li><li>Lee, W. P., Rubin, J. P., Cober, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+swine+model+in+transplantation+of+vascularized+skeletal+tissue+allografts.">Use of swine model in transplantation of vascularized skeletal tissue allografts.</a> Transplant Proc. 30, 2743-2745 (1998).</li><li>Mathes, D. W., Hwang, B., Graves, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+vascularized+composite+allografts+in+canine+mixed+hematopoietic+chimeras.">Tolerance to vascularized composite allografts in canine mixed hematopoietic chimeras.</a> Transplantation. 92 (12), 1301-1308 (2011).</li><li>Mathes, D. W., Randolph, M. A., Solari, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+tolerance+to+a+composite+tissue+allotransplant+in+a+swine+model.">Split tolerance to a composite tissue allotransplant in a swine model.</a> Transplantation. 75 (1), 25-31 (2003).</li><li>Mezrich, J. D., Haller, G. W., Arn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histocompatible+miniature+swine:+an+inbred+largeanimal+model.">Histocompatible miniature swine: an inbred largeanimal model.</a> Transplantation. 75 (6), 904-907 (2003).</li><li>Petruzzo, P., Lanzetta, M., Dubernard, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+International+Registry+on+Hand+and+Composite+Tissue+Transplantation.">The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation.</a> Transplantation. 90, 1590-1594 (2010).</li><li>Sucher, R., Lin, C., Zanoun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hind+limb+transplantation:+a+new+composite+tissue+allotransplantation+model+using+nonsuture+supermicrosurgery.">Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery.</a> Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).</li><li>Ust&#252;ner, E. T., Majzob, R. K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies.">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li><li>Ust&#252;ner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine/mycophenolate+mofetil+therapy.">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li><li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation:+a+translational+trial+in+swine.">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Storicamente, il protocollo trapianto dell&#39;arto posteriore eterotopico inclusa esteriorizzazione di una pagaia pelle alla parete addominale ventrale e le navi sono stati anastomosi in modo end-to-side (Hettiarachty 2004). Tuttavia, nel nostro metodo modificato, un lembo invertito insetting e end-to-end anastomosi portare la paletta pelle più lateralmente e quindi facilita il monitoraggio immunitario in posizione eretta dell&#39;animale. L&#39;identificazione dell&#39;arteria surale e le zone di massima perfusione u...

Vascolarizzato composito allotrapianto (VCA), come mani e viso trapianti sono ormai una realtà clinica con numerose mani e viso trapianti eseguiti in tutto il mondo 12. Nonostante il fatto che i risultati iniziali e intermedi sono favorevoli e altamente incoraggiando 2, il requisito di immunosoppressione multidrug cronica continua a limitare la sua vasta applicazione clinica. I progressi in modelli murini di VCA compreso anastomosi super-microchirurgia e tecniche gemelli senza sutura 13, 3 hanno aperto la strada a una migliore comprensione di alloimmune risposte in VCA. Miriadi di protocolli immunomodulatori sono stati proposti per le applicazioni cliniche basate sulla nostra migliore comprensione dei meccanismi immunitari in VCA, ma hanno bisogno di essere convalidati in un grande modello animale che sarebbe ragionevolmente predittiva delle loro prestazioni negli esseri umani 7. Sulla base di somiglianze fisiologiche e immunologiche tra i sistemi di organi umani e suini <sup&gt; 6, i modelli VCA suina possono essere considerate alternative affidabili e convenienti a canino 9 e modelli di primati non umani 1. Questo articolo fornisce una panoramica dettagliata della metodologia utilizzata nel nostro eterotopico arto posteriore modello suina trapianto MHC-definito, che serve come basi per i nostri attuali e future strategie di immunomodulazione volte ad indurre tolleranza immunitaria al VCA e quindi ampliando la sua applicazione clinica. Utilizziamo i suini consanguinee ben caratterizzati allevati a omozigosi al leucociti suina antigene locus specifico per il loro uso nel trapianto-correlata di ricerca 11. Alziamo un lembo osteomyocutaneous vascolarizzato basato su vasi femorali. Il lembo contiene intatto midollo osseo vascolarizzato nel femore distale e della tibia prossimale. La pelle della coscia anteromedial è anche incluso l&#39;innesto e viene esteriorizzato all&#39;aspetto dorsolaterale del destinatario animale per il monitoraggio immunitario del componente più immunogenica of VCA. Posizionamento dorsolaterale facilita esame clinico in piedi e seduti posizioni e inoltre mantiene la pelle allotrapianto relativamente pulito. Ustener et al. Ha introdotto uno dei primi modelli di grandi dimensioni traslazionali animale in VCA di trapianto radiali lembi forelimb osteomyocutaneous nei suini da allevamento outbred 15. Il gruppo ha utilizzato questo modello per dimostrare per la prima volta che il rigetto acuto in VCA che comprendeva la componente della pelle altamente immunogeno potrebbe essere ritardata e trattati con una strategia clinicamente rilevante, senza significative complicazioni specifiche del farmaco e gli effetti collaterali. I risultati favorevoli ottenuti in questo studio successivamente costruito un passo fondamentale nella progettazione di cicli di terapia per il trapianto ricostruttiva umano. Anche se questi modelli VCA maiale presto erano adatte per lo sviluppo di protocolli per prevenire il rigetto della pelle, dei muscoli, ossa, nervi e vasi che mancavano strutture specializzate quali articolare cartilagE e membrane sinoviali delle articolazioni. Ulteriori sforzi sono stati concentrati sulla cifra compresa mediale dell&#39;animale, che ha richiesto full-length posizionamento cast per impedire innesto dislocazione 14. Sebbene adatto per indagare il rifiuto di tutte le principali componenti del trapianto dell&#39;arto, uno dei principali limiti di questo modello era post-trapianto difficoltà ambulatoriale a causa di lanciare il posizionamento. Così, eterotopici modelli arto allotrapianto suini, composta da tibia, perone, ginocchio, femore distale del muscolo circostante, e una pagaia pelle, sono stati creati per studiare soprattutto gli aspetti immunologici della VCA, consentendo all&#39;animale di deambulare liberamente dopo l&#39;intervento con il minimo morbidit 8 . Lo sviluppo di ben caratterizzati suini consanguinee SLA definiti attraverso il lavoro pionieristico del dottor David H. Sachs ha portato ad una nuova era della ricerca traslazionale VCA. Utilizzando un arto posteriore modello di trapianto eterotopico in un ambiente antigene mancata corrispondenza minore, Mathes et al. 10 hanno dimostrato la sopravvivenza indefinita dei componenti muscolo-scheletrici, con un breve ciclo di trattamento con ciclosporina. La sopravvivenza componente pelle, tuttavia, è stato prolungato solo rispetto ai controlli senza trattamento. La perdita della componente pelle dell&#39;innesto è stata attribuita ad una risposta immunitaria isolato e altamente vigorosa, in particolare, per l&#39;epidermide. Allo stesso modo, utilizzando i maiali completamente non corrispondenti con deplezione delle cellule T, un breve corso di ciclosporina e citochine mobilitato donatori cellule mononucleari del sangue periferico indotto tolleranza solo ai componenti muscolo-scheletriche e la componente pelle è stata ancora respinta 5. Questo fenomeno, chiamato &#39;tolleranza dividere&#39;, ha portato un cambiamento di paradigma nella ricerca VCA con una maggiore attenzione alla componente della pelle altamente immunogenico, che è parte integrante della maggior parte dei trapianti ricostruttivi eseguiti fino ad oggi. In questo modello modificato, utilizziamo anastomosi end-to-end ligating destinatario arteria femorale e ruotandola cefalica (Figura 1). Questo non solo riduce il tempo di ischemia, consentendo l&#39;uso di un dispositivo di accoppiamento convenzionale, ma anche diminuisce le probabilità di guasto per anastomosi. Non abbiamo osservato eventi ischemici seguenti legatura dell&#39;arteria femorale nei nostri destinatari indicando che la circolazione collaterale era sufficiente a fornire vascolarizzazione alla gamba nativo. Inoltre, in questo metodo modificato, il componente pelle esteriorizzato si mobilita basato sui vasi perforanti sottostanti ed è posizionato lateralmente (figura 1) in contrasto con una posizione all&#39;inguine ventrale nel modello tradizionale 10. Ciò consente una facile visualizzazione dell&#39;innesto per il monitoraggio immunitario in piedi o seduta posizione dell&#39;animale. Quindi, una grande modello animale affidabile e riproducibile è essenziale per studiare strategie induzione di tolleranza verso la componente pelle di VCA e di sviluppare nuovi noninvasive strategie di monitoraggio del sistema immunitario per una migliore previsione della sopravvivenza del trapianto.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HTK</td>
			<td>Custodial</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electric Pen Drive</td>
			<td>Synthes, Westchester PA </td>
			<td>05.001.011 </td>
			<td>Reciprocating saw</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vascular Coupling device</td>
			<td>Synovis, Newtown PA</td>
			<td>21003B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (vca) research

Vascolarizzato composito allotrapianto (VCA), come mani e viso trapianti rappresentano una valida opzione di trattamento per i complessi traumi muscoloscheletrici e perdita di tessuto devastante. Nonostante i risultati funzionali favorevoli e molto incoraggianti precoce e intermedi, il rifiuto della componente pelle altamente immunogenica di un VCA e potenziali effetti negativi di immunosoppressione multi-farmaco cronica continuano ad ostacolare diffusa applicazione clinica della VCA. Pertanto, la ricerca in questo campo romanzo deve concentrarsi su studi traslazionali relative a caratteristiche immunologiche uniche di VCA e di sviluppare nuove strategie immunomodulatori per immunomodulazione e induzione della tolleranza seguenti VCA senza la necessità di immunosoppressione a lungo termine. Questo articolo descrive una traslazione grande modello animale affidabile e riproducibile di VCA che si compone di un lembo osteomyocutaneous in un suino allotrapianto eterotopico arto posteriore MHC-definito. BriEfly, una pagaia pelle ben vascolarizzato, è identificato nella regione antero-mediale della coscia usando vicino angiografia laser a infrarossi. I muscoli sottostanti, ginocchio, femore distale e della tibia prossimale sono raccolte su un peduncolo vascolare femorale. Questo allogenico può essere considerato sia un VCA e vascolarizzato trapianto di midollo osseo, con le sue caratteristiche uniche privilegiati immuni. L&#39;innesto viene trapiantato in una tasca sottocutanea addominale nell&#39;animale destinatario con un componente pelle esteriorizzato alla regione dorso laterale per il monitoraggio immunitario. Tre squadre chirurgiche lavorano contemporaneamente in modo ben coordinato per ridurre l&#39;anestesia e tempi di ischemia, migliorando così l&#39;efficienza di questo modello e di ridurre i potenziali fattori confondenti in protocolli sperimentali. Questo modello serve come basi per le future strategie terapeutiche volte a ridurre e, potenzialmente, eliminando la necessità di immunosoppressione cronica multi-droga in VCA.

Ventiquattro i trapianti degli arti posteriori eterotopici suina SLA definiti sono state eseguite utilizzando la nostra tecnica modificata con un tempo di ischemia media di 78 minuti (range: 62-94 min). Innesto inserto e dorsolaterale posizionamento paddle pelle sono stati raggiunti senza difficoltà in tutti gli animali. Vicino infrarosso laser angiografia ha mostrato eccellente perfusione innesto in tutti i destinatari. I primi dodici anastomosi venose sono state eseguite utilizzando tecniche di sutura convenzionali m...

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A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascolarizzato Composite Allotransplantations (VCA) sono diventati una realtà clinica. Tuttavia, la vasta applicazione clinica di VCA è limitata dalla immunosoppressione multi-farmaco cronica. Gli autori presentano un modello animale grande affidabile e riproducibile per tradurre nuove strategie immunomodulatori che possono minimizzare o potenzialmente eliminare la necessità di immunosoppressione in VCA.

Un modificata eterotopica suina Hind Arto Trapianto Modello traslazionale vascolarizzato composito allotrapianto (VCA) La ricerca

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

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Research

JoVE Journal

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A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

12.4K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine.  Vascolarizzato Composite Allotransplantations (VCA) sono diventati una realtà clinica. Tuttavia, la vasta applicazione clinica di VCA è limitata dalla immunosoppressione multi-farmaco cronica. Gli autori presentano un modello animale grande affidabile e riproducibile per tradurre nuove strategie immunomodulatori che possono minimizzare o potenzialmente eliminare la necessità di immunosoppressione in VCA. 

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A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents available. A difficulty is presented due to the small size of the animal and the considerable technical challenges of the microsurgery involved in heart transplantation. In particular, a high rate of technical failure early after transplantation may result from recipient death and post-operative complications such as hind limb paralysis or a non-beating heart. Here, the complete technique for heterotopic mouse heart transplantation is demonstrated, involving harvesting the donor heart and its subsequent implantation into a recipient mouse. The donor heart is harvested immediately following in situ perfusion with cold heparinized saline and transection of the ascending aorta and pulmonary artery. The recipient operation involves preparation of the abdominal aorta and inferior vena cava (IVC), followed by end-to-side anastomosis of the donor aorta with the recipient aorta using a single running 10-0 microsuture and a similar anastomosis of the donor pulmonary artery with the recipient IVC. Following the operation the animal is injected with 0.6 ml normal saline subcutaneously and allowed to recover on a 37&#160;&#176;C heating pad. The results from 227 mouse heart transplants are summarized with a success rate at 48 hr of 86.8%. Of the 13.2% failures within 48 hr, 5 (2.2%) experienced hind limb paralysis, 10 (4.4%) had a non-beating heart due to graft ischemic injury and/or thrombosis, while 15 (6.6%) died within 48 hr.

A technique is demonstrated for the microsurgical procedure for heterotopic transplantation of hearts in mice, including simplified methods for donor harvesting and recipient vessel anastomosis.

Un metodo modificato per eterotopica mouse Cuore Trapianto

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

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Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murini eterotopica cuore Tecnica Trapianto

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

A Novel microchirurgica modello per eterotopica, in blocco parete toracica, Timo, e trapianto cardiaco nei topi

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Ortotopico degli arti posteriori del trapianto di mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modello di topo per il trapianto di Pancreas usando una tecnica modificata polsino

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic options have significant risk of failure and substantial morbidity.
Use of bone vascularized composite allotransplantation (VCA) would offer both a close match of resected bone size and shape and the healing and remodeling potential of living bone. At present, life-long drug immunosuppression (IS) is required. Organ toxicity, opportunistic infection and neoplasm risks are of concern to treat such non-lethal indications.
We have previously demonstrated that bone and joint VCA viability may be maintained in rats and rabbits without the need of long-term-immunosuppression by implantation of recipient derived vessels within the VCA. It generates an autogenous, neoangiogenic circulation with measurable flow and active bone remodeling, requiring only 2 weeks of IS. As small animals differ from man substantially in anatomy, bone physiology and immunology, we have developed a porcine bone VCA model to evaluate this technique before clinical application is undertaken. Miniature swine are currently widely used for allotransplantation research, given their immunologic, anatomic, physiologic and size similarities to man. Here, we describe a new porcine orthotopic tibial bone VCA model to test the role of autogenous surgical angiogenesis to maintain VCA viability.
The model reconstructs segmental tibial bone defects using size- and shape-matched allogeneic tibial bone segments, transplanted across a major swine leukocyte antigen (SLA) mismatch in Yucatan miniature swine. Nutrient vessel repair and implantation of recipient derived autogenous vessels into the medullary canal of allogeneic tibial bone segments is performed in combination with simultaneous short-term IS. This permits a neoangiogenic autogenous circulation to develop from the implanted tissue, maintaining flow through the allogeneic nutrient vessels for a short time. Once established, the new autogenous circulation maintains bone viability following cessation of drug therapy and subsequent nutrient vessel thrombosis.

Currently any kind of vascularized composite allotransplantation depends on long-term-immunosuppression, difficult to support for non-life-critical indications. We present a new porcine tibial VCA model that can be used to study bone VCA and demonstrate the use of surgical angiogenesis to maintain bone viability without the need of long-term immune-modulation.

Chirurgica dell'angiogenesi in porcina Allotransplantation Tibial: un nuovo grande osso animale vascolarizzato Allotransplantation composito modello

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Modello preclinico di ischemia degli arti posteriori nei conigli diabetici

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modificato Eterotopic Hindarto Osteomyocutaneo flap modello nel ratto per traslazionale vascolarizzazione composito Allotransplantazione ricerca

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone splenectomy regardless of precipitating causes are prone to develop an overwhelming post-splenectomy infection and experience increased risks of deep venous thrombosis and malignancies. Recently, epidemiological studies indicated that splenectomy might be associated with the occurrence of cardiovascular diseases, suggesting that physiological functions of the spleen have not yet been fully recognized. Here, we introduce a mouse model of vascularized heterotopic spleen transplantation, which not only can be utilized to study the function and behavioral activity of splenic immune cell subsets in different biologic processes, but also can be a powerful tool to test the therapeutic potential of spleen transplantation in certain diseases. The main surgical steps of this model include donor spleen harvest, the removal of recipient native spleen, and spleen graft revascularization. Using congenic mouse strains (e.g., mice with CD45.1/CD45.2 backgrounds), we observed that after syngeneic transplantation, both donor-derived splenic lymphocytes and myeloid cells migrated out of the graft as early as post-operative day 1, concomitant with the influx of multiple types of recipient cells, thus generating a unique chimera. &#160;Despite relatively challenging techniques, this procedure can be performed with &#62;90% success rate. This model allows tracking the fate, longevity, and function of splenocytes during steady state and in a disease setting following a spleen transplantation, thereby offering a great opportunity to discover the distinct role for spleen-derived immune cells in different disease processes.

This protocol details the surgical steps of a mouse model of vascularized heterotopic spleen transplantation, a technically challenging model that can serve as a powerful tool in studying the fate and longevity of spleen cells, the mechanisms of distinct spleen cell populations in disease progression, and transplant immunity.

Un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e l'immunità ai trapianti

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone ...

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current limitations in immunosuppression and functional neuromotor recovery. Many animal models have been developed for studying unique features of VCA, but here we present a robust reproducible model of orthotopic hind limb transplant in rats designed to simultaneously investigate both aspects of current VCA limitation: immunosuppression strategies and functional neuromotor recovery. At the core of the model rests a commitment to meticulous, time-tested microsurgical techniques such as hand sewn vascular anastomoses and hand sewn neural coaptation of the femoral nerve and the sciatic nerve. This approach yields durable limb reconstructions that allow for longer lived animals capable of rehabilitation, resumption of daily activities, and functional testing. With short-term treatment of conventional immunosuppressive agents, allotransplanted animals survived up to 70 days post-transplant, and isotransplanted animals provide long lived controls beyond 200 days post-operatively. Evidence of neurologic functional recovery is present by 30 days post operatively. This model not only provides a useful platform for interrogating immunological questions unique to VCA and nerve regeneration, but also allows for in vivo testing of new therapeutic strategies specifically tailored for VCA.

This protocol presents a robust, reproducible model of vascularized composite allotransplant (VCA) geared toward simultaneous study of immunology and functional recovery. The time invested in meticulous technique in a right mid-thigh hind limb orthotopic transplant with hand sewn vascular anastomoses and neural coaptation yields the ability to study functional recovery.

Fare il passo successivo: un modello di trapianto di arto hind di coaptation neurale per massimizzare il recupero funzionale nel ratto

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...