Ringraziamo il Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) per il generoso sostegno e la supervisione di questo lavoro e il Sig. Kieran Mellody (Università di Manchester, Manchester) per la modifica critica di questo manoscritto. Questo progetto è stato sostenuto da Research UK (CR-UK) concedere numero C147/A6058 (AO)

1. Isolamento di fibroblasti umani in coltura primaria mammaria normale Procedure sperimentali per isolare fibroblasti umani in coltura primaria mammaria normale, sono illustrate nella fig. 1A. <ol><li> Preparare il tampone di cellule dissociazione, come descritto in precedenza 12: Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) con 10% di siero fetale bovino (FCS), penicillina-streptomicina (200 unità / ml), collagenasi di tipo I (1 mg / ml) e ialuronidasi ( 125 unità / ml). </li><li> Lavare il tessuto del seno sezionato da una mastoplastica riduttiva (~ 0,5 grammi), più volte in tampone fosfato (PBS). Tritare il tessuto in piccoli frammenti (&lt;1,5 mm 3) con lame di rasoio sterile. </li><li> Trasferire i frammenti di tessuto in un tubo da 15 ml contenente una quantità appropriata di quanto sopra cellula dissociazione tampone (10 ml per 0,5 grammo di tessuto) e vortex per 1 minuto alla massima velocità. </li><li> Digerire i frammenti di tessuto nella cella di dissociazione buffer di fo 12-18 ore a 37 ° C con agitazione lenta. * Nota che ci saranno ancora molti pezzi di frammenti di tessuto digerito ancora nel tubo. </li><li> Incubare la provetta per 5 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Trasferire il risultante delle cellule stromali arricchito surnatante in un nuovo tubo conico con una pipetta da 5 ml sierologici. </li><li> Centrifugare la frazione stromale per 5 minuti a 250 g X e risospendere il pellet di cellule in PBS. Centrifugare ancora per 5 minuti a 250 g X e risospendere il pellet cellulare in DMEM supplementato con 10% FCS. Coltivare le cellule in DMEM contenente 10% FCS in una capsula di Petri cm 15 a 37 ° C e l&#39;anidride carbonica del 5%. </li><li> Propagare le celle fino confluenti. E &#39;norma compresi tra i 8-10 giorni. Conservare le cellule a -80 ° C con media di congelamento (10% dimetilsolfossido e il 20% di FCS in DMEM). Preparare 5 flaconcini congelato come uno stock originale. Scongelare un flaconcino ed espandere le cellule per preparare 5 flaconi per lo stock secondario contenente fibroblasti diversi passaggi entro 5 della popolazioneraddoppi (PD) per gli esperimenti successivi. Queste procedure minimizzare selezione clonale e lo stress della cultura che potrebbero verificarsi durante coltura tissutale esteso. * Nota che P1.1-7 può essere utilizzato anche per l&#39;isolamento CAF da carcinoma mammario ottenuto da una mastectomia 12. </li></ol> 2. Generazione di GFP-etichettata, puromicina resistente, immortalata fibroblasti umani normali mammaria <ol><li> Per immortalare il primario fibroblasti umani mammaria normale, isolato in P1.7), introdurre un retrovirale pMIG (MSCV-IRES-GFP) vettore di 12, che esprime sia hTERT e GFP. Coltivare le cellule per 4-5 giorni e quindi ordinare la GFP-positive cellule citometria a flusso. </li><li> Introdurre un retrovirale pBabe-puro costruire la codifica di un gene di resistenza puromicina nei fibroblasti immortalato GFP-etichettati. Coltivare le cellule per 5-7 giorni in presenza di puromicina (concentrazione finale: 1 mg / ml) per isolare la GFP-positive (GFP +), puromicina-resistente (puro R </sup&gt;) immortalato umano fibroblasti mammari. </li><li> Successivamente, esaminare se questi fibroblasti producono virus attivo, che può portare al trasferimento orizzontale di geni che codificano GFP e la resistenza puromicina, crescere 2.5x10 5 GFP + puro R immortalato umano fibroblasti mammari in una capsula di Petri 6 centimetri per 2 giorni. </li><li> Mezzo filtrante condizionata da questi fibroblasti utilizzando un filtro siringa (dimensione dei pori: 0,45 micron) e aggiungerlo su 10T1 / 2 cellule di topo fibroblastica per 12h in presenza di solfato di protamina (5 mg / ml), che aumenta l&#39;efficienza della infezione da virus. Il mezzo è poi cambiato al 10% FCS-DMEM per ulteriori 2 giorni. </li><li> Esaminare le cellule da un microscopio a fluorescenza. 10T1 / 2 cellule infettate da virus GFP diventerà GFP-positive. Trattare anche le cellule con puromicina (1 mg / ml) per 5-7 giorni e osservare la piastra se puro R 10T1 / 2 colonie di cellule sono presenti e formano dopo il trattamento puromicina. </li><li> Si noti che il gene orizzontale transfer da virus attivo prodotto dalla GFP genitori + puro R fibroblasti umani mammari potrebbe rendere le cellule circostanti murino e / o cellule di carcinoma puro GFP + R entro xenotrapianti tumorali. Ciò può ostacolare i processi di isolare il GFP + inizialmente iniettato puro R fibroblasti umani mammari dal xenotrapianti tumorali. </li></ol> 3 bis. Co-iniezione di fibroblasti umani con cellule di carcinoma mammario nel seno di un mouse immunodeficienti Procedure sperimentali per la generazione di exp-CAF sono illustrati nella fig. 1BA. <ol><li> Mix 1x10 6 MCF-7-ras cellule umane di carcinoma mammario e 3x10 6 GFP + R puro, immortalate fibroblasti umani mammaria generata in P2.2). Preparare le cellule in 400 ml di terreno di coltura con il 50% (v / v) Matrigel per iniezione. </li><li> Iniettare la miscela di cellule per via sottocutanea in un mouse immunodeficienti nudo. Quando CAF sono estratti in modo indipendente da diversitumori, ogni impianto composto in fianchi destro e sinistro del mouse diversi. </li></ol> 3b. Iniezione di fibroblasti umani mammaria in un mouse immunodeficienti <ol><li> Per generare fibroblasti di controllo contro exp-CAF, preparare 3x10 6 GFP + puro R immortalato fibroblasti umani mammaria generata in P2.2 in 400 ml di terreno di coltura con il 50% (v / v) Matrigel per iniezione (Fig. 1BB). NON miscelare i fibroblasti con cellule di carcinoma. </li><li> Impianto i fibroblasti preparati in P3b.1 all&#39;interno di siti o sottocutanea di topi nudi. </li></ol> * Si noti che i fibroblasti inoculati formeranno il tessuto fibroblastico, ma non del tumore sotto la pelle. 4 bis. Dissezione di xenotrapianto del tumore <ol><li> Euthanise il mouse ospitare un seno umana sottocutanea xenotrapianto cancro 42 giorni dopo l&#39;impianto (Fig. 1BA). * Nota che quando le cellule di carcinoma e / o fibroblasti sono coimplanted, Fibroblasti potrebbe essere necessario essere incubate per più di 42 giorni entro i xenotrapianto del tumore di avviare il loro fenotipo myofibroblastic. </li><li> Raccolto il xenotrapianto del tumore dal fianco del mouse per via smussa con pinze e forbici. Immergere il tessuto tumorale in PBS. </li></ol> 4b. Dissezione dei trapiantati fibroblasti <ol><li> Euthanise il mouse ospitare il xenotrapianto fibroblasti 42 giorni dopo l&#39;impianto (Fig. 1BB). </li><li> Sezionare il xenotrapianto fibroblasti sottocutanei con pinze e forbici. Posizionare il tessuto fibroblastica in PBS. * Nota che di trapianto di fibroblasti, che appare come un tessuto trasparente piccolo, può essere difficile da trovare sotto la pelle. </li></ol> 5. Preparazione delle primarie cellule in coltura da xenotrapianti <ol><li> Utilizzare un armadio sterile biosicurezza di sezionare il tumore (~ 0,5 grammi) o tessuto fibroblastico (~ 0,1 grammi). Trasferire i tessuti asportati sulla parte superiore di una cultura 15 centimetri dish con 1 ml di PBS. Tritare i tessuti in frammenti di tessuto di piccole dimensioni (&lt;1,5 mm 3) utilizzando lame di rasoio sterile. * Si noti che se il xenotrapianto fibroblasti pesa meno di 0,1 grammi, raccogliere un paio di xenotrapianti fibroblasti aggiuntivi e mescolarli insieme per aumentare il numero di celle per l&#39;isolamento. </li><li> Trasferire i frammenti di tessuto in un tubo da 15 ml contenente la cella di dissociazione del buffer (10 ml per 0,5 grammo di tessuto) e vortex per 1 minuto alla massima velocità. </li><li> Incubare la sospensione cellulare per 3 ore a 37 ° C con continua agitazione lenta. </li></ol> 6. Isolamento di puromicina resistenti cellule in coltura <ol><li> Centrifugare la sospensione cellulare sia dissociato da xenotrapianto del tumore o dei fibroblasti per 5 min a 250 g X e risospendere il pellet di cellule in PBS. Centrifugare ancora per 5 minuti a 250 x g. Risospendere il pellet di cellule risultante nel 10% FCS-DMEM. Coltivare le cellule in una capsula di Petri cm 15, in presenza di puromicina (1 mg / ml) a 37 ° Ce anidride carbonica del 5% al ​​fine di eliminare eventuali cellule di carcinoma contaminanti e / o cellule stromali murine. Propagare le celle fino confluenti (2-4 settimane). Conservare le cellule a -80 ° C con media di congelamento. * Nota che il conseguente puro cellule R, designato di 42 giorni di età exp-CAF1 (Fig. 1BA) o il controllo dei fibroblasti-1 le cellule (Fig. 1BB), sono immortali e positive per GFP. Si consiglia di verificare se queste cellule producono virus attiva utilizzando 10T1 / 2 celle, come descritto nella P2.3-6. </li></ol> 7 bis. Isolamento di exp-CaF2 cellule in coltura Per migliorare ulteriormente il fenotipo attivato myofibroblastic di CAF, mix di 42 giorni di età exp-CAF1 cellule MCF-7-ras cellule e iniettare per via sottocutanea di nuovo in un topo nudo per ulteriori periodi di 200 giorni. Sezionare e dissociare il xenotrapianto del tumore in una cella singola sospensione e coltivare le cellule in una capsula di Petri cm 15 con 10% FCS-DMEM in presenza di puromicina (1 mg / ml), come indicato in P6.1. Propagare le celle fino confluenti (8-10 giorni). Conservare le cellule a -80 ° C con media di congelamento. Il risultato puro R cellule prendono il nome 242-giorno-vecchio-exp CaF2 cellule (Fig. 1BA). 7b. Estrazione di controllo fibroblasti-2 cellule in coltura Per generare fibroblasti di controllo contro exp-CaF2 cellule, iniettare di 42 giorni di età il controllo dei fibroblasti-1 le cellule da solo, senza cellule di carcinoma per via sottocutanea in un topo nudo in aggiunta, per 200 giorni. Sezionare e dissociare il tessuto fibroblastico in una sospensione singola cella e la cultura delle cellule in una capsula di Petri cm 15 con 10% FCS-DMEM in presenza di puromicina (1 mg / ml) come indicato nella P6.1. Propagare le celle fino confluenti (3-4 settimane). Conservare le cellule a -80 ° C con media di congelamento. Il risultato puro cellule R sono chiamati fibroblasti-2 le celle (Fig. 1BB). 8. Rappresentante dei risultati: Controllo dei fibroblasti-2 e exp-CaF2 cells, che sono stati estratti da xenotrapianti di tumori al seno, tinto fortemente positivo per i marcatori mesenchimali, tra umano specifico per vimentina, prolil-4-idrossilasi, 1A collagene, fibronectina, S100A4, e la superficie delle proteine ​​dei fibroblasti (Fig. 2A) 11, indicando umano origine e la natura di queste cellule mesenchimali. Al contrario, la citocheratina, un marker per le cellule epiteliali, non è stato macchiato in questi fibroblasti + GFP (Fig. 2B). Questi risultati suggeriscono quindi che l&#39;estratto exp-CaF2 e controllo dei fibroblasti-2 le cellule hanno avuto origine dai genitori fibroblasti umani mammari inizialmente introdotti nella xenotrapianti mouse. Soprattutto, una maggiore proporzione di exp-CaF2 cellule colorate positivo per α-SMA e glicoproteina della matrice extracellulare tenascina C-5, che sono entrambi marcatori di miofibroblasti rispetto a 42 giorni di età exp-CAF1 e controllo dei fibroblasti-2 cellule (Fig. . 2C, D) 11. Questi dati indicano che residenti fibr umano della mammellaoblast progressivamente evolvere in miofibroblasti CAF in xenotrapianti tumorali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" /> Figura 1 Rappresentazione schematica di isolamento di fibroblasti umani mammaria. A) Il tessuto mastoplastica riduttiva è stata tritata con lame di rasoio sterile (P1.2) e trasferito in un tubo da 15 ml (P1.3). I piccoli frammenti di tessuto sono stati digeriti nella cella buffer di dissociazione (P1.4) e preparato per la cultura in vitro (P1.5-7). Per immortalare il isolato primario fibroblasti umani mammari, un pMIG retrovirale (MSCV-IRES-GFP) vettore, esprimendo sia hTERT e GFP, è stata introdotta, e la GFP-positive conseguenti cellule sono state ordinate in citometria a flusso (P2.1). Un retrovirali pBabe-puro vettore di codifica un gene di resistenza puromicina è stato poi introdotto in queste cellule. Al momento il trattamento puromicina, GFP-etichettata (GFP +) puromicina-resistenti (Puro R), Immortalised fibroblasti umani della mammella sono state isolate (P2.2). B bis) Per generare exp-CAF, GFP + puro R immortalato fibroblasti umani mammari sono stati coinjected con MCF-7-ras cellule di carcinoma mammario per via sottocutanea in un mouse immunodeficienti nudo (P3A). Il xenotrapianto del tumore è stato asportato a 42 giorni dopo l&#39;impianto (P4A) e dissociato in una cella singola sospensione (P5). Queste cellule sono state poi coltivate in vitro in presenza di puromicina per eliminare eventuali cellule di carcinoma contaminanti topo e cellule stromali (P6). La risultante puromicina resistenti cellule sono state definite in via sperimentale generato CAF1 (exp-CAF1) cellule. Queste cellule, asportato 42 giorni dopo l&#39;impianto, sono stati ancora una volta mescolato con MCF-7-ras cellule e impiantato per via sottocutanea in un topo host come prima (P7a). Il tumore risultante è stato permesso di crescere per ulteriori periodi di 200 giorni, poi sezionato, dissociato, e coltivate in presenza di puromicina. L&#39;isolatopuromicina cellule resistenti erano chiamati exp-CaF2 cellule (242 giorni di età). Bb) Per isolare le cellule di controllo contro exp-CAF, GFP + puro R immortalato fibroblasti umani mammari sono stati iniettati per via sottocutanea in un topo nudo come le colture pure senza MCF-7-ras cellule (P3B). Il tessuto fibroblastico, sezionato 42 giorni post-impianto (P4B), è stato dissociato in cella singola sospensioni (P5) e puromicina cellule resistenti, chiamato control fibroblasti-1 le cellule, sono stati isolati come descritto in precedenza (P6). Questi fibroblasti sono stati ancora una volta impiantato per via sottocutanea in un topo nudo senza MCF-7-ras cellule in aggiunta, per 200 giorni (p7b). Il tessuto fibroblastico è stato sezionato, dissociato, e coltivate in presenza di puromicina. L&#39;isolato puromicina cellule resistenti erano chiamati fibroblasti-2 le celle (242 giorni di età). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" /> Figura 2 <strong&gt; Exp-CAF e fibroblasti di controllo provengono da genitori fibroblasti umani mammaria. (A) analisi di immunofluorescenza di controllo dei fibroblasti-2 (controllo f.) e exp-CaF2 cellule. I due tipi di cellule macchia positivo per i marcatori mesenchimali (rosso), compresi gli esseri umani vimentina, prolil-4-idrossilasi, 1A collagene, fibronectina, S100A4, e la superficie delle proteine ​​dei fibroblasti. (B), invece, pan-citocheratina, un marcatore per le cellule epiteliali , non viene rilevato in exp-CaF2 cellule che esprimono GFP (verde). Nuclei delle cellule sono colorate con 4&#39;-6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (blu). Barra della scala, 50 micron (da cui Kojima et al. 11) (C) Immunofluorescenza di exp-CaF2 cellule di fibroblasti e di controllo-2 cellule (controllo f.) utilizzando anticorpi contro α-SMA (rosso) o tenascina-C (TN-C) (rosso). Nuclei delle cellule sono colorate con DAPI (blu). Barra della scala, 50 micron. (D) 48% di exp-CaF2 cellule macchia positivo per α-SMA, mentre 14% di 42-giorno-vecchio-exp CAF1 e il 2,5% della popolazione di controllo fibroblasto-2 celle sono positivi per α-SMA. (Di cui da Kojima et al.11)

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La mancanza di CAF-specifici marcatori e il livello di eterogeneità osservata tra CAF rendere la caratterizzazione di questo tipo di cellule una sfida in sé. CAF studio in vitro è stato ostacolato dalla complicazione ulteriore che queste cellule senesce e fermare la proliferazione quando in coltura per un lungo periodo. Il nostro precedente tentativo di immortalare direttamente CAF primaria utilizzando un costrutto retrovirale hTERT cDNA non ha avuto successo. Pertanto, per approfondire lo studio del tumore ...

<table border="1"><tr><td> Nome del materiale </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di vitello fetale </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi tipo I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> ialuronidasi </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentina (V9) anticorpi </td><td></td><td> Novocastra Laboratori </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascina C (AC-8) anticorpi </td><td></td><td></td><td></td><td> un dono di Dr. <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4) anticorpi </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolil-4-idrossilasi </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) anticorpi </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagene tipo1 1A anticorpi </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-citocheratina anticorpi </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi fibronectina </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblasti- proteina-1 specifica) degli anticorpi </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblasti superficie proteica (Clone 1B10) anticorpi </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP costruire </td><td></td><td></td><td></td><td> Richiesta ai autori </td></tr><tr><td> pBabe-puro costruire </td><td></td><td></td><td></td><td> Acquisto da Addgene </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo 15 ml conica </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Topo nudo </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> NCR nudo femminile </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 cellule </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

I carcinomi sono i tessuti complesso composto di cellule neoplastiche e non-cancerosa comparto denominato &#39;stroma&#39;. Lo stroma è costituito da matrice extracellulare (ECM) e una varietà di cellule mesenchimali, tra cui fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, periciti e leucociti 1-3. Il tumore-associati stroma è sensibile a sostanziali segnali paracrini rilasciati da cellule di carcinoma vicine. Durante il processo della malattia, lo stroma diventa spesso popolato da carcinoma associato fibroblasti (CAF), tra cui un gran numero di miofibroblasti. Queste cellule sono stati precedentemente estratti da diversi tipi di carcinomi umani per la loro cultura in vitro. Una sottopopolazione di CAF si distingue attraverso la loro up-regulation di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) espressione 4,5. Queste cellule sono un marchio di garanzia &#39;fibroblasti attivati&#39; che condividono proprietà similari con miofibroblasti commonly osservato nei tessuti fibrotici feriti e 6. La presenza di questo sottoinsieme myofibroblastic CAF è fortemente legate ad alto grado di malignità e associata a prognosi non favorevole nei pazienti. Molti laboratori, compreso il nostro, hanno dimostrato che la CAF, una volta iniettato con cellule di carcinoma in topi immunodeficienti, sono in grado di promuovere sostanzialmente tumorigenesi 7-10. CAF preparato da pazienti carcinoma, però, frequentemente sottoposti a senescenza durante la propagazione della cultura limitare la vastità del loro utilizzo per tutta la sperimentazione in corso. Per superare questa difficoltà, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per generare sperimentalmente immortalato umano mammario linee cellulari CAF (exp-CAF) da fibroblasti umani mammari, utilizzando un modello di tumore al seno coimplantation xenotrapianto. Al fine di generare exp-CAF, dei genitori fibroblasti umani mammari, ottenute dal tessuto mastoplastica riduttiva, sono stati Immortalised con hTERT, la subunità catalitica della telomerasi oloenzima, e progettato per esprimere la GFP e un gene di resistenza puromicina. Queste cellule sono state coimplanted con cellule MCF-7 di carcinoma mammario umano esprime un oncogene attivato ras (MCF-7-ras cellule) in caso di trapianto di mouse. Dopo un periodo di incubazione in vivo, inizialmente iniettato fibroblasti umani mammari sono stati estratti dal xenotrapianti tumorali sulla base della loro resistenza puromicina 11. Abbiamo osservato che il residente fibroblasti umani mammari hanno differenziato, l&#39;adozione di un fenotipo tumorale myofibroblastic e acquisiti di promozione proprietà nel corso della progressione del tumore. È importante sottolineare che queste cellule, definite come exp-CAF, in stretta imitare il tumore di promozione fenotipo myofibroblastic del CAF isolate da carcinomi del seno sezionato dai pazienti. Il nostro tumore xenotrapianto-derivato exp-CAF quindi fornire un modello efficace per studiare la biologia del CAF in BREAS umanot carcinomi. Il protocollo descritto può essere esteso anche per la generazione e la caratterizzazione varie popolazioni CAF derivate da altri tipi di carcinomi umani.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma associato fibroblasti (CAF), ricco di miofibroblasti presenti nello stroma del tumore, svolgono un ruolo importante nel guidare la progressione del tumore. Abbiamo sviluppato un tumore modello coimplantation xengraft per generare sperimentalmente CAF da fibroblasti umani mammaria. Il protocollo descrive come stabilire miofibroblasti CAF che acquisiscono la capacità di promuovere la tumorigenesi.

Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

experimental-generation-carcinoma-associated-fibroblasts-cafs-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

23.3K Views.  University of Manchester. Carcinoma associato fibroblasti (CAF), ricco di miofibroblasti presenti nello stroma del tumore, svolgono un ruolo importante nel guidare la progressione del tumore. Abbiamo sviluppato un tumore modello coimplantation xengraft per generare sperimentalmente CAF da fibroblasti umani mammaria. Il protocollo descrive come stabilire miofibroblasti CAF che acquisiscono la capacità di promuovere la tumorigenesi.

Video: Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Trapianto di cellule staminali in un In vitro Simulato ischemia / riperfusione Modello

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

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Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Umano arteria mammaria interna (IMA) Trapianti e Stenting: un modello umano per studiare lo sviluppo della ristenosi in-stent

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Pelle Punch Biopsia Espianto Cultura per la derivazione di fibroblasti umani primari

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

L&#39;uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Sperimentale trasporto pneumococco umano

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling del microambiente tumorale invasiva in un modello 3-Dimensional delle cellule del cancro colorettale e<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblasti

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Tissue Caratterizzazione dopo un metodo nuovo disaggregazione per Skin Micro-innesti Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...