MAL, JCG, e MRS sono supportati dalla NIA (R00AG033176 e R01AG040081) e dal Laboratorio di ricerca diretto e Sviluppo, US Department of Energy # contratto DE-AC02-05CH11231.

1. Tissue Processing e digestione <ol><li> Ottenere tessuto mammario umano come materiale di scarto da procedure chirurgiche. Mammoplasties di riduzione in grado di fornire cellule normali o benigna; fibroadenomi e gynecomastias fornire cellule benigne, non-tessuti tumorali mastectomia controlaterale (periferica o ad un tumore, o sottocutanea) fornire cellule che possono variare da normale a benigni a microtumors contenenti. Garantire l&#39;approvazione IRB corretta esiste prima di ottenere il materiale di scarto. Tutto il materiale deve essere trattato in trasmissione ematica regolamenti patogeni. </li><li> Materiale in contenitori sterili contenenti tampone o supporti (ad esempio 1:1 Medio Eagle modificato da Dulbecco e di Ham F-12) supplementato con 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 5 pg / ml Fungizone, 50U/ml polimixina B, e 10% siero fetale di bovino, e il trasporto al laboratorio a 4 ° C. Mammoplastica tessuto di riduzione possono essere conservati o spediti a 4 ° C per 72 ore, senza alterare in modo significativo dola vitalità delle cellule bsequent. Piccoli pezzi di non-riduzione del tessuto mastoplastica possono richiedere l&#39;elaborazione più rapida. </li><li> Separare le zone epiteliali dalla matrice stromale del tessuto adiposo, tessuto connettivo e dei vasi sanguigni utilizzando una combinazione di sterili bisturi, pinze e forbici. Tagliare pezzi di tessuto con le forbici e metterlo in un piatto di vetro di grandi dimensioni sterile (ad esempio, 150 mm). Delicatamente sezionare le aree epiteliali, che appaiono come filamenti bianchi incorporate nella matrice stromale yellower, utilizzando le pinze per tenere il materiale e il bisturi per raschiare il materiale grossolanamente grassa. Per facilitare la digestione, tagliare il tessuto epiteliale in pezzi più piccoli di 3-4 mm ~ utilizzando bisturi opposte e posto in una provetta da 50 ml. Se grandi quantità di tessuto sono in fase di elaborazione, fresche lame di bisturi può essere necessaria. Rimuovere il materiale grasso dal piatto per lo smaltimento secondo le norme istituzionali. <ol class="lalpha"><li> Nei tessuti fibrosi pesantemente (ad esempio, per via sottocutanea mastectomies con grave malattia fibrocistica), non ci sarà più solido bianco, non-epiteliale materiale. Può essere difficile sezionare le cellule epiteliali di tali matrici fibrose. Grossi pezzi di materiale fibroso può essere tagliato in pezzi più piccoli che sono quadrati di 1-3 mm ~ zona e digerito separatamente. </li></ol></li><li> Posizionare il tessuto epiteliale sezionato in un tubo da centrifuga conica (50 ml o 15 ml) con il tessuto comprendendo non superiore ad un terzo del volume del tubo. Portare il tubo fino a volume, lasciando solo un piccolo spazio d&#39;aria per consentire la miscelazione durante la rotazione, utilizzando una miscela di digestione tessutale (DME/F-12 o equivalente, 10 pg / ml di insulina, antibiotici come sopra, e la concentrazione finale di 10 % FCS, 200 U / ml di collagenasi greggio e 100 U / ml ialuronidasi. </li><li> Posizionare le provette su un rotatore tubo HulaMixer e ruotare a 360 ° a 8 giri durante la notte a 37 ° C. </li><li> Centrifugare le provette a 600 xg per 5 min. Eliminare il grasso supernatante e medio termine per lo smaltimento secondozione alle norme istituzionali. </li><li> Controllare il completamento della digestione diluendo una piccola aliquota del pellet in mezzo. Digestione è completa quando l&#39;esame microscopico mostra grumi di cellule (organoidi) con strutture liscia appare duttali, alveolare, o duttale-alveolare liberi da allegata stroma (Figura 1A). Tessuti mastoplastica riduttiva di solito mostrano ancora stroma allegato dopo la digestione durante la notte e richiederà ancora del tempo di digestione. <ol class="lalpha"><li> Risospendere il pellet non digeriti in miscela fresca di digestione tessutale e re-incubare con rotazione a 37 ° C per un&#39;altra ora 4-12. Ripetere i punti 1.6 e 1.7. Se la digestione è ancora incompleta, aggiungere nuovamente miscela di digestione al pellet e re-incubare con rotazione a 37 ° C per una notte. La concentrazione di enzimi può essere ridotta per evitare sovratensioni digestione overnight. </li></ol></li><li> Quando la digestione è completa, centrifugare le provette a 600 xg per 5 minuti, aspirare il digestione mix, Risospendere il pellet in media, più antibiotici a circa 15 ml/50 ml tubetto, 5 ml/15 ml tubetto. </li></ol> 2. Filtrazione e congelamento di materiale digerito <ol><li> Trasferire aliquote di sedimento risospeso su una sterile filtro da 100 micron su un tubo da 50 ml sterile. Far defluire medie nel tubo, poi rilavare le organoidi il top 1-2x volte con 2-3 ml di terreno. Ripetere finché tutti i pellet risospeso è stato trasferito. Se ci sono troppe organoidi sul filtro e il mezzo più drena facilmente, utilizzare un nuovo filtro (s) per il materiale rimanente. Capovolgere con attenzione il filtro (s) su un&#39;altra provetta sterile e lavare i organoidi nel tubo con più media. Questo è il 100 Piscina organoid pm. </li><li> Prendere il materiale che drenato nel tubo originale 50 ml e ripetere il processo di 2,1 utilizzando un filtro 40 micron, per ottenere la piscina organoid 40 micron, che contiene principalmente strutture alveolari. Il materiale scaricato in thtubo e costituisce la piscina filtrato, che contiene singoli ciuffi / piccola di cellule mesenchimali ed epiteliali e piccoli pezzi di sistema vascolare. </li><li> I pellet 100 pm, 40 pm, e piscine filtrato a 600 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il supernatante, ricostituire ciascuna provetta in CPM II (DME/F-12 o equivalente con 44% FCS e il 6% DMSO) con circa 1 ml di CPMII per 0,1 ml di pellet imballato. Conservare a 4 ° C. </li><li> Seed un piatto di prova per le 2 piscine organoid ponendo 0,1 ml di materiale risospeso in 35 mm goccia piatto di coltura dei tessuti in plastica a goccia come in 3.2. La piscina filtrato può essere direttamente seminate su plastica con terreno di coltura tissutale di fibroblasti (DME/F-12 o equivalente con 10 pg / ml di insulina e il 10% FBS). </li><li> Aliquotare il restante materiale risospeso in fiale Nunc congelamento tipo (1 ml / fiala da 2 ml). Congelare la notte a -80 ° C e poi a trasferire rapidamente conservazione in azoto liquido. Non abbiamo osservato alcuna significativa perdita di vitalitànelle nostre fiale originali congelati dalla fine degli anni 1970. </li></ol> 3. Semina organoidi surgelati e Subculture delle colture primarie <ol><li> Scongelare rapidamente la fiala contenente i organoidi congelato in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Le sementi organoidi in 2 a 10 (di solito ~ 6) 60 mm, piatti o 1-3 piatti 100 mm, a seconda stima visiva del numero di organoidi nella fiala. Organoidi circa 20-40 seminate in ogni antenna di 60 mm è ottimale. </li><li> Organoidi scongelati sono accuratamente messi, goccia a goccia, sulla superficie piatto con una pipetta da 1 ml o pipetta Pasteur per una distribuzione uniforme della organoidi. Organoidi accostate avrà uno spazio limitato per conseguenza, dando luogo a un minor numero di cellule sottocultura o congelamento. Evitare di graffiare la superficie del piatto (le cellule tendono a non crescere oltre superfici graffiate). Attendere 1-2 minuti per consentire ai organoidi da allegare e poi aggiungere lentamente mezzo di crescita per evitare di spostare le organoidi (ad esempio 2-3 ml/60 piatto mm). Ioncubate a 37 ° C in incubatore umidificato CO 2. Queste sono le colture primarie. Al momento stiamo utilizzando M87A + ossitocina (X) mezzo per la crescita più robusta HMEC (Figura 2). </li><li> Dopo 1 giorno, controllare che i organoidi sono allegati. Aggiungere mezzo supplementari (ad esempio 2-3 ml/60 piatto mm). Migrazione cellulare dalle organoidi dovrebbero essere visibili da 24-48 ore, e la crescita mitotica 48-72 ore dopo la semina (Figura 1B, C). A volte attacco è scarsa dopo 24 ore, in particolare se placcatura organoidi overdigested o organoidi da donne anziane, ma la maggior parte preparati allegherà entro 72 ore. Piccoli pezzi di vascolarizzazione possono attaccare e dare origine a outgrowth fibroblasti cellule (Figura 1D). </li><li> Alimentare culture almeno 3 volte alla settimana. Le cellule coltivate in M87A-tipo di supporto crescere fino a confluenza vicino entro 5-8 giorni, a seconda della densità di semina. </li><li> Se vi è significativa crescita dei fibroblasti, tripsinizzazione differenziale (DT), basato suldistacco rapido fibroblasti dalla superficie plastica, è necessario rimuovere i fibroblasti. Quando le macchie epiteliali diventano grandi mezzi di comunicazione, aspirato, piatto di lavaggio (ad esempio, 1-2 ml/60 piatto mm) con STE (soluzione salina, 0,05% tripsina, 0,02% EDTA), aspirato, aggiungere fresco STE 0,5 ml e lasciare a temperatura ambiente per circa 1 min con continua osservazione microscopica. Quando i fibroblasti staccare le cellule epiteliali, ma sono ancora aderenti, delicatamente ma nettamente battere il lato del piatto contro una superficie dura per rimuovere i fibroblasti e quindi rapidamente aspirare. Risciacquare una volta con PBS, e aspirare nuovamente. Culture pesantemente contaminati con fibroblasti può essere necessario un ulteriore DT. </li><li> Subculture colture primarie quando grandi macchie epiteliali sono presenti, ma prima di confluenza. La densità di semina organoid e attaccamento influenza il tempo necessario. Per mantenere la coltura primaria e per generare più colture secondarie, distanziati nel tempo, eseguire Trypsinizations parziali (PT). </li><li> Aspirare il terreno, lavare un piatto di 60 mm con 1-2 STE ml, aggiungere 0,5 ml STE fresco di piatto. Osservare distacco delle cellule al microscopio a temperatura ambiente per 1-5 min, con colpi delicato del piatto per promuovere distacco cellulare. Tripsinizzazione deve essere interrotto quando ~ 50% delle cellule sono staccate. All&#39;inizio TP di solito hanno un rapido distacco delle cellule. Per la successiva TP, le cellule possono essere posizionati a 37 ° C per una più rapida distacco, con attento monitoraggio, come tutte le cellule possono venire rapidamente. </li><li> Aggiungere 2 ml di siero contenenti i media al piatto, repipette per lavare, e versare in un tubo sterile 15 ml. Ripetere 2x con altri mezzi ~ 1-2 ml, aggiungendo il lavaggio al tubo. Rialimentazione il piatto principale e tornare alla incubatrice. Contare le cellule nel tubo con l&#39;emocitometro. PT può essere ripetuto circa 4 a 8 volte con una buona ricrescita delle cellule nei piatti primari e equivalente crescita a lungo termine dei secondari subcoltura o congelate (cellule di secondo passaggio sono chiamati secondari, una volta reinoculate, le cellule non sono loprimarie nger). Una volta organoid materiale non è più presente nelle colture primarie, secondarie subcoltura mostrano un calo potenziale a lungo termine della popolazione raddoppio. </li><li><ol class="lalpha"><li> Per sottocultura di secondari, le cellule di semi direttamente dal tubetto in piatti. Semina di 1-2 x 10 5 cells/100 piatto mm in un mezzo robusto come M87A + X porterà a confluenza in 4-7 giorni. Aggiungiamo tossina del colera al mezzo di secondo passaggio per accrescere il potenziale proliferativo, tossina colerica è omesso in coltura primaria perché porta alla conseguenza cella multilivello dalle organoidi. </li><li> Per congelamento come secondari, tubo pellet a 600 xg per 5 min, e risospendere in CPMII con una densità finale di 10 6 cellule / ml. Aliquotare cellule risospese in fiale tipo Nunc congelamento, congelare per una notte a -80 ° C e poi trasferire rapidamente allo stoccaggio in azoto liquido. </li></ol></li><li> Si consiglia di congelare le cellule del PT prima custodia, eutilizzare cellule dal PT seconda sottocultura. Ulteriori terminali possono essere congelati per un uso futuro. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;umano mammario metodo di lavorazione dei tessuti qui presentato permette di ottenere pure cellule epiteliali mammarie derivante dalla commistione eterogenea di tipi di cellule nel cuore umano. Filtrazione attraverso i pori di dimensione fissa consente la separazione delle diverse frazioni della ghiandola mammaria (ad esempio, duttale e dotto-alveolare vs alveolare) della matrice stromale digerito. Isogeniche fibroblasti mammaria può essere ottenuta per abbinare le cellule epiteliali. Congelato materiale digerito ha mantenuto una buona vitalità da oltre 30 anni. Questo metodo ha lavorato con successo su tutti i tessuti mammari, ma molto fibrosi, ed è semplice da eseguire. Altre variazioni della lavorazione dei tessuti mammario esistono che non forniscono frazioni epiteliali che sono il più vitale, pulito, o separati. Collocamento di organoidi trasformati in coltura con bassi stressanti media come M87A permette crescita a lungo termine del HMEC lignaggio con marcatori multipli. HMEC che sono state coltivate su plastica ancora mantengono la capacità di generite strutture 3D con normale in vivo-come rapporti lignaggio. Queste culture HMEC sono adatti per un&#39;ampia indagine sperimentale, tra cui ad alto rendimento, di normale comportamento HMEC e fattori che possono inibire o spingono senescenza e trasformazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Vetro Petri 15 centimetri </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Scissors 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Pinze 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Bisturi monouso </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / streptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polimixina B solfato </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> Tripsina 0,05% 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Cella filtro 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Cella filtro 40 micron </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Provette 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Provette 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> Piatti TC 10 centimetri </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> Piatti TC 6 centimetri </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Fiale criogeniche </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser scientifico </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf modello </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Esame sperimentale di normale umano cellule epiteliali mammarie (HMEC) comportamento, e come le cellule normali acquisire proprietà anormali, può essere facilitato in sistemi di coltura in vitro che più accuratamente modello in biologia vivo. L&#39;uso di materiale derivato umano per studiare la differenziazione cellulare, invecchiamento, senescenza, e immortalizzazione è particolarmente vantaggiosa dato le molte differenze significative di queste proprietà molecolari tra cellule di roditore umane e comunemente utilizzati 1-2. Cellule mammarie presentano un comodo sistema di modello perché grandi quantità di tessuti normali e anormali sono disponibili a causa della frequenza di mastoplastica riduttiva e ambulatori mastectomia. La ghiandola mammaria è costituito da una miscela complessa di molti tipi cellulari distinti, ad esempio, epiteliale, mesenchimale, adipose, endoteliali. Le cellule epiteliali sono responsabili della funzione differenziata mammaria di lattazione,e sono anche all&#39;origine della maggior parte dei tumori mammari umani. Abbiamo sviluppato metodi per trattare i tessuti mammari scarto chirurgica della ghiandola in puri elementi epiteliali e cellule mesenchimali 3. Il materiale trattato può essere conservato congelato a tempo indeterminato, o avviate in coltura primaria. Materiale di scarto chirurgico viene trasportato al laboratorio e manualmente sezionato per arricchire di tessuto epiteliale che lo contiene. Successiva digestione del tessuto sezionato con collagenasi e ialuronidasi materiale strisce stromale dal epiteli alla membrana basale. I pezzi risultanti piccoli dell&#39;albero epiteliale (organoidi) può essere separato dal stroma digerito sequenziale per filtrazione su membrane di porosità fissa. A seconda delle dimensioni dei pori, frazioni possono essere ottenute costituito grandi duttali / alveolare pezzi più piccoli, cluster alveolari, o cellule stromali. Abbiamo osservato una crescita superiore in cui le culture vengono avviate come organoidi piuttosto che come dissociated singole cellule. Collocamento di organoidi nella cultura che utilizzano piccole-stress che inducono i media supporta crescita a lungo termine del HMEC normale con marcatori di lineage diversi tipi (mioepiteliali, luminale, progenitore) 4-5. Un numero sufficiente di cellule possono essere ottenute dal tessuto di un individuo per permettere ampia esame sperimentale utilizzando lotti cellulari standardizzati, nonché di interrogazione utilizzando modalità ad alto rendimento. HMEC coltivata sono stati impiegati in una vasta gamma di studi che hanno esaminato i normali processi che regolano la crescita, la differenziazione, l&#39;invecchiamento e la senescenza, e come questi processi normali sono stati alterati durante la trasformazione immortale e maligna 4-15,16. Gli effetti della crescita in presenza di materiale di matrice extracellulare, altri tipi cellulari, e / o di cultura 3D può essere confrontato con la crescita su plastica 5,15. HMEC Colta, a partire da cellule normali, fornire un sistema sperimentale trattabili per esaminare i fattori chepuò spingere o prevenire l&#39;invecchiamento umano e carcinogenesi.

Figure rappresentative per tessuti adeguatamente digeriti a organoidi e posti in coltura sono mostrati nella Figura 1. Tessuto non completamente digerito mostrerà materiale ancora applicata all&#39;esterno di queste strutture, e probabilmente un po &#39;la crescita fibroblastica cellule in coltura primaria, che richiede DT da rimuovere. Tessuto Overdigested mostrerà frontiere esterne meno liscia, e potrebbe richiedere più tempo per fissare in coltura primaria. Conseguenza epiteliale dovrebbe iniziare entro 48-72 ore (1B, C). Piccoli pezzi di vascolarizzazione (1D) può essere una fonte di conseguenza cellule mesenchimali. Escrescenze epiteliali mostrano popolazioni morfologicamente eterogenee, con le popolazioni proliferative che contengono miscele di cellule con marcatori associati a mioepiteliali, progenitore, e lignaggi luminale (1E, 3C-E). La crescita dei mezzi di comunicazione di stress basse come M87A integrati con la tossina del colera e l&#39;ossitocina sosterrà superiore a lungo terminecrescita del normale pre-stasi HMEC rispetto alle precedenti formulazioni media (Figura 2). M87A-tipo di supporto anche sostenere la crescita delle cellule progenitrici luminali e attraverso passaggi 4-8 (Figure 3C-E, 4), in seguito, la maggior parte delle cellule mostrano i marcatori lignaggio solo mioepiteliali. HMEC coltivate su plastica possono mantenere la loro capacità di formare 3D corretta autorganizzazione in micropatterned 3D pozzetti con cellule luminali interni alle cellule mioepiteliali (Figura 4A, B), e di formare strutture organizzate quando piastrate in Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Organoidi HMEC e la cultura primaria. (A) Organoid mostrano duttale-alveolare struttura dopo la digestione e la filtrazione. (B, C) che mostrano organoidi struttura alveolare duttale e 2 giorni dopo il posizionamento in coltura primaria, di notare la outgr cella inizialeowth (frecce bianche). (D) vaso sanguigno piccolo attaccato e con l&#39;avvio conseguenza fibroblasti da culture stesse B, C. (E) escrescenza delle cellule epiteliali dalla cultura organoid primario dopo 4 giorni. Lignaggi sono identificati da colorazione con anticorpi anti-K14 (rosso) e K19 (verde); nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Luminal (K14-/K19 +, verde), mioepiteliali (+ K14 / K19-, rosso), e progenitore (+ K14 / K19 +, giallo), le cellule sono visibili. Cellule non marcate vengono osservati nel nucleo organoid dovuta alla penetrazione anticorpo incompleto. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Organoidi crescita di culture HMEC in diverse formulazioni dei media. Ottenuti da un individuo, campione 184, sono stati avviati in coltura primaria con diverse formulazioni media. Migliore crescita a lungo termine è ottenuto utilizzando la nostra formulazione più recente, M87A + ossitocina (X) 4. Questo terreno supporta anchecrescita di linee multiple HMEC (vedi fig. 1E). Un precedente formulazione dei media, MM 3, a condizione di crescita meno robusta, mentre un privi di siero media, MCDB170 (commerciale MEGM) 17 porta alla rapida induzione della chinasi ciclina inibitore p16 INK4A e selezione per le cellule aberranti 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figura 3. Confronto di diversità lignaggio in organoidi incolti e HMEC coltivate a 4 analisi ° passaggio. (A, B) FACS di un incolto, organoid dissociato enzimaticamente per (A) espressione di EpCAM e CD49f/alpha 6 integrina, e (B) CD227/Muc1 e CD10/CALLA. (C, D) analisi FACS di 4 ° passaggio pre-stasi HMEC per l&#39;espressione di (C) e EpCAM CD49f/alpha 6 integrina, e (D) e CD227/Muc1 CD10/CALLA. P identificabiliopulations sono etichettati come LEP (che esprime luminale marcatori EpCAM o CD227), MEP (che esprime mioepiteliali marcatori CD49f o CD10), o PROG (arricchito in CD49f + / + EpCAM popolazione). Si noti che durante l&#39;adeguamento alla regolamentazione cultura dei cambiamenti EpCAM e CD49f rispetto al organoidi incolte. (E) Unsorted HMEC e FACS arricchito di LEP e MEP al 4 ° passaggio colorati per l&#39;analisi di immunofluorescenza di cheratina K14 (MEP marker) e K19 (LEP marcatore) per verificare l&#39;identificazione lignaggio. Macchiato nuclei con DAPI appaiono blu. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figura 4. HMEC coltivate sono capaci di formare strutture organizzate in vivo con simili rapporti lignaggio quando messo in microambienti adeguati. (A) Pre-stasi 4 ° passaggio HMEC erano FACS arricchito into luminale LEP e lignaggi MEP mioepiteliali per mezzo di marcatori per CD227 e CD10, con questi lignaggi verificati da espressione di K14 e K19 (non mostrato). (B) In caso di miscela insieme in micropatterned pozzetti, le cellule in coltura sono stati in grado di auto-organizzazione in doppi strati con MEP sulla parte esterna e interna LEP [adattato da Chanson et al. 5]. Marcato in modo fluorescente LEP (verde) e MEP (rosso) sono stati ripresi con un microscopio confocale a 0 ore, 24 ore, e 48 ore dopo l&#39;aggiunta al micropozzetti (superiore). Controllo HMEC sono stati arbitrariamente etichettati con etichette fluorescenti rossi o verdi (in basso). (C) campo immagine luminosa di FACS arricchiti di cellule progenitrici (cKit +) placcato in 3D (Matrigel) cultura e coltivate per 18 giorni. Strutture risultanti possono presentare morfogenesi alveolare. (D) Le strutture sono stati estratti da Matrigel e colorate per rilevare K14 e K19; nuclei sono state contrastate con DAPI. Analisi di immunofluorescenza mostra strutture organizzate con la corretta pola luminale e basalirezza.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Un metodo per elaborare materiale mammaria umana scarto chirurgica viene descritto. Tessuti trattati, in forma di organoidi, possono essere congelati indefinitamente o posto in coltura per crescita a lungo termine. Questo metodo consente esame sperimentale di biologia umana normale delle cellule epiteliali, e gli effetti delle perturbazioni esogene.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

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Medicine

16.4K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory. Un metodo per elaborare materiale mammaria umana scarto chirurgica viene descritto. Tessuti trattati, in forma di organoidi, possono essere congelati indefinitamente o posto in coltura per crescita a lungo termine. Questo metodo consente esame sperimentale di biologia umana normale delle cellule epiteliali, e gli effetti delle perturbazioni esogene.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

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Medicina

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolamento, Cultura e Imaging di Human Fetal pancreatici gruppi di cellule

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Cultura primario di Human vestibolare Schwannomi

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Umana Dupuytren di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per lo Studio dei miofibroblasti e matrice extracellulare Interazioni

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Un modello di cultura organica fetta di Glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente di farmaci antiinvasivi

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodologia per l'induzione dell'espettorato e laboratorio di lavorazione

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...