Gli autori ringraziano M. Fiche di Ospedale universitario di Losanna per fornire la fotografia mastoplastica, M. Wirth e A. Ayyanan dell&#39;Istituto svizzero per la ricerca sperimentale sul cancro, Centro Nazionale di Competenza nella Ricerca Oncologia Molecolare, Facoltà di Scienze della Vita, Ecole Polytechnique Fédérale de Losanna per l&#39;assistenza tecnica e R. Clarke dell&#39;Università di Manchester per i commenti critici. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno di SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, e l&#39;iniziativa sui medicinali innovativi impresa comune nell&#39;ambito dell&#39;accordo di concessione n. 115.188, le risorse di cui si compone del contributo finanziario dal Settimo Programma Quadro dell&#39;Unione Europea (FP7 / 2007-2013) e la Federazione europea delle industrie e associazioni farmaceutiche aziende in contributi in natura. L&#39;indirizzo web di medicinali innovativi è <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

Considerazioni generali: prima del tempo, istituire un protocollo etico, preparano questionari per i pazienti, e vedere per la formazione del personale clinico. Prima di usare il materiale dalla chirurgia mastoplastica riduttiva, procurarsi le autorizzazioni, e garantire il consenso del paziente. Tissue può essere contagioso e deve essere gestito di conseguenza. Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico di ISREC - Istituto svizzero di ricerca sperimentale sul cancro. 1. Tissue Recupero, lavorazione e Bio-banking Per garantire la qualità del campione ottimale per la bio-banking, una serie di misure vengono effettuate in ospedale prima del trasporto al laboratorio. All&#39;ospedale: <ol><li> Ottenere tessuti mammari umani in condizioni sterili da campioni di chirurgia mastoplastica riduttiva e sangue, se necessario. Tissue ha bisogno di essere esaminato da patologo che campione per escludere la presenza di lesioni maligne. </li><li> Posizionare la t senorilasciare sotto il cofano su una tavola sterili e preparare forbici, bisturi chirurgici e pinze che sono già sterilizzati con sterilizzatore a vapore. Fai taglio profondo in diversi siti del tessuto mammario con un bisturi per aprirlo. Nel tessuto mammario umano cercare filamenti bianchi, comprensivi di condotti e lobuli, che sono incorporati nel tessuto adiposo giallo. NOTA: Il rapporto tra il parenchimale bianco al tessuto adiposo giallo differisce tra le donne; in genere le donne più giovani hanno più tessuto epiteliale. </li><li> Scegli pezzi di materiale bianco e tenerli con una pinza, poi separarli delicatamente dal tessuto adiposo con le forbici. Evitare di prendere i vasi sanguigni. </li><li> Sciacquare pezzi di tessuto in PBS (PBS) pH 7,2 per rimuovere il sangue. Trasferire il tessuto di bottiglie di plastica da 250 ml contenenti mezzo F12 (Medium F12 Modified Eagle di Dulbecco) senza rosso con 2% di penicillina / streptomicina fenolo (comprese 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 g / ml di streptomicina) e l&#39;1% di unantibiotica / amfotericina B (comprese le 10.000 unità / ml di penicillina, 10.000 mg / ml di streptomicina, e 25 mg / ml di amfotericina B). Negozio tessuti nel mezzo per il trasporto al laboratorio. </li><li> Preparare pezzi di 3 - 5 mm di diametro per l&#39;estrazione di RNA e proteine ​​e flash congelarli in cryovials con il freddo (ghiaccio secco) isopentano. Trasferirli contenitore di ghiaccio secco per il trasporto al laboratorio. </li><li> Mettete i pezzi di 3-5 mm nel stampo e coprire con uno strato di Optimal taglio temperatura (OCT) e quindi inserire la muffa sul fondo piatto della scatola piena di isopentano freddo. Dopo aver completato il trasferimento di congelamento dello stampo alla casella ghiaccio secco. </li><li> Fissare 5 pezzi di 3 - 5 mm di diametro in paraformaldeide (PFA) 4% e altri 5 pezzi in formaldeide (FA) 4% in PBS a RT analisi istologica seguito. Due diversi fissativi sono raccomandati in alcuni anticorpi funzionano meglio con uno o l&#39;altro dei due. </li></ol> In laboratorio: <ol start="8"><li> Farecumento tutte le informazioni sulla mastoplastica riduttiva, data di chirurgia e se i campioni sono derivati ​​da sinistra contro mammella destra. </li><li> Posizionare i campioni congelati a -80 ° C e trasferire i tessuti fissi in cassette istologici dopo 2 ore di fissazione. Poi metterli sia in PBS o etanolo al 70%, per O / storage N a 4 ° C. Il giorno successivo, il trasferimento le cassette istologici alle strutture istologici per paraffina. </li></ol> 2. Tissue Digestione e stimolazione ormonale <ol><li> Trasferire le bottiglie contenenti i campioni di tessuto a un armadio flusso laminare in una camera di coltura cellulare P2. Mettere i pezzi di tessuto sul tagliere sterile (29 x 19 cm). Tenere il materiale con una pinza e raschiare il grasso e vasi rimanendo lontano dal parenchima mammario (parte bianca) con il bisturi. Posizionare il materiale bianco in PBS in un piatto di cultura 10 cm. </li><li> Dopo aver rimosso il materiale grasso da tutti i pezzi e disporli secondo la regola di sicurezzas del laboratorio, posizionare le parti bianche contenenti i tessuti epiteliali di nuovo sul tagliere. Utilizzando bisturi opposte tagliare il tessuto e tagliarla a pezzi di diametro fino a 2 mm. </li><li> Il materiale macinato in provette di dimensioni adeguate: fino a 1, 2,5 e 10 ml in un 5, 15 o 50 ml tubi, rispettivamente. Tipicamente a 5 ml rendimenti tubo di materiale sufficiente per paraffina embedment e ormonali stimoli, e 15 ml produce tubo di materiale sufficiente per fluorescenza cellulare Attivato (FACS). Tubi più grandi sono utilizzati per il congelamento aliquote. </li><li> Preparare master mix digestione composto di media (DMEM / F12 senza rosso fenolo) con 1% di penicillina / streptomicina / amfotericina B e collagenasi A (Clostridiopeptidase A da Clostridium histolyticum). Dose collagenasi secondo i tempi di digestione. <ol><li> Per 12, 24, e 36 h di incubazione, utilizzare concentrazione finale di collagenasi di 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml e 0,5 mg / ml. Aggiungere mix digestione padrone fino a 4 volte ilvolume del materiale digerito per garantire un&#39;adeguata agitazione e aerazione. NOTA: A seconda del disegno sperimentale e la durata della stimolazione ormonale, aggiungere ormoni durante o dopo la digestione enzimatica fase e microstruttura recupero. </li></ol></li><li> Aggiungere ormone (s) alla concentrazione desiderata per testare campioni ed il veicolo al controllo. Per la stimolazione con 17-β-estradiolo, e promegestone (R5020) utilizzare una concentrazione finale di 20 nM. NOTA: R5020 è un agonista del recettore del progesterone sintetica, che è più stabile del progesterone naturale in mezzo. <ol><li> Porre le provette del mixer rullo interno un incubatore a 37 ° C e 40 rpm O / N. Prima di mettere i campioni del mixer, li risospendere molto bene per garantire che tutto il materiale distribuisce lungo le provette. </li></ol></li><li> Come digestione richiede almeno 12 ore (O / N), per tempi di stimolazione ormonale inferiori a 12 ore, aggiungere gli ormoni dopo il recupero delle microstrutture (decoda sotto il punto 3). Aggiungere gli ormoni, come si sospendere nuovamente le microstrutture e posizionare la sospensione su piastre di fissaggio ultra-basse. Microstrutture tessuti possono essere conservati su piastre di fissaggio ultra-bassi per un massimo di 7 giorni in mezzo di crescita-libera-factor di conservazione di circa il 70% della redditività. </li><li> Per RNA e l&#39;analisi delle proteine, raccogliere microstrutture tessuti per centrifugazione a 400 xg per 5 minuti e flash freeze in provette. </li></ol> 3. Recupero di microstrutture del tessuto <ol><li> Centrifugare il tubo (s) a 400 xg per 5 min. Aspirare il grasso dalla parte superiore della provetta e trasferire il supernatante del surnatante acquoso rimanente, che si arricchisce in fibroblasti, in un provetta da centrifuga e centrifugare a 1250 xg per 5 min. NOTA: le microstrutture del tessuto del seno sono molto appiccicoso, per tutte le fasi successive risospendere il pellet agitando delicatamente il tubo. Pipettaggio non è raccomandato a causa del rischio di perdere materiale. </li&gt; <li> Risospendere il pellet arricchiti in microstrutture ed in fibroblasti derivati ​​da surnatante acquoso in PBS, 2% Fetal Calf Serum (FCS). Successivamente girare entrambi i tubi a 1.250 xg per 5 minuti e poi scarta il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 3 - 5 ml rosso tampone di lisi del sangue cellulare e trasferirli a pulire i tubi. Li Incubare per 5 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 2x volume di PBS, 2% FCS e centrifugare a 1250 xg per 5 min. Lavare il pellet con PBS, 2% FCS e centrifugare a 1250 xg per 5 min. Ripetere questa operazione due volte. </li></ol> 4. I campioni di Citometria a Flusso <ol><li> Aggiungere 1 - 2 ml di tripsina 0,25% al ​​pellet e mescolare pipettando su e giù delicatamente per 2 minuti con una Pipetman 1.000 microlitri a dissociarsi cellule. </li><li> Inibire l&#39;attività tripsina aggiungendo 9 ml PBS, 2% FCS. Centrifugare a 450 xg per 5 min e risospendere il pellet in 10 ml di PBS, 2% FCS. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare su un filtro cella 40 micron posto su top di un tubo da centrifuga da 50 ml per preparare singole cellule. Se pochi microlitri di sospensione cellulare rimangono sulla sommità del filtro, aiutare passano attraverso il filtro da essi aspirando dall&#39;altro lato del filtro con una pipetta e aggiungere alle microstrutture filtrati. </li><li> Cellule immunitarie separati, fibroblasti e cellule endoteliali di microstrutture con un cocktail di anti-CD45, anti-FAP e anti-CD31 anticorpi e poi ordinare con FACS, sulla base di pan-epiteliale EpCAM marcatore CD10 e di separare le cellule luminali e basali, rispettivamente 10 . </li></ol> 5. I campioni di Istologia <ol><li> Dopo aver lavato il materiale meccanicamente enzimaticamente digerito come sopra descritto, fissare pellets da 1,5 ml materiale iniziale in 1 ml di 4% PFA in PBS a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare a 1.250 xg per 5 minuti e lavare con 1-2 ml di PBS due volte. </li><li> Centrifugare a 16.000 xg per 10 min. Durante questo tempo, preparare 1% polivalente agarosio in Tris-acetato-EDTA (TAE) tampone e riscaldare la soluzione nel forno a microonde fino a quando la soluzione viene a ebollizione. <ol><li> Rimuovere la soluzione dal forno a microonde e agitare il matraccio delicatamente per miscelare la soluzione e risospendere le particelle rimanenti agarosio. Soluzione di agarosio Raffreddare a 50 ° C e versare 1 ml in uno stampo di base di paraffina dimensionato 31 × 23 × 13,5 millimetri. </li></ol></li><li> Eliminare il supernatante e posizionare i pellet sopra dello strato solidificato (1 - 3 mm) di agarosio utilizzando una spatola con un&#39;estremità piatta. Tutti Coprire con un ulteriore strato di agarosio (40 ° C). </li><li> Dopo le solidifica agarosio, di solito entro 5 minuti, mettere i blocchi agarosio nelle cassette per istologia paraffina incastro. Insieme con i campioni di agarosio posto un ufficio carta bianca nella cassetta con tutte le informazioni sul numero mastoplastica riduttiva, condizione sperimentale, e la data scritta in lettere minuscole a matita; questa scrittura resiste tutte le fasi di trattamento successive. </li><li> Mettere le cassette inPBS O / N, o in 70% di etanolo per immagazzinaggio durante il fine settimana, a 4 ° C. Non abbiamo notato alcuna differenza tra le due soluzioni di memorizzazione. Poi il trasferimento cassette istologici alle strutture istologici per paraffina. </li></ol> 6. microstrutture congelamento (Future) la coltura <ol><li> Risospendere microstrutture del tessuto a congelamento mezzo costituito da FCS con il 10% dimetilsolfossido (DMSO) e congelare 1 ml aliquote in cryovials. Il numero di cryovials ottenuti dipende dalla quantità di materiale primario ottenuto da mastoplastica riduttiva. </li><li> Bloccare le cryovials contenenti microstrutture tessuto utilizzando un tasso freezer controllata con il seguente programma: 5 min dimora a 4 ° C, diminuendo la temperatura a -7 ° C con velocità di 6 ° C / min, diminuendo la temperatura a -12 ° C con velocità di 6 ° C / min, 10 min dimora, diminuendo la temperatura a -40 ° C con velocità di 6 ° C / min, diminuzione della temperatura a -80 ° C convelocità di 6 ° C / min. Poi trasferire i cryovials a -80 ° C freezer. </li><li> Il giorno dopo, trasferire i cryovials da -80 ° C a serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo. </li></ol>

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C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+the+FACS:+a+devil+in+the+details.">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La cultura ex vivo qui descritto fornisce microstrutture del tessuto del seno contenenti dotti e lobuli intatte, insieme ad altri tipi di cellule che normalmente si trovano in seno femminile umano. Nella lavorazione del tessuto mammario umano normalmente ottenuti da mammoplastiche riduzione, rimozione del tessuto adiposo, la digestione enzimatica e meccanica della matrice stromale, e lisi dei globuli rossi arricchisce per frammenti condotto latte e unità lobulare duttali terminali. Digestione enzimatica Gentle...

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Marie Shamsheddin

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Informazioni sul paesaggio mutazionale di cancro al seno sta aumentando a ritmi sostenuti. Meno attenzione è stata rivolta a fattori sistemici che influenzano lo sviluppo del cancro al seno. L&#39;esposizione agli ormoni riproduttivi ha un impatto importante sulla progressione della malattia 1-3. Tuttavia, i meccanismi con cui gli ormoni riproduttivi incidono sul seno umano sono poco conosciuti. Lavora con modelli di topo geneticamente ha rivelato che coinvolgono cellule segnalazione intrinseca e paracrine attraverso diversi effettori a valle 4. La conoscenza limitata su azione ormonale nel seno umano è in gran parte attribuibile alla mancanza di modelli adeguati. Maggior parte dei lavori sui meccanismi di recettore per gli estrogeni (ER) e del recettore del progesterone (PR) segnalazione è stata eseguita con linee di cellule del recettore dell&#39;ormone positivi cancro al seno, come MCF-7 e T47D. Questi sono stati ottenuti da versamento pleurico di pazienti con carcinoma mammario avanzato che aveva already ricevuto trattamenti multipli 5. La rilevanza biologica dei risultati di tali modelli semplici in vitro del seno umano è geni discutibili e bersaglio identificati in questi modelli in vitro sono differiscono da geni bersaglio che sono identificati in modelli animali 6. Quando le cellule epiteliali mammarie umane primaria sono coltivati ​​in vitro tendono a perdere l&#39;espressione del recettore ormonale e, quindi, la risposta ormonale 7,8. Questo problema può essere circumventd da approcci 3D sofisticati con matrigel. In questo modo, C. Clarke e colleghi sono riusciti a stabilire cellule epiteliali mammarie che hanno mantenuto l&#39;espressione del recettore ormonale e hanno mostrato una risposta proliferativa di progesterone stimolazione 9. Tuttavia, due importanti in vivo dei recettori del progesterone geni bersaglio, Wnt-4 e RANKL, non sono state indotte dopo stimolazione progesterone in questo sistema 9. Questo approccio è stato recentemente approvato ulteriormente con in vitro </em&gt; ormone pretrattamento e induzione RANKL è stato raggiunto 10. Un avvertimento resta che matrigel ha attività che dipendono in batch, è costoso, e richiede un disegno sperimentale che è adatto solo per il numero di cellule piccole. Sulla base della constatazione che in ER vivo e segnalazione PR sono in gran parte mediata da interazioni paracrine 11, abbiamo sostenuto che le interazioni intercellulari devono essere mantenuti. Un altro fattore importante che si perde come tessuti sono correlate alle cellule singole per la cultura in vitro sono le interazioni delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare; ma questi sono cruciali per la differenziazione epiteliale e la loro distruzione è importante nella tumorigenesi 12. Con questo in mente, abbiamo stabilito un metodo per isolare microstrutture del tessuto mammario da fresco materiale chirurgico scarto 13. Il parenchima mammario, costituito da un epitelio doppio strato con luminale interna ed esterna myoepithelicellule al, viene sezionato dal tessuto adiposo e sottoposti alla dissociazione enzimatica e meccanica. Dopo il lavaggio e centrifugazione, frammenti di condotti del latte si ottengono che mantengono una stretta interazione con molte cellule stromali. Queste microstrutture del tessuto rimangono ormone reattivo. Il modello è stato validato in campioni clinici 13. Come tale, il presente procedimento può aiutare a studiare l&#39;azione ormonale nel seno in un contesto biologicamente e clinicamente rilevante.

<table><tbody><tr><td>Microlitre Centrifuge</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td><td>Asymptote&amp;nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>Roller Mixer SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>Histology Cassettes</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Strile Surgical Blade&amp;nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin base mold</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Cell Blood Lysis Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials (5.0 ml)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low attachment culture dish</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

Lo studio di azione dell&#39;ormone nel seno umano è stata ostacolata dalla mancanza di adeguati sistemi modello. Alla cultura in vitro, cellule epiteliali mammarie primarie tendono a perdere l&#39;espressione del recettore dell&#39;ormone. Ampiamente recettore ormone linee di cellule di cancro al seno positivo utilizzati sono di scarsa rilevanza per la situazione in vivo. Qui, descriviamo un modello ex vivo per studiare l&#39;azione di ormoni nel seno umano. Campioni di tessuto mammario umano fresco da materiale di scarto chirurgico quali mammoplastiche riduzione o mammectomies sono meccanicamente ed enzimaticamente digerite per ottenere frammenti di tessuto contenenti dotti e lobuli e molteplici tipi di cellule stromali. Queste microstrutture tessuti conservati in terreno di base senza fattori di crescita mantenere i contatti intercellulari, l&#39;architettura dei tessuti, e rimangono ormone reattivo per diversi giorni. Essi sono facilmente elaborati per l&#39;RNA e l&#39;estrazione di proteine, l&#39;analisi istologica o memorizzati in congelamento medio. Fluorescenzaattivato ordinamento delle cellule (FACS) può essere utilizzato per arricchire per specifiche popolazioni cellulari. Questo protocollo offre un approccio standard semplice per gli studi traslazionali con altamente complessi, variegati campioni umani.

Per studiare il ruolo di estrogeni e progesterone e per capire meglio le loro funzioni molecolari nel seno umano, raccogliamo campioni freschi umani del tessuto del seno da pazienti sottoposti mammoplastiche riduzione (Figura 1) dopo aver ottenuto il loro consenso informato. Abbiamo anche ottenere medica e riproduttiva storia del paziente, così come un campione di sangue per determinare i livelli sierici di progesterone al momento dell&#39;intervento. Tissue da mammoplastiche riduzione freschi è mecca...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Abbiamo sviluppato un nuovo modello di ex vivo per studiare l&#39;azione di ormoni nel seno umano. Si basa su microstrutture tessuti isolati da campioni di tessuto del seno chirurgici che conservano l&#39;architettura del tessuto, le interazioni intercellulari, e segnalazione paracrina.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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Research

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Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.4K Views.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  Abbiamo sviluppato un nuovo modello di ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Si basa su microstrutture tessuti isolati da campioni di tessuto del seno chirurgici che conservano l'architettura del tessuto, le interazioni intercellulari, e segnalazione paracrina. 

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Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Una cultura Modello 3D Ormone-sensibile della Human ghiandola mammaria Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Bioingegneria

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Medicina

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo risposta al trattamento di tumori primari e / o associati per metastasi preclinici e sviluppo clinico di Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Un

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