Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HL44485 e HL28607.

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l&#39;uso degli animali istituzionale. 1. Fabbricazione preliminare di Micropipette, la limitazione dei movimenti, e bloccanti <ol><li> Estrarre diversi tubi capillari di vetro borosilicato pulite in metà con un estrattore elettronico regolato in modo che, quando viene tirato, la porzione allungata del tubo è di circa 1 cm di lunghezza e le due metà sono piuttosto simmetriche. Assicurarsi che il cono è coerente con le dimensioni in figura 1. Utilizzare le due metà per micropipette, la limitazione dei movimenti e bloccanti. <ol><li> Bevel le micropipette con un&#39;aria azionato mola 30 con 0,5 micron carta abrasiva bagnata con acqua. Impostare l&#39;angolo del supporto micropipetta in modo che sia di circa 30 gradi rispetto all&#39;orizzontale. </li><li> Lavare accuratamente e asciugare le micropipette utilizzando aspirazione a tirare acetone pulita attraverso la punta e il pozzo. Ispezionare le micropipette (Figura 1A) con un piccolo microscopio verticale con 4 × 40 × e gli obiettivi dotati di un supporto micropipetta coccodrillo e un reticolo oculare. </li><li> Selezionare le micropipette con apertura punta di circa 50 micron di lunghezza con uno smusso il cui rapporto lunghezza / larghezza è compresa tra 3.1 e 3.5 e con un punto di profonda rastrematura che aiuta a penetrare le fibre di collagene dure nel mesentere. </li><li> Conservare 15-20 micropipette di leggermente diverse dimensioni in una scatola senza polvere. </li></ol></li><li> Fai la limitazione dei movimenti che utilizzano tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare di vetro tirato brevemente vicino a un microfiamma per formare una punta smussata (Figura 1B). Conservare diversi in una scatola senza polvere. </li><li> Fai microoccluders utilizzando tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare tirato sotto un microfiamma e delicatamente piegare (tramite un adattatore tubi, ad es., 23G) la punta fine (circa 4 mm dalla punta) a formare un angolo di quasi 120 gradi all&#39;albero ( <strong&gt; Figura 1C). Marca e memorizzare diversi. </li></ol> Preparazione degli animali 2. e Chirurgia <ol><li> Anestetizzare maschile (350-450 g) o ratti femmina Sprague-Dawley (200-300 g) con sodio pentobarbital (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) per via sottocutanea; proteggere il mesentere non usando iniezione intraperitoneale. </li><li> Nel corso procedure chirurgiche e protocolli sperimentali, mantenere l&#39;anestesia con iniezioni supplementari (30 mg / kg) in base alle esigenze. Determinare profondità dell&#39;anestesia per pizzico piedi o riflesso corneale. Dopo il completamento della procedura sperimentale, eutanasia ratto con pentobarbital sovradosaggio o iniezione intra-cardiaca di cloruro di potassio saturo sotto anestesia. </li></ol> 3. Preparare Soluzioni e eritrociti da utilizzare come flusso Marcatori <ol><li> Preparare la soluzione dei mammiferi di Ringer per superfusate e soluzione di controllo perfusato (mammiferi soluzione di Ringer contenente 10 mg / ml di acido grasso in generegratis albumina sierica bovina, BSA). <ol><li> Filtro perfusato attraverso 0,2 micron filtri siringa per rimuovere le particelle molto piccole che potrebbero bloccare la punta micropipetta; filtrare nel piccolo contenitore pulito. </li></ol></li><li> Preparare eritrociti disegnando circa 0,2 ml di sangue dalla vena della coda del topo anestetizzato in un ago 20G in una piccola siringa contenente 0,05 ml di eparina (1.000 U / ml) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente circa 14 ml di mammifero soluzione Ringer . <ol><li> Centrifuga per imballare delicatamente le cellule rosse (circa max 200 × g per 7 minuti). Aspirare il surnatante e risospendere i globuli rossi in soluzione di Ringer. </li><li> Dopo centrifugazione e la rimozione del supernatante tre volte lasciano i globuli rossi concentrati nella parte inferiore del tubo per un uso successivo. Si noti che questa procedura riduce piastrine nei perfusates finali a meno dello 0,1% dei livelli normali 31. </li></ol></li></ol> 4. Disporre il tessuto sul AnimalVassoio <ol><li> Radere l&#39;addome del topo anestetizzato da sotto l&#39;ombelico al processo xifoideo. Assicurarsi che l&#39;area rasata estende intorno al lato destro (per ratto posto sul lato destro) in modo che i capelli non forma uno stoppino per disegnare il superfusate fuori del tessuto ben. Rimuovere i peli tagliati con una garza bagnata o tessuto. <ol><li> Tenere la pelle con un ottuso pinza dentata e fare un&#39;incisione linea centrale (lunga 2-3 cm) attraverso la pelle utilizzando un paio di forbici robuste. Utilizzando una multa (iris) forbici fanno un&#39;incisione simile attraverso la linea alba, sollevando la parete addominale con una pinza dentata per evitare di danneggiare l&#39;intestino. </li><li> Con l&#39;animale su un fianco sul vassoio animale, estrarre delicatamente l&#39;intestino dalla cavità addominale utilizzando applicatori con punta in cotone (bastone di legno) imbevute di soluzione di Ringer e pinze dentellate smussato. Disporre l&#39;intestino nel tessuto bene in modo che il mesentere è drappeggiato su colonna per la visualizzazione al microscopio facendo attenzione a non toccare il mesentere (potentially danneggiando microvasi) sia con pinze o cotone. Nota: Il vassoio animale (Figura 2A) può essere costruito da plexiglas e richiede un tessuto ben (circa 3 mm di profondità), una colonna otticamente trasparente (ad esempio, quarzo lucidato circa 2 cm di diametro e 5 mm di altezza.), E un tampone riscaldamento regolato per mantenere la temperatura dell&#39;animale. Lo spessore del pilastro non deve superare la distanza di lavoro dell&#39;obiettivo. </li></ol></li><li> Posizionare il vassoio animale sul palco microscopio in modo che il mesentere è visibile attraverso gli oculari. </li><li> Posizionare una linea di gocciolamento per gravità a superfuse continuamente mesentere con la soluzione dei mammiferi di Ringer mantenuta a 35-37 ° C. Utilizzare garze per tenere l&#39;intestino in luogo, contribuire a mantenere l&#39;umidità e favorire la soluzione in eccesso di Ringer fuori dalla superficie. Regolare il flusso e aspirare l&#39;effluente di mantenere uno spessore superfusate coerente. </li><li> Identificare bersaglio microvasi venulari, che sonosegmenti non ramificate a valle del flusso convergente, uno o due rami distali ai veri capillari. Trovare un vaso non ramificato (idealmente, da 600 a 1.000 micron di lunghezza) che hanno attivo il flusso di sangue e privo di globuli bianchi che spuntano sulle pareti del serbatoio. </li><li> Posizionare microrecipiente prova nel centro del campo ottico e spostare il dispositivo di immobilizzazione nella posizione vicino al sito cannulazione prescelto. </li></ol> 5. Riempire Micropipetta e il Monte di Holder <ol><li> Poco prima cannulating, sospendere i globuli rossi del perfusato. Aggiungere 7 ml di globuli rossi concentrati a 0,5 ml perfusato in una provetta pulita borosilicato. Nota: ematocrito del 1-3% può essere utilizzato, ma ematocrito coerente porterà a concentrazioni perfusato coerenti di eventuali sostanze rilasciate dai globuli rossi. </li><li> Montare una siringa da 1 ml con un adattatore tubi 23G e PE 50 tubi (5-15 cm di lunghezza). Disegna la / miscela di cellule rosso perfusato nella siringa. Capovolgere la siringa per mescolare ed espellere tutte le bolle dal tubo eadattatore. Per una maggiore efficienza, la tubazione adatta a diverse siringhe prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento e tenerli in una scatola senza polvere o sacchetto di plastica. </li><li> Riempire il micropipetta avanzando il tubo nel grande fine della micropipetta fino a che non confina con la regione rastremata. Applicare una spinta rapida delicato sulla stantuffo della siringa per riempire la punta micropipetta. Nota: Un piccolo ruscello o di goccioline devono essere visibili sulla punta di evidenziare riempimento completo. </li><li> Ritirare il tubo mentre spingendo delicatamente lo stantuffo per riempire la parte più larga dell&#39;albero micropipetta. Rimuovere piccole bolle nel vasto pozzo muovendo con cautela l&#39;albero micropipetta. Nota: Una procedura simile è stata illustrata 32. </li><li> Posizionare la micropipetta in un supporto pipetta con una porta laterale che consente un collegamento di fluido continuo ad un manometro ad acqua. Assicurarsi che il titolare, che è attaccato ad un azionamento idraulico utilizzato per controllare l&#39;avanzamento molto fine della micropipetta, è con una leggera angolazione (15-25 °)all&#39;orizzontale in modo che il bordo del cono micropipetta non colpisce l&#39;intestino o il vassoio. </li><li> Montare l&#39;azionamento idraulico su un micromanipolatore mobile, che ha x, y, z e unità per consentire stretto allineamento al recipiente di prova (figura 2). </li><li> Regolare la pressione idrostatica applicata al fluido nella micropipetta con una siringa o bulbo di gomma pieno d&#39;acqua per modificare l&#39;altezza del liquido nella colonna d&#39;acqua del manometro a circa 40 cm H 2 O sopra mesentere. </li><li> Incannulare microrecipiente appena possibile dopo il riempimento della pipetta; globuli rossi si depositano sul fondo della pipetta, in modo che dopo circa 40 min pochissimi globuli rossi fluirà nel recipiente. </li></ol> 6. Microcannulation e microvascolari pressione misura <ol><li> Prima di posizionare la micropipetta pieno sotto il microscopio, premere delicatamente il restrainer sul tessuto pressi microrecipiente applicare una forza sufficiente per afferrare il tessuto. Disegnare larestrainer indietro, leggermente l&#39;allungamento dei tessuti in linea con microrecipiente modo che le sollecitazioni nelle fibre di collagene mesenterici sono allineate con il vaso. <ol><li> Allineare la micropipetta con la nave e abbassarlo in vista attraverso gli oculari. Posizionare la punta appena a monte del sito di incannulamento scelto e abbassarlo sul tessuto in modo che ostruisce parzialmente il flusso all&#39;interno del recipiente, ma non occlude esso. </li></ol></li><li> Incannulare la nave guidando la punta della pipetta lentamente nel lume del vaso con l&#39;azionamento idraulico. Fare attenzione a non spingere attraverso il lato inferiore del recipiente. Nota: Poiché la micropipetta entra nel lumen, il perfusato lava rapidamente il sangue nel vaso di lume e perfusato liberamente sfocia circolazione distale degli animali alla microrecipiente prova, spostando parte del normale perfusione sanguigna nei vasi a valle. </li><li> Abbassare la pressione di perfusione regolando manometro finché il sangue (come indicatoda globuli rossi dell&#39;animale) viene tirato indietro nel segmento perfusione; questo determina la pressione equilibrio in cui i globuli rossi oscillano dolcemente nel lume del vaso e misura la pressione idrostatica microvasi (P c) all&#39;estremità distale del segmento microvasi. Mantenere nave perfusione a tutte le pressioni di cui sopra questa pressione equilibrio. </li></ol> 7. Microocclusion e raccolta dei dati <ol><li> Passaggio facoltativo: Prima di utilizzare il micro-occlusore per bloccare la nave, premere in tessuto, in una zona non utilizzata di mesentere lontano da ogni nave in modo che la punta si accumula un bel blocco di tessuto che protegge la nave sperimentale durante micro ripetuto occlusioni. </li><li> Posizionare il blocco di sopra del recipiente perfuso vicino al bordo inferiore del campo del microscopio. </li><li> Registrare il seguente con il video e l&#39;audio. <ol><li> Verbalmente registrare la posizione del sito di blocco e il bordo schermo inferiore come visto sul reticolo oculare. </li><li> Con la puntadel bloccante posta proprio sopra il microvasi, utilizzare il controllo z multa di micromanipolatore per abbassare delicatamente il blocco fino a quando il flusso nel serbatoio è occluso. Nota la pressione manometro (P c) audio. Applicare l&#39;occlusione di solito per 3-10 secondi, quindi rilasciare, ripristinando la perfusione gratuito. Spostare il sito blocco la nave verso la punta della pipetta in 5-10 micron passi in base al tempo (&gt; 5 min dopo il blocco iniziale in un sito), il numero di occlusioni (3-5), per evitare di danneggiare parete del vaso presso il sito del blocco . </li></ol></li></ol> 8. Analisi dei dati e valutazione di L p (acqua permeabilità) <ol><li> Durante la riproduzione video, determinare la distanza iniziale (ℓ 0) da una cella rossa marcatore per il sito dell&#39;occlusione dall&#39;uso di un&#39;immagine di un micrometro e le posizioni note sulle immagini. Determinare la velocità iniziale (dℓ / dt) della cella marcatore dalla sua posizione in diversi frame durante la 3-10 sec di immagini registrate. Dissuadereminiera il raggio del serbatoio (r) dalle immagini scattate durante l&#39;occlusione (Figura 3). </li><li> Calcola J v / S per ogni occlusione (dℓ / dt) × (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcolare L p ad una pressione costante (J v / S) diviso per la pressione di pilotaggio (pressione microvasi - efficace pressione osmotica colloide; vedi Discussione). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dettagli dei calcoli p L. Anche se il movimento fluido transvascular si verifica mentre la nave è liberamente perfuso, tale scambio è troppo piccolo per essere misurato durante la perfusione libero perché è in genere inferiore allo 0,01% del tasso di perfusione nave. Tuttavia, in condizioni di perfusione viene transitoriamente fermato occludendo microrecipiente, flusso transvascular (cioè, filtrazione) è misurata dal movimento dei globuli rossi marcatori nel lume della colonna di fluid...

Microperfusione nella vascolatura comporta istituisce controllato flusso di perfusato artificiale di composizione nota mediante una micropipetta in un vaso sanguigno di solito meno di 40 micron di diametro. Il vaso perfuso rimane nel suo ambiente tessuto normale e viene perfuso con dell&#39;animale sangue fino al momento della cannulazione. Quando utilizzato in combinazione con una serie di video di immagini o di tecniche fluorimetrica, in situ microperfusione consente la misurazione dei flussi idrici e dei soluti attraverso le pareti dei microvasi in condizioni quali siano note le forze trainanti di questi flussi e le proprietà di permeabilità della parete vascolare può essere direttamente valutati. Inoltre, controllando la composizione del fluido circostante microrecipiente nel tessuto (perfusato e superfusate), la regolazione della permeabilità microvascolare e di scambio può essere indagata attivando le cellule endoteliali formano la parete microrecipiente essere esposti a una varietà di econdizioni Xperimental (agonisti, le condizioni di perfusione modificate, indicatori fluorescenti per misurare la composizione intracellulare e di segnalazione) per periodi misurati con precisione di tempo (sec a hr). Inoltre, le valutazioni ultrastrutturali o citochimici di chiave strutture molecolari cellulari che regolano la barriera possono essere studiate nelle stesse microrecipienti in cui la permeabilità viene misurata direttamente. L&#39;approccio costituisce così un ponte tra studio dei meccanismi cellulari e molecolari di modificare la funzione di barriera endoteliale in coltura monostrato di cellule endoteliali e indagine microvasi intatti. Vedere le seguenti recensioni per un&#39;ulteriore valutazione 1-6. Una limitazione di microperfusione è che può essere utilizzato solo in letti microvascolari che sono sottili, trasparenti e con integrità strutturale sufficiente a consentire incannulazione con una micropipetta di vetro. Mentre i primi accertamenti utilizzati microvasi rana in mesenterio e sottile cutanea pectoris muscle 7,8, di gran lunga la preparazione più comunemente usato nei modelli di mammiferi è il topo mesentere 9-15. La maggior parte delle indagini si sono concentrate sui cambiamenti acuti in permeabilità vascolare studiato per periodi di 1-4 ore, ma le indagini più recenti sono state estese a misurazioni su singoli pescherecci 24-72 ore dopo un iniziale perfusione 12,16. La tecnologia CRISPR recentemente sviluppato, che promette di rendere più modelli di ratto geneticamente modificati per lo studio vascolare regolazione della permeabilità 17 dovrebbe consentire i metodi descritti nella presente comunicazione da applicare in microvasi venulari del mesentere di questi nuovi importanti modelli di ratto. Il metodo richiede un microscopio rovesciato dotato di un palco microscopio su misura sufficientemente grande per contenere sia la preparazione degli animali e almeno tre micromanipolatori utilizzato per posizionare microtools vicino alla nave perfuso e per allineare una micropipetta perfusione con la navelumen. Ad esempio una piattaforma personalizzata per un palco microscopio xy (circa 90 × 60 cm) può essere fabbricata da una piastra di acciaio dello spessore di 1 cm con un rivestimento antiruggine. Lo stadio è collegato a una tabella indice ingegneria o due slitte a coda di rondine montate ad angolo retto e supportati su pilastri teflon o trasferimenti a sfere per il movimento nel piano orizzontale. Un impianto tipico (vedi figura 2) ha molto in comune con il microscopio e microposizionamento attrezzature utilizzate per una serie di esperimenti microcircolazione intravitale come quelli per misurare il flusso unico dei vasi sanguigni e dell&#39;ematocrito, il trasporto di ossigeno locale sangue perfusione microvasi, regolazione di vascolare liscio il tono muscolare, e l&#39;accumulo microvascolare locale dei traccianti fluorescenti iniettate nel suo complesso circolazione. 18-26 L&#39;aspetto fondamentale della tecnica è la misura della portata (J v) attraverso una superficie definita (S) della parete microvascolare. Realizzarequesto tramite la tecnica Landis modificato qui descritta una semplice microscopio invertito è adeguata. Una piccola videocamera è montata sulla porta immagine e il segnale video, con una base tempo aggiunto, viene visualizzato su un monitor video e registrate in forma digitale su un computer o un segnale digitale o analogico su un videoregistratore. Una volta microrecipiente si incannula la porzione di microvasi visibile alla telecamera può essere modificato spostando la fase e manipolatori come unità senza interrompere la cannulazione. Misurazione dei flussi transvascular può anche essere combinato con indagini più dettagliate utilizzando un sofisticato microscopio a fluorescenza con filtri appropriati, quali impianti utilizzati per la misurazione di soluto permeabilità, controllo rapporto fluorescente di calcio citoplasmatico o di altri meccanismi cellulari, e confocale 6,12,13, 27. Un vantaggio fondamentale di tutti gli approcci microperfusione è la capacità di fare misure ripetute, sulla nave, Sotto cambiamento controllato di forza motrice, come pressioni idrostatiche e oncotica, o cambiamento indotto nella risposta dei vasi alle condizioni infiammatorie. Il tipo più comune è un confronto accoppiato di conduttività idraulica misurata (L p) sulla nave con il vaso prima perfuso con una micropipetta riempito con un perfusato controllo e sospensione di eritrociti per stabilire uno stato basale permeabilità, quindi con una seconda pipetta con l&#39;agente di test aggiunto perfusato. Molteplici cannulazioni sono possibili con il ciclo ripetuto dopo riperfusione con la pipetta di controllo. Il presente protocollo dimostra la cannulazione e microperfusione di un vaso venulare nel ratto mesentere registrare flussi di acqua attraverso la parete microvessel e misurare la L p della parete del vaso, un indice utile della permeabilità del percorso comune per l&#39;acqua e soluti attraverso intatto barriera endoteliale. La procedura si chiama techniq Landis modificatoue perché il principio originale Landis di utilizzare il movimento relativo dei globuli rossi come misura di scambio fluido transvascular dopo perfusione è bloccato è conservato 28, ma la gamma di condizioni sperimentali (ad esempio, le differenze di pressione oncotica idrostatica e albumina attraverso la parete microrecipiente) disponibile dopo microperfusione è di gran lunga maggiore rispetto al sangue perfuso uncannulated microvasi 8,29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

Gli esperimenti per misurare le proprietà di permeabilità dei microvasi irrorati individualmente forniscono un ponte tra studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano la permeabilità vascolare in coltura monostrato di cellule endoteliali e le proprietà di scambio funzionali di interi letti microvascolari. Un metodo per cannulare e perfusione microvasi venulari di ratto mesentere e misurare la conduttività idraulica della parete dei microvasi è descritta. Le principali attrezzature necessarie include un microscopio intravitale con un grande palco modificato che supporta micromanipolatori di posizionare tre differenti microtools: (1) una micropipetta di vetro smussato a cannulare e perfusione microrecipiente; (2) un vetro micro-occlusore per bloccare transitoriamente perfusione e consentire la misurazione di transvascular movimento flusso d&#39;acqua ad una pressione idrostatica misurata, e (3) una bacchetta di vetro smussato per stabilizzare il tessuto mesenterico nel sito di incannulamento. Il Landis micro-occlusione techniq modificatoue utilizza globuli rossi sospese nel perfusato artificiale come marcatori di fluido movimento transvascular, e consente inoltre misurazioni ripetute di questi flussi condizioni sperimentali sono cambiati e differenza idrostatica e colloide pressione osmotica attraverso i microvasi sono attentamente controllati. Le misurazioni della conducibilità idraulica prima con un perfusato controllo, quindi dopo la ri-incannulamento della stessa microvasi con i perfusates prova consentono confronti della risposta dei microvasi in queste condizioni ben controllate associati. I tentativi di estendere il metodo per microvasi nel mesentere di topi con modificazioni genetiche che si prevede di modificare la permeabilità vascolare erano fortemente limitata a causa dell&#39;assenza di lunghi microvasi dritti e ramificati nel mesentere del mouse, ma la recente disponibilità dei ratti con modificazioni genetiche simili utilizzando la tecnologia / Cas9 CRISPR è prevista l&#39;apertura di nuove aree di indagine in cui possono essere applicati i metodi qui descritti. </p&gt;

La Figura 4 mostra i risultati di misurazione del decorso temporale delle variazioni di L p in un ratto venulare microvasi cannulato successivamente con quattro perfusates. 33 L&#39;entità di L p calcolata a pressione costante è stato usato come una misura delle variazioni di microvasi permeabilità della parete, prima nello stato di controllo con un perfusato contenente 1% di albumina sierica bovina poi, quando la nave è stata esposta per la bradichinina agente infia...

Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Ricerca

Biologia

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mesentere angiogenesi Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video