The authors thank G&#252;nter Oberd&#246;rster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Per i campioni di tessuto che sono stati sottoposti a colorazione istologica convenzionale, l&#39;identificazione e l&#39;analisi di metalli nanoparticelle di ossido possono essere realizzati attraverso una combinazione di EDFM, mappatura HSI, e tecniche di analisi di immagine. Mentre vi è la flessibilità nella preparazione dei campioni per l&#39;esame istologico o immunoistochimica (ad esempio, utilizzando tessuti fissati o congelati; tipo di macchia), è importante che i campioni sono sezionate ad uno spessore di 5-10 micron per la visualizzazione ottimale. I campioni utilizzati qui sono stati fissati in formalina e incluso in paraffina prima di sezionamento con un microtomo rotativo di 6 micron di spessore, montati su vetrini per microscopio, macchiato con ematossilina eosina e coprioggetto. Tessuti della pelle suina da un cutaneo collaborazione ex vivo penetrazione di tossicologia sono stati utilizzati per questo studio. I tessuti sono stati esposti a nanoparticelle di ossido di metallo (allumina, silice, cerio) in sospensioni acquose. Rilevazione della regione (s) di interesse (eleme alto contrastonti) con EDFM è un primo passo importante che facilita la successiva mappatura e l&#39;analisi HSI. Campioni di controllo positivi e negativi devono essere esposte e analizzati in primo luogo per creare una libreria spettrale per riferimento. Gli spettri raccolti dal controllo positivo sono esportati in una libreria spettrale controllo positivo. Quindi, tutti gli spettri dalle immagini di controllo negativo sono sottratti dalla biblioteca spettrale del controllo positivo per migliorare la specificità (ridurre i falsi positivi). La libreria spettrale filtrato risultante è considerato il RSL che serve per l&#39;analisi di materiali di interesse. Tutti i campioni di tessuto subiscono lo stesso processo di imaging e vengono mappate contro il RSL. L&#39;immagine risultante conterrà solo le aree con elementi di interesse su uno sfondo nero. Questa immagine potrebbe quindi essere analizzato con ImageJ utilizzando le sue funzioni di soglia e di analisi di particelle per ottenere l&#39;area di particelle mappati per campo. I dati numerici ottenuti da ImageJ può essere esportazionecato di un foglio di calcolo per ulteriori analisi. È importante considerare che come campioni biologici sono intrinsecamente diversi l&#39;uno dall&#39;altro, e metodi di colorazione possono influenzare visualizzazione tramite EDFM e HSI, le impostazioni di esposizione devono essere determinati conformemente a quanto produce la migliore immagine ad alto contrasto per un tipo specifico di campione. Sebbene la riduzione di falsi positivi può essere raggiunto attraverso la filtrazione di librerie spettrali, è fondamentale avere controlli negativi affidabili che hanno evitato la contaminazione con l&#39;elemento di interesse, come spettri corrispondente a tale contaminazione potrebbe potenzialmente essere filtrata dalla libreria spettrale del controllo positivo , aumentando i tassi di falsi negativi. Inoltre, la gamma di intensità spettro che è rilevabile con il software di imaging iperspettrale non può superare il limite del software particolare (per questo studio, cioè 16.000 unità): aree con un elevato numero di particelle accumulate che producono spintensità ectral superiori al limite di intensità sono lasciati fuori della biblioteca spettrale, a causa del rischio di aumentare il numero di falsi negativi. Mentre il sistema HSI conferisce molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali, ci sono alcuni svantaggi e limitazioni da considerare. Una è che la grande quantità di dati ottici raccolti possono richiedere potenza di calcolo notevole. Un altro è che HSI può essere ad alta intensità di tempo, in particolare nelle fasi iniziali, quando si creano librerie spettrali di riferimento. Inoltre, il tempo di imaging può richiedere diversi minuti per l&#39;acquisizione di immagini, il che rende più lento di semplice di imaging in campo oscuro; tuttavia, è ancora più veloce di eseguire la preparazione del campione e la visualizzazione al microscopio elettronico. Inoltre, i sistemi complessi possono comportare molteplici spettri caratteristici, che richiedono lo sviluppo di controlli altamente specializzati e rendono la creazione di librerie di riferimento, universali standardizzate difficili 26. Infine, la tecnologiarisultati nique a risoluzione inferiore rispetto alle tecniche probe- o microscopia elettronica, come la microscopia a forza atomica o microscopia elettronica a trasmissione, che possono risolvere i singoli atomi. Risoluzione di questa tecnica è limitata a causa della sua natura fotonica, che impedisce di essere uno strumento di alta precisione per misurare dimensioni delle particelle a livello nanometrico o per localizzare con precisione materiali ad un livello sub-micron. Mentre la tecnica può essere in grado di individuare particelle entro certi compartimenti o organelli cellulari maggiore di 1 micron (come nuclei delle cellule), organelli piccole o caratteristiche sono difficili da visualizzare accuratamente con questo metodo. Da notare anche, data la sua risoluzione spaziale, questo metodo non può distinguere tra singole nanoparticelle e agglomerati 11. Altre considerazioni includono: alcuni materiali (come i metalli nobili) hanno molto più elevata riflettanza e profili spettrali distinti, che possono renderli più facilmente analyze e mappa spettralmente con questo strumento. Altri, come gli ossidi metallici semi-esaminati in questo studio e nanomateriali a base di carbonio 24, 27, può essere più difficile a causa della loro composizione elementare, la forma e seconda matrice. In due studi di inalazione murini di Mercer et al., Un sistema simile a quello impiegato in questo studio è stato usato al fine di individuare i nanotubi di carbonio nei polmoni e negli organi secondari in base al loro notevolmente alto contrasto con i tessuti circostanti. Tuttavia, la mappatura iperspettrale non è stata dimostrata in uno studio, probabilmente perché la forma unica di fibre di carbonio era un tratto sufficiente per l&#39;identificazione. Un&#39;altra considerazione riguarda specificamente ai tessuti: dal deposito di nanoparticelle di interesse di organi specifici attraverso normali processi biofisici è imprevedibile (e spesso si oggetto di studio), la determinazione di un controllo positivo applicabile può essere difficile e richiede la considerazione di come la generazione del controllo mIRITTO influenzare lo stato di un materiale di interesse. Ad esempio, se una libreria spettrale è creata da nanoparticelle cristalline di interesse, può essere difficile per mappare la libreria di quelle stesse nanoparticelle in tessuti o cellule a causa di cambiamenti negli spettri derivanti da alterazione della particella (ad esempio, per effetto del cambiamento pH, la dissoluzione, agglomerato, legame con le proteine) e il microambiente generale o matrice. Infine, la tecnica è limitata nella sua natura semi-quantitativa: può essere solo quantitativa come altre tecniche di microscopia bidimensionale di risoluzione simile, che significa che non può essere facilmente utilizzato per eseguire operazioni quali caratterizzano onere organo totale di un materiale. Nel complesso, EDFM e HSI offre numerosi vantaggi rispetto alle tecniche di imaging nanomaterial e caratterizzazione convenzionali, quali TEM, HAADF e DIC. EDFM / HSI permette per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi delle immagini più veloce, che consente di risparmiare tempo e costi rispetto a più conven intensivaTecniche nali. Inoltre, la preparazione del campione per EDFM / HSI è tipicamente sia minima e non distruttivo, che consente di risparmiare tempo e permette anche per analisi più flessibile di un dato campione in quanto può essere utilizzato per altre tecniche. Inoltre, HSI è versatile, consentendo analisi dei materiali nanoscala di molte composizioni e in una varietà di matrici. Il team di ricerca sta lavorando per perfezionare il metodo descritto qui per altri materiali e tipi di campione, compresa una valutazione approfondita della specificità della tecnologia. Un passo successivo critico sotto inchiesta da parte del gruppo di ricerca è la convalida di queste tecniche contro gold standard tradizionali (ad esempio, Raman, TEM, SEM) per i materiali e tipi di tessuto di interesse.

Come nanomateriali sono sempre più utilizzati in una varietà di settori e applicazioni, vi è la necessità per nanoscala di imaging e caratterizzazione metodi che sono più rapidi, economico e conveniente di modalità tradizionali, come la microscopia elettronica. Per visualizzare nanoparticelle (NP) interazioni con le cellule, i tessuti e sistemi viventi, sono state impiegate molte tecniche ottiche, tra cui contrasto interferenziale differenziale (DIC) Microscopia 1 e approcci sul campo evanescenti, come riflessione interna totale (TIR) ​​o Vicino- microscopia a scansione campo ottico (NSOM) 2,3. Tuttavia, questi sono approcci analitici di fascia alta, fuori dalla portata della maggior parte dei laboratori non specializzati 4. La microscopia elettronica, compreso microscopia elettronica a trasmissione (TEM), è stato utilizzato anche per studiare l&#39;interazione con le cellule NP 5,6,7,8. Angolo alto anulare campo oscuro (HAADF) microscopia elettronica a scansione trasmissione è stato utilizzato per studiare l&#39;interazione di NPcon i virus 9. La microscopia confocale è un&#39;altra tecnica popolare usato per studiare le interazioni NP-cellula 10. Negli ultimi anni, l&#39;imaging iperspettrale (HSI) tecniche basate campo scuro-sono stati utilizzati come strumento di analisi promettente per lo studio nanoparticelle in matrici biologiche 11. Sistemi HSI generano una rappresentazione tridimensionale di dati spaziali e spettrali, noto come un ipercubo o DataCube 12. La mappa spaziale di variazione spettrale viene utilizzato per l&#39;identificazione dei materiali. Profili spettrali di materiali noti possono essere generati e utilizzati come librerie di riferimento per il confronto con campioni sconosciuti. Uno dei principali vantaggi con sistemi HSI è la sua capacità di combinare l&#39;imaging con spettroscopia, così da stabilire la posizione e distribuzione delle NP sconosciuti in vivo o ex vivo e collegandoli a un&#39;altra particella di riferimento noto, composizione simile. Ci sono diversi vantaggi dil&#39;utilizzo di sistemi HSI su tecniche di imaging convenzionali: è richiesta una minima preparazione del campione; preparazione del campione è in genere non distruttivo in natura; l&#39;acquisizione delle immagini e l&#39;analisi è più veloce; la tecnica è conveniente 13; e la distribuzione spaziale e l&#39;analisi di composti di composizione mista e / o in matrici complesse è più facilmente realizzabile 14. Per ricerche nanomateriali coinvolgono campioni preziosi, una delle considerazioni più importanti è la disponibilità di un metodo di imaging non distruttivo, che consente la possibilità di esaminare ripetutamente campioni di uno o più metodi. Ripetuti o più analisi possono desiderare di sviluppare set di dati globali che non sarebbero disponibili da un unico metodo. A questo proposito, studiando le sue proprietà ottiche è il modo più sicuro per analizzare il campione. Utilizzando un microscopio potenziato darkfield (EDFM) e sistema HSI per studiare la risposta ottica del campione - cioè Reflectance, ma anche di assorbanza e trasmittanza - l&#39;identificazione e la caratterizzazione caratteristica può essere effettuata 15. I potenziali endpoint caratterizzazione includono una valutazione della dimensione relativa e la forma di nanoparticelle o agglomerati e distribuzione di nanoparticelle all&#39;interno di un campione. In questo articolo, descriviamo metodi di mappatura specificamente per le nanoparticelle di ossido di metallo nel tessuto post mortem utilizzando un sistema HSI basato su un algoritmo partita pixel spettrale indicato come un mappatore angolo spettrale (SAM). Abbiamo scelto questa particolare applicazione, perché ha il potenziale per integrare attuale e futuro nella ricerca nanotossicologia vivo, in cui i modelli animali sono utilizzati per valutare le implicazioni sulla salute dell&#39;esposizione ai nanomateriali ingegnerizzati. L&#39;applicazione di questo metodo potrebbe anche informare ricerca di somministrazione di farmaci su scala nanometrica che utilizza modelli di tessuto o animali. In particolare, l&#39;assorbimento di nanoparticelle, distribuzione, metabolismo e l&#39;escrezione tutto organs e tessuti possono essere indagati con questo sistema. Un&#39;ampia varietà di applicazioni sono in fase di studio per l&#39;uso nella ricerca biomedica 11. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per la valutazione di diversi campioni biologici (ad esempio vari tipi di tessuti, campioni di lavaggio broncoalveolare, e strisci di sangue), che sono stati esposti alle nanoparticelle di una varietà di composizioni elementari 16-19. Inoltre, questo metodo è utile per studiare nanoparticelle biodistribuzione in vivo e in vitro, che è pertinente per studi drug delivery nanoscala 11. Oltre campioni biologici, EDFM e HSI possono essere utilizzati per valutare nanoparticelle in campioni ambientali, come acqua di scarico 20. Valutazione dell&#39;esposizione professionale può essere facilitata mediante l&#39;uso di questa tecnica e, in quanto può essere utilizzato per valutare l&#39;efficacia dei dispositivi di protezione individuale per la prevenzione di penetrazione delle nanoparticelle. Inoltre, la ricerca team sta attualmente sviluppando un EDFM simile e il protocollo HSI per la valutazione dei campioni dei media filtranti di nanoparticelle raccolti da valutazioni di esposizione professionale. Mentre preparazione di questi diversi tipi di campioni per EDFM e HSI può variare, è importante che siano preparati in modo tale che essi possono essere facilmente visualizzate dal sistema ottico. In genere, il campione deve essere preparato come se fosse essere visualizzato tramite la microscopia in campo chiaro tradizionale. Ci sono diversi sistemi di imaging iperspettrale disponibili in commercio 11.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CytoViva 150 Unit (condenser)</td>
			<td>CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>mounted to Olympus BX43 microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>for use with CytoViva 150 Unit condenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>enhanced darkfield camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>hyperspectral camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>1025087</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x&#160; 1.45mm)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>custom</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>type A microscopy immersion oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12368B</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol in water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software online download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal oxide nanoparticles</td>
			<td>supplied to the research team by industrial partners</td>
			<td></td>
			<td>alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metal oxide nanoparticles in histological samples by enhanced darkfield microscopy and hyperspectral mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Microscopia Hyperspectral è utile per la sua capacità di identificare i materiali in un modo simile a spettrofotometria. Come indicato nella Figura 1, ogni materiale ha diversi spettri caratteristici ed una forma complessiva della sua riflettanza, che è unica. Inoltre, la Figura 1 illustra la natura della matrice-dipendente dei profili spettrali: i profili spettrali per ciascuna delle tre ossidi metallici in campioni istologici (pannello superiore) sono diversi dai profili spettrali per ciascuna delle tre ossidi metallici in sospensione acquosa ( pannello inferiore). Mappando i profili spettrali caratteristici per campioni sconosciuti nella stessa matrice, la tecnica è utile per determinare la presenza o l&#39;assenza di un materiale, e può anche confrontare semi-quantitativamente quantità relative di materiale in campioni. Le librerie di riferimento spettrali creati da campioni di pelle di controllo positivo sono appropriati per la mappatura a sperimentalecampioni di pelle. Come si vede nella figura 2, le biblioteche di spettri di riferimento map bene ai corrispondenti controlli positivi e non mappano i corrispondenti controlli negativi. Il vantaggio più significativo della tecnica è la sua capacità di rilevare bassi livelli di materiali di interesse in campioni, nonché per distinguerli dai contaminanti. . Per esempio, i singoli nanotubi possono essere osservati nei polmoni durante l&#39;inalazione di dosi di 40 mg in un 20-30 g rat 25. Figura 3 dimostra in campioni istologici di pelle: mentre alcune particelle sono prontamente evidenti nell&#39;immagine ottica darkfield (colonna 2), altri vengono rilevati utilizzando l&#39;imaging iperspettrale (colonna 3) che potrebbe essere stato perso con il microscopio a campo chiaro (colonna 1) o altri metodi. L&#39;uso di campo oscuro HSI serve anche a migliorare la specificità sopra semplice microscopio campo chiaro. Queste immagini possono poi essere oggetto di forme più quantitative di analisi, nl&#39;analisi delle particelle otably via ImageJ. Microscopia a campo scuro migliorata ha diverse applicazioni, anche in assenza di immagini iperspettrale. Il primo è la sua capacità di generare di alta qualità, immagini ad alto contrasto. Ciò è dimostrato dal figura 3, in cui le particelle di interesse sono facilmente identificabili rispetto alle loro controparti brightfield. Queste immagini possono anche essere oggetto di analisi quantitativa delle particelle, ma in assenza di mappatura iperspettrale, cautela è necessaria per evitare di confondere una particella contaminante da una particella di interesse. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> Librerie Figura 1. Riferimento spettrali (matrice di tessuto) rispetto alle biblioteche spettrali (nanoparticelle in sospensione). Questo dato dimostra l&#39;importanza di generare una biblioteca di riferimento spettrale da nanomaterials di interesse nella stessa matrice come campioni sperimentali. La prima riga mostra la libreria spettrale di riferimento (RSL) per ogni materiale in questo studio (allumina, silice e ossido di cerio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Questo RSL è stato creato con il metodo descritto in questo protocollo, dove i campioni di tessuto di controllo positivo sono stati filtrati contro campioni di tessuto di controllo negativo. La seconda riga mostra librerie spettrali (SL) creati dalle nanoparticelle di interesse in sospensione liquida su un vetrino. Per allumina, un picco bimodale a lunghezze d&#39;onda di 500 e 650 è stato trovato nel RSL, mentre un picco più curva e meno distintivo è stato visto in allumina NP sospensione SL a circa 600. Per silice, un picco a una lunghezza d&#39;onda di circa 650 era presente nel RSL, mentre un picco più curva e meno distintivo è stato visto nella sospensione di silice NP SL a around 600. Per Ceria, un picco bimodale è stato trovato a lunghezze d&#39;onda di 520 e 620 nel RSL, mentre un picco di meno distintivo è stato visto nel Ceria NP sospensione SL a circa 560. Ciò suggerisce che la matrice in cui le nanoparticelle sono incorporati crea un cambiamento negli spettri che può essere considerevole quando si selezionano i comandi per creare la SL per esperimento come specifica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> Figura 2. Riferimento librerie spettrali (matrice di tessuto) mappati sul controllo positivo e il controllo negativo tessuto cutaneo suina. Questa cifra serve come conferma dei RSL in modo appropriato per la mappatura di campioni sperimentali, dal fatto che ogni RSL (colonna di sinistra) mappa bene al suo corrispondente controllo positivo (colonna centrale), e non la mappa della sua corrispondente controllo negativo (colonna di destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di clicca h</a>ere per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> Figura 3. iperspettrale mappatura sperimentale tessuto cutaneo suina esposta alle nanoparticelle di ossido di metallo. Le righe da cima a fondo corrispondono a diversi strati della pelle, da superficiale a strato più profondo: epidermide, derma e tessuto sottocutaneo, rispettivamente. La prima riga mostra lo strato corneo dell&#39;epidermide da un campione di pelle che è stato esposto a NP allumina in sospensione; la seconda fila è stato esposto alla silice NP in sospensione; e la terza fila di Ceria NP in sospensione. Ciascuna colonna rappresenta la stessa zona della pelle ripreso con tecniche diverse. La prima colonna corrisponde alla microscopia in campo chiaro (40X mag .; scala bar = 50 micron), dove è stato amplificato l&#39;area racchiusa in un quadrato rosso (100X mag; barra della scala = 10 micron) con una maggiore microscopia in campo oscuro (FESM) nella seconda colonna, dove frecce bianche sono indicando l&#39;alto contrasto NP. La terza colonna è stato ottenuto con una fotocamera iperspettrale (HSI), che mostra gli stessi NP ad alto contrasto (frecce bianche). Immagini EDFM e HSI sono state prese a ingrandimento 100X; barra della scala = 10 micron. La quarta colonna mostra l&#39;immagine HSI mappata contro il rispettivo RSL per ciascun gruppo di esposizione, dove NP allumina sono mostrati in verde, le NP di silice in rosso, e ceria NP in giallo, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato Mapping Darkfield Microscopy e iperspettrale

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K Views.  SUNY Polytechnic Institute, Colleges of Nanoscale Science and Engineering. Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Ricerca

Bioingegneria

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Realizzazione di un funzionalizzato magnetico batterica Nanocellulose con nanoparticelle di Ossido di Ferro

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

Etichettatura delle cellule e Targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Forno a microonde-driven sintesi di ossido di ferro Nanoparticelle per il rilevamento rapido di aterosclerosi

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Realizzazione di un dipolo-assistita estrazione in fase solida Microchip per Trace analisi dei metalli in campioni di acqua

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produzione di nanoparticelle metalliche mediante ablazione laser pulsata nei liquidi: uno strumento per studiare le proprietà antibatteriche delle nanoparticelle

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Utilizzo della magnetometria per monitorare l'incorporazione cellulare e la successiva biodegradazione delle nanoparticelle di ossido di ferro sintetizzate chimicamente

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires intraoperative diagnostic tools to avoid repeated surgeries due to a positive surgical margin. Recently, by taking the advantage of the high intrinsic optical absorption of DNA/RNA at 266 nm wavelength, ultraviolet photoacoustic microscopy (UV-PAM) has been developed to provide high-resolution histological images without labeling, showing great promise as an intraoperative tool for SMA. To enable the development of UV-PAM for SMA, here, a high-speed and open-top UV-PAM system is presented, which can be operated similarly to conventional optical microscopies. The UV-PAM system provides a high lateral resolution of 1.2 &#181;m, and a high imaging speed of 55 kHz A-line rate with one-axis galvanometer mirror scanning. Moreover, to ensure UV-PAM images can be easily interpreted by pathologists without additional training, the original grayscale UV-PAM images are virtually stained by a deep-learning algorithm to mimic the standard hematoxylin- and eosin-stained images, enabling training-free histological analysis. Mouse brain slice imaging is performed to demonstrate the high performance of the open-top UV-PAM system, illustrating its great potential for SMA applications.

A high-speed and open-top ultraviolet photoacoustic microscope that can provide histological images intraoperatively for surgical margin analysis is demonstrated, including the system configuration, optical alignment, sample preparation, and experimental procedures.