L'imaging iperspettrale consente l'acquisizione di informazioni spettroscopiche in luoghi precisi all'interno di un campione. Ad esempio, per la presentazione dell'anisotropia ottica ad un singolo livello cristallino. La generazione di dati spettrali e spaziali di un campione consente uno studio più dettagliato del campione di quanto sia possibile dalla sola spettroscopia o microscopia a fluorescenza.
Un gran numero di parametri regolabili che influenzano la risoluzione possono sembrare travolgenti all'inizio. Tuttavia, fare un elenco di controllo può aiutare a familiarizzare con il sistema. Questa tecnica richiede l'ottimizzazione manuale dell'hardware di imaging e la manipolazione del software.
È essenziale illustrare visivamente entrambi gli aspetti per mostrare come entrambi i metodi si completano a vicenda. A dimostrare la procedura con Nelson Rutajoga sarà Emily Rodrigues, post-dottorato del mio laboratorio. Per impostare la configurazione dell'imager per la mappatura dell'imaging iperspettrale, partendo dallo stadio del microscopio e seguendo il percorso del fascio di emissione verso i rivelatori, lasciare vacante la posizione per un cubo ottico proprio accanto al microscopio ottico e posizionare il cubo ottico al microscopio confocale in quella posizione che dirige l'emissione dal campione attraverso il percorso della luce visibile.
Guardando lungo il percorso ottico verso il rivelatore, posizionare il cubo ottico visibile contenente lo specchio dicroico e i filtri per dirigere l'emissione visibile verso il percorso di rilevamento nella sua posizione. Proseguendo il percorso verso il rivelatore, posizionare il cubo ottico a foro stenopeica confocale nella posizione giusta per dirigere la luce attraverso il percorso di rilevamento della luce visibile e seguendo questo percorso, posizionare il cubo ottico dello spettrometro confocale nella posizione appropriata in modo che la luce emessa raggiunga il rivelatore. Quando tutti i cubi sono in posizione, regolare manualmente l'apertura della fessura del rilevatore in modo che corrisponda alle dimensioni del foro di spillo selezionato.
Quindi, nel software PHySpec, selezionare l'apertura del foro stenopeica. Per la mappatura dell'imaging iperspettrale del terbio europio bi-pirimidina trifluoroacetilacetonato singolo cristallo, posizionare manualmente l'obiettivo 20 volte del microscopio ottico sotto il campione e premere il pulsante bianco sul lato sinistro del microscopio per accendere la luce bianca. Ruotare la manopola sotto il pulsante per regolare la luminosità.
Impostare la manopola in avanti sul lato destro del microscopio su R per inviare il 20% del segnale alla fotocamera e l'80% del segnale al rilevatore. Premere Play nella finestra della fotocamera a colori presso il software PHySpec per avviare una scansione dal vivo. Se la finestra della fotocamera a colori mostra un'immagine troppo scura o nera, aumentare il tempo di esposizione e/o il valore di guadagno nella scheda della fotocamera a colori.
Se l'immagine è troppo luminosa, ridurre il tempo di esposizione e/o il valore di guadagno. Per concentrarsi sul campione, ruotare le manopole del microscopio per regolare la distanza tra l'obiettivo nel palco e aprire l'otturatore della lampada a banda larga per consentire l'eccitazione UV del campione. Quindi ruotare la manopola di intensità nella posizione desiderata per controllare l'intensità dell'eccitazione della lampada a banda larga.
Fate clic su Mostra/Nascondi barra scala (Show/Hide scale bar) per aggiungere una barra di scala all'immagine della microscopia ottica a campo luminoso del cristallo e osservare un'immagine del cristallo sotto illuminazione UV piena o confinata. Per selezionare tra l'illuminazione confinata o un'illuminazione a campo largo, utilizzare il bastone e le manopole per regolare le dimensioni dell'apertura del campo della lampada UV. Nella scheda SpectraPro SP 2300, selezionare una lunghezza d'onda per osservare l'emissione del campione e regolare il tempo di esposizione del rilevatore.
Per ottenere il cubo iperspettrale nel sequencer, fare clic su più per aggiungere un nuovo nodo e fare clic su Imager confocale. Fate clic su Acquisizione multiso spettro (Multi-Spectrum Acquisition) e immettete i conteggi desiderati della posizione X e Y, nonché la dimensione del passo desiderata. Selezionare l'opzione hardware per la sincronizzazione della fotocamera e per la mappatura delle emissioni visibili e fare clic su OK.
Nel sequencer fare clic sulla linea di acquisizione multiso spettro appena aggiunta per evidenziare il nodo e fare clic su Riproduci per eseguire il nodo selezionato. Per l'analisi dei dati di imaging iperspettrali acquisiti, ad esempio, per una distribuzione spettrale di un'immagine, nel menu Elaborazione selezionare Dati e Ritaglia e Piega per aumentare il rapporto segnale/rumore dell'immagine. Per un profilo di intensità di emissione, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine del cubo e scegliere Crea profilo X per l'analisi di una riga.
Trascinare per selezionare l'area e fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area di interesse. Per selezionare Aggiungi a grafico. Visualizzare l'intensità di emissione in funzione della posizione fisica del bersaglio.
Il profilo di intensità apparirà nel nuovo grafico. Per ottenere uno spettro di emissione di un'area specifica dell'esempio, posizionare il puntatore del mouse sul cursore sull'immagine del cubo, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Selezione rettangolo. Trascinare e fare clic per disegnare la forma di selezione sull'area desiderata.
Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area di interesse e scegliere Aggiungi selezione al grafico. Nella finestra Aggiungi a grafico selezionare Crea nuovo grafico per visualizzare gli spettri di emissione della destinazione e fare clic su OK. Quindi salva lo spettro acquisito prima di selezionare una nuova regione.
Qui viene visualizzata un'immagine a campo luminoso di un cristallo registrata dopo aver regolato il campione nella messa a fuoco corretta. La morfologia a forma di ago del cristallo può essere chiaramente osservata. Qui, è possibile osservare immagini dello stesso cristallo sotto eccitazione UV con illuminazione completa o illuminazione localmente confinata.
L'illuminazione confinata può essere utilizzata per indagare gli effetti del trasferimento di energia o luce all'interno del cristallo che possono innescare un comportamento simile a una guida d'onda. Ad esempio, in questa immagine, viene rilevata una forte emissione in un punto non direttamente eccitato, suggerendo che una migrazione energetica efficiente avviene attraverso il cristallo. Dal cubo iperspettrale acquisito, è anche possibile ottenere la distribuzione spettrale sotto forma di immagine, che rappresenta una specifica lunghezza d'onda.
Il profilo di intensità di una specifica lunghezza d'onda di emissione e gli spettri di emissione a qualsiasi pixel o area del cubo iperspettrale acquisito. Ad esempio, gli spettri di emissione per questa analisi mostrano le bande di emissione più caratteristiche dello ione europio. Inoltre, il profilo spaziale lungo le diverse facce cristalline indica un'emissione più luminosa sulla punta e sulle facce laterali e può essere correlato con le distanze di ioni lantanidi/lantanidi nelle tre direzioni spaziali.
Per ottenere un buon segnale in un tempo di registrazione ragionevole del cubo iperspettrale, è importante regolare le configurazioni del microscopio, la messa a fuoco e il tempo di esposizione del rivelatore. Emissioni eccitazione UV ed emissione visibile, questa tecnica può essere eseguita utilizzando eccitazione vicino all'infrarosso e rilevamento delle emissioni vicino all'infrarosso. Ciò consente di essere applicabile per una vasta gamma di materiali luminescenti.
La correlazione dei segnali ottici con una serie di caratteristiche dipendenti rende questa tecnica molto interessante per lo studio delle relazioni struttura/proprietà, inclusa la valutazione in vitro delle interazioni nano-bio.
