Questo metodo di rilevamento basato su nanopore ha dimostrato il potenziale per caratterizzare fisicamente e identificare singole molecole. Lavorare con metallo-nanoparticelle, che è lo scopo di questo video, sta sfidando la nostra comprensione di ciò che limita l'accuratezza e la precisione della misurazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo apparato ha una maggiore larghezza di banda rispetto al tradizionale set-up di memoria lipidica bistrato, che ci consente di vedere risultati più veloci e più reazioni in nanopore.
Questa tecnica è stata resa possibile perché nei primi anni '90 è stato dimostrato che il gating nei nanopori proteici, cioè il passaggio da uno stato all'altro, può essere controllato e le molecole possono legarsi alla parete dei pori. Questa tecnica è in fase di sviluppo per applicazioni commerciali di sequenziamento del DNA perché utilizza campioni minimi. Non richiede etichette fluorescenti e utilizza lunghezze di lettura molto più lunghe rispetto ai metodi convenzionali.
Questa tecnica è stata anche sviluppata per discriminare tra polimeri in base alle loro dimensioni con maggiore precisione e velocità rispetto all'elettroforesi del gel e alla cromatografia. In primo luogo, preparare 500 millilitri di una soluzione di cloruro di sodio un molare e fosfato monosodico 10 millimolare in acqua ultrapura come elettrolita. È meglio utilizzare soluzioni e campioni freschi con questo particolare set-up.
Inoltre, abbiamo scoperto che l'acqua deionizzata di alta qualità è molto importante per formare con successo le membrane. Quindi, combinare un milligrammo di polvere monomerica S.aureus alfa emolisina di tipo selvatico liofilizzato con un millilitro di acqua ultrapura. Non dimenticare che lavorare con la proteina della tossina alfa emolisina Staph aureus può essere pericoloso.
Seguire le precauzioni nell'MSDS durante l'esecuzione di questa procedura. Successivamente, preparare quattro millilitri da cinque milligrammi per millilitro DPhyPC in endecaina in una fiala a scintillazione di vetro. Tappare la fiala con un cappuccio rivestito in politetrafluoroetilene e conservarla a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese.
Successivamente, sciogliere 57,6 milligrammi di acido 12-fosfotungstico idratare in 10 millilitri dell'elettrolita per fare una soluzione di polioxometalato bimolare. Dividere la soluzione POM in due porzioni da cinque millilitri. Utilizzare idrossido di sodio trimolare per regolare il pH di una soluzione POM a 5,5.
Per iniziare a prepararsi per il test, assemblare la cellula di prova di un apparato elettrofisiologico planare lipidico bistrato. In primo luogo, abradere un filo d'argento con carta vetrata da 600 graniglia e immergerlo nella candeggina a base di ipoclorito di sodio disponibile in commercio per 10 minuti per realizzare l'elettrodo di filo di cloruro argento-argento. Risciacquare e asciugare l'elettrodo di filo prima di inserirlo nel capillare al quarzo dell'apparecchio.
Mantenere l'elettrodo all'interno della membrana quarzo-nanopore, o QNM, separando il capillare e il serbatoio. Quindi posizionare un elettrodo cilindrico in pelle di cloruro d'argento-argento montato su un filo d'argento nel serbatoio. Collegare entrambi gli elettrodi alla scheda del circuito dell'amplificatore.
Aprire quindi il programma di acquisizione dati e avviare l'alimentatore a zero millivolt. Verificare che non sia rilevata corrente CC tra gli elettrodi nella cella vuota. Durante questa dimostrazione è importante osservare come la pressione trascapillare può influire sulla formazione della membrana e sulla successiva formazione di nanopore.
Senza fare correttamente questi due passaggi, gli esperimenti non funzioneranno. Caricare circa un millilitro di elettrolita in una siringa e collegarlo alla linea del fluido collegata al serbatoio. Aggiungere l'elettrolita al serbatoio fino a quando la faccia del QNM non è sommersa, come indicato dalla corrente ionica tra gli elettrodi che saturano l'amplificatore.
Se l'amplificatore non si satura, sbloccare il QNM applicando una tensione pop di più o meno un volt o aumentando la pressione capillare di circa 300 millimetri di mercurio. Utilizzare entrambe le tecniche, se necessario. Una volta che l'amplificatore si satura, ritirare l'elettrolita dal serbatoio fino a quando i livelli della soluzione scende al di sotto del QNM, come indicato dalla corrente che ritorna a zero.
Per iniziare il processo di formazione dei bistrati lipidici, aumentare il livello della soluzione elettrolita ben al di sopra della faccia del QNM e notare quanta soluzione ha preso. Quindi immergere una punta di pipetta da 10 microliter nella soluzione DPHyPC e disegnare tutti i lipidi visibili nella punta. Toccare la punta della pipetta sulla superficie della soluzione elettrolita e lasciare fluire il lipide dalla pipetta attraverso l'interfaccia aria-acqua.
Attendere da due a cinque minuti affinché il lipide si diffonda uniformemente attraverso la soluzione. Successivamente, ritirare lentamente l'elettrolita fino a quando la superficie della soluzione non è inferiore al QNM e quindi aggiungere lentamente abbastanza elettrolita per sollevare la soluzione al di sopra del QNM per formare la membrana isolante dei due strati lipidici. Se il bistrato non si forma dopo tre tentativi, applicare un'altra porzione di lipidi come descritto in precedenza e ripetere il processo.
Una volta che il bistrato sembra aver formato, aumentare la pressione al capillare per far scoppiare il bistrato e quindi riformarlo abbassando lentamente e alzando il livello della soluzione nello stesso modo di prima. Ripetere questo processo più volte per assicurarsi che il QNM non sia intasato e che si sia formato un bistrato. Successivamente, scongelare un'aliquota di proteina alfa emolisina sul ghiaccio o a temperatura ambiente.
Riempire il serbatoio con 250 nanogrammi di proteina monomerica alfa emolisina e circa 250 microlitri di acqua ultrapura. Quindi, applicare una distorsione da 200 a 400 millivolt per indurre la formazione dei pori. Per facilitare la formazione dei pori, aumentare la pressione capillare di 40-200 millimetri di mercurio per espandere il bistrato dal QNM.
Una volta che un nanopore si forma, ridurre la distorsione applicata alla tensione di misura e ridurre la pressione a circa la metà della pressione di inserimento. Per iniziare il test, regolare la tensione di offset CC per assicurarsi che non vi sia corrente misurata quando il potenziale applicato è impostato su zero. Successivamente, acquisire una traccia di corrente ionica per un potenziale applicato da 120 a -120 millivolt rispetto al serbatoio.
Confermare che non ci sono contaminanti, che sarebbero indicati da blocchi spontanei della corrente. Aggiungere uno o sei microlitri di pH 5,5 soluzione a grappolo POM bimolare al serbatoio. Applicare misurazioni della serie temporali di corrente ionica a una tensione applicata di 120 millivolt negativi.
Il movimento delle singole molecole di acido fosfotungstico anionico attraverso il canale alfa emolisina ha prodotto blocchi transitori che hanno diminuito la corrente ionica media a poro aperto di circa l'80%La durata e la corrente di blocco sono entrambe direttamente correlate all'interazione particella-poro, permettendo alle specie ioniche di essere differenziate negli istogrammi dei rapporti di profondità di blocco relativi. A pH 5,5, sono stati osservati due picchi con rapporti di profondità di circa 0,06 e 0,16. Basato sulla NMR al fosforo, il picco minore era la specie fosfotungsta a sei meno e il picco maggiore era la specie a sette meno.
A pH 7,5, le concentrazioni relative si spostarono verso un rapporto più elevato tra la specie 6-minus e la specie a sette meno. La diminuzione di 20 volte degli eventi di blocco rispetto al pH 5,5 è stata attribuita alla degradazione agli ioni fosfato e tungsta liberi. Adattare le distribuzioni tempo di residenza richiedeva molteplici funzioni esponenziali, indicando più tipi di interazioni particella-pori all'interno di ogni specie ionica.
I tempi di soggiorno più brevi a pH 7,5 suggerivano interazioni particella-pori più deboli rispetto al pH 5,5, coerentemente con studi precedenti che mostravano variazioni dipendenti dal pH nel numero relativo di cariche fisse nel lume del canale alfa emolisina o vicino ad esso. L'acqua deionizzata ad alta purezza è fondamentale per questo particolare set-up. Una cartuccia filtrante organica spesa è stata la probabile causa dell'incapacità del nostro laboratorio di formare membrane sui QMM per mesi.
Gli individui nuovi di questa particolare versione del metodo potrebbero anche lottare perché le membrane sono così piccole e c'è un trucco per far formare i nanopori. Questo metodo, iniziato diversi decenni fa, si è dimostrato utile per analizzare ioni, acidi nucleici e polimeri sintetici, nonché il sequenziamento del DNA. Potrebbe anche trovare applicazioni in biofisica e biologia cellulare di base.
Ad esempio, questa procedura può essere utilizzata per studiare le proprietà fisiche dei polimeri sintetici e dei biopolimeri per studiarne le dimensioni, le interazioni con altre molecole e altre questioni importanti.
